Для изучения возможности включения в состав лечебных биополимерных пленок препаратов, обладающих антибактериальной активностью в отношении облигатно-анаэробной и микроаэрофильной бактериальной флоры полости рта, проведено исследование чувствительности нескольких вариантов биополимерных пленок из диплена с антибактериальными компонентами разной направленности: бацитрацин (антибиотик для местного применения с преимущественным действием на грамположительные микроорганизмы), метронидазол (стандартный противоанаэробный препарат из группы имидазолов с высокой активностью по отношению к грамотрицательным анаэробам), орнидазол (производное имидазолов с расширенным спектром действия на анаэробные и микроаэрофильные виды бактерий).
Для оценки антибактериальной активности экспериментальных биополимерных пленок с антибактериальными компонентами использовали модифицированный диско-диффузионный метод и модифицированный микрокассетный метод. Из исследуемых пленок нарезали диски диаметром 5 мм. Далее на чашки Петри с 5% кровяным гемин-агаром выполняли посев сплошным газоном (по стандарту Кирби—Бауэра). Затем экспериментальные диски накладывали на засеянные чашки Петри и инкубировали в термостате при 37 °С для аэробных штаммов — в течение 2 сут, для анаэробных — до 7 сут в анаэростате с бескислородной газовой смесью 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа.
В качестве тест-культур использовали 2 музейных штамма и 4 клинических изолята, полученные от пациентов с пародонтальной инфекцией в нашем исследовании (Cli.Iz) в том числе: грамположительных видов — Staphylococcus aureus P 209, Enterococcus faecalis Cli.Iz, Streptococcus sanguis Cli.Iz, грамотрицательных видов — E. coli 756, Prevotella intermedia Cli.Iz, Fusobacterium nucleatum Cli.Iz.
Учет результатов проводили с помощью специальной линейки путем замера взаимно-перпендикулярных диаметров зоны торможения роста и выражали в мм.
При использовании модифицированного микрокассетного метода исследуемые препараты в дозе 0,05 мг/см2, заключенные в медицинские двухслойные самоклеящиеся пленки диплен-дента, растворяли в течение 60 мин при температуре 37 °С, постоянно перемешивая на шюттель-аппарате. Раствор готовили на основе 0,5 мM фосфатно-солевого буфера, рН 7,4, из расчета 20 см2 дипленовой пленки с препаратом (т.е. 1,0 г активного вещества) в 20 мл буферного раствора.
Затем удаляли надосадочную жидкость, которую в дальнейшем использовали в качестве рабочего раствора. Концентрация рабочего раствора соответственно составляла 0,5% или 0,5 мг в 1 мл. В качестве контроля использовали дипленовые пленки без препарата, растворенные аналогичным образом. Из рабочего раствора готовили разведения по стандартной методике стерильным 0,5 мM фосфатным буфером и получали концентрации 0,1%, 0,05%, 0,01%, 0,005%, содержащие 100, 50, 10 и 5 мкг в 1 мл раствора соответственно.
Растворы разных концентраций помещали в лунки пластиковых кассет, которые для проведения эксперимента заливали расплавленным 5% кровяным гемин-агаром (группа крови I — ABО) и использовали для посева тест-культур в количестве 106 КОЕ/мл по оптическому стандарту мутности. Чашки Петри с засеянными кассетами инкубировали в анаэростате в течение 3 сут при 37 °С в анаэростате с бескислородной газовой смесью 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа.
Учет результатов (наличие или отсутствие роста микроколоний) проводили на лабораторном стереомикроскопе Epics (Япония).
Результаты. При сравнении результатов тестирования штаммов факультативно- и облигатно-анаэробных бактерий к полимерным пленкам, содержащим антибактериальные компоненты разной направленности, бацитрацин (антибиотик для местного применения с преимущественным действием на грамположительные микроорганизмы), метронидазол (стандартный противоанаэробный препарат из группы имидазолов с высокой активностью по отношению к грамотрицательным анаэробам), орнидазол (производное имидазолов с расширенным спектром действия на анаэробные и микроаэрофильные виды бактерий), установлено, что перечисленные тест-культуры существенно различались по своей чувствительности к рассматриваемым препаратам в зависимости от вида препарата и концентрации активного антимикробного компонента.
При оценке торможения роста микробных культур модифицированным методом дисков диаметр зон при использовании дипленовых дисков с бацитрацином составил 22,6±0,2; 25,6±0,2 и 18,6±0,2 мм для тест-штаммов грамположительных бактерий Staphylococcus aureus P209, Streptococcus sanguis, Enterococcus faecalis соответственно. Полученные штаммы можно трактовать как умеренно выраженную чувствительность данных штаммов к бацитрацину (табл. 1).
Низкая чувствительность выявлена у штамма облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий — Fusobacterium nucleatum (11,8±0,2 мм). У двух других штаммов грамотрицательных бактерий Escherichia coli и облигатно-анаэробного Prevotella intermedia зоны торможения роста культур не выявлялись или чуть превышали диаметр диска, что можно считать артефактом.
Пленка с производными имидазола, напротив, не действовала на факультативно-анаэробные штаммы кокков и кишечную палочку, но давала существенное торможение роста облигатно-анаэробных штаммов. Чувствительность к орнидазолу у штаммов Prevotella intermedia и Fusobacterium nucleatum была несколько выше (диапазон от 17,0 до 21,8 мм), чем к метронидазолу (диапазон от 15,5 до 18,2 мм).
Экспериментальная комбинированная пленка, содержащая бацитрацин и орнидазол, показала хороший результат, так как перекрывала по спектру действия и грамположительные, и грамотрицательные, в том числе, облигатно-анаэробные виды бактерий. Диапазон зон торможения роста в зависимости от штамма составил от 16,3 до 25,8 мм, что следует трактовать как умеренную чувствительность к данной лекарственной форме.
Вторую часть эксперимента составляло тестирование растворов, полученных из дипленовых пленок с разными компонентами (бацитрацин, метронидазол, орнидазол) и смесью (бацитрацин с орнидазолом) для оценки минимальной подавляющей концентрации с помощью кассетного метода определения чувствительности (табл. 2).
Как и следовало ожидать, пленка с бацитрацином оказывала бактерицидный эффект на рост тест-штаммов грамположительных бактерий — Staphylococcus aureus P 209, Streptococcus sanguinis, Enterococcus faecalis, но практически не оказывала ингибирующего действия на грамотрицательные, в том числе, облигатно-анаэробные виды бактерий в диапазоне концентраций от 0,01 до 1,0% (т.е. даже в виде исходного рабочего раствора с концентрацией 1000 мкг/мл).
Пленки с метронидазолом и орнидазолом, напротив были активны в отношении облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий в концентрации 0,005—0,05% (Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum из числа грамотрицательных), но не действовали на тест-штамм E. coli, а также тест-штаммы других факультативных анаэробов (Staphylococcus aureus P 209, Streptococcus sanguinis, Enterococcus faecalis).
Полученные результаты позволили обосновать положение о необходимости сочетания в дипленовой пленке препаратов разного спектра действия. Учитывая это, производителем была изготовлена пленка, содержащая комбинацию бацитрацина и орнидазола. Применение кассетного метода определения чувствительности позволило нам уточнить минимальные подавляющие концентрации препаратов в отношении выбранных штаммов. Более выраженное антибактериальное действие как в отношении грамположительной, так и грамотрицательной микрофлоры отмечено у пленок с бацитрацином и орнидазолом в концентрациях от 0,005 до 0,05% раствора. Наиболее чувствительными оказались штаммы Streptococcus sanguinis и Fusobacterium nucleatum, ингибирование роста которых наблюдалось уже под действием 0,005% раствора (5 мкг/мл). Prevotella intermedia, Staphylococcus aureus P 209, Enterococcus faecalis ингибировал 0,01% раствор (10 мкг/мл). Наиболее устойчивым оказался тест-штамм E. coli, для торможения роста которого требовалась 0,1% раствора, содержащего оба препарата (100 мкг/мл).
Полученные нами данные в целом согласуются с результатами исследований других отечественных и зарубежных авторов в отношении антибактериальных свойств пептидных антибиотиков (грамицидина, полимиксина, бацитрацина) и производных нитроимидазола (метронидазол, нитазол, тинидазол, орнидазол).
Вывод. Проведенные исследования подтверждают наличие у исследуемых экспериментальных лекарственных форм на основе биополимерной пленки «Диплен» антибактериальной активности, направленность и спектр которой отличаются у разных исследованных компонентов в отношении факультативно- и облигатно-анаэробной флоры полости рта. Это позволило нам обосновать целесообразность создания комбинированной пленки, содержащей полипептидный антибиотик бацитрацин и противоанаэробный химиопрепарат из группы нитроимидазолов — орнидазол. Антибактериальная активность у экспериментальных комбинированных пленок, содержащих бацитрацин и орнидазол, отмечается преимущественно в концентрациях 0,005—0,1% растворов (т.е. в диапазоне от 5 до 50 мкг/мл), однако для некоторых штаммов (кишечная палочка) эффект наблюдали при концентрации 0,1% (100 мкг/мл). Такой активности может быть недостаточно при использовании препаратов в полости рта (из-за разведения ротовой жидкостью и связывания муцином слюны). По-видимому, целесообразно увеличить концентрацию антибактериального компонента бацитрацина, как минимум в 2 раза (до 0,1 мг/см2).