Как известно, в полости рта содержатся различные виды грибов рода Candida spp. Кандидозный стоматит нередко развивается у лиц, пользующихся зубными протезами, чаще съемными протезами из акриловой пластмассы. В 30% случаев на слизистых оболочках протезного ложа и прилегающей поверхности съемного протеза обнаруживается Candida albicans. Гриб развивается в кислой среде (рН 5,8—6,5), продуцирует многочисленные ферменты и расщепляет белки, углеводы, жиры, кератин. Он оказывает разрушающее действие на пластмассу, выделяя органические кислоты: лимонную, щавелевую, янтарную, уксусную, молочную и т.д. При старении пластмассы, когда изменяются ее физико-химические свойства, создаются условия для наилучшего развития грибов.
Вместе с тем, нельзя сбрасывать со счета и бактериальную микрофлору полости рта, которая играет существенную роль в развитии инфекционно-воспалительных процессов слизистой оболочки полости рта и при устранении грибкового фактора может «занять» освободившуюся нишу и вызвать обострение воспалительного процесса, но уже с участием бактерий. С другой стороны активное применение антибактериальных препаратов нередко создает условие для формирования дисбиоза полости рта и активизации грибов.
Нельзя сбрасывать со счета и одномоментное поражение слизистой оболочки полости рта грибами и бактериями, что требует проведения комбинированной антимикробной терапии.
В России широко используются двухслойные адгезивные пленки диплен-дента с различными антимикробными компонентами (хлоргексидином, линкомицином, метронидазолом и др.), которые применяются в лечении воспалительно-инфекционных заболеваний пародонта, профилактике послеоперационных воспалительных осложнений (Ушаков Р.В. и соавт., 2001), при различных травматических поражениях слизистой оболочки (Ушаков Р.В. и соавт., 2002).
Преимущество применения пленок диплен-дента в профилактике и лечении различных патологических состояний заключается в: а) антимикробное воздействие производится на ограниченном участке (участках) слизистой оболочки полости рта, десне, пародонтальном кармане и др., б) пролонгированное действие с сохранением концентрации препаратов, в) предохранение поврежденных участков слизистой оболочки от внешних воздействий, инфицирования и реинфицирования, г) нет эффекта «разбавления» препарата ротовой жидкостью, д) существенно меньшее влияние на микробиоценоз полости рта.
Цель исследования — разработка адгезивной двухслойной пленки с комбинированной антибактериальной и фунгицидной активностью, которая может применяться в лечении и профилактике развития смешанных кандидо-бактериальных поражений слизистой оболочки рта.
Материал и методы. При изучении фунгицидной активности препаратов для местного применения были использованы 4 референтных (музейных) штаммов грибов кандида разных видов (Candida albicans NCTC 885-653, Candida stellatoidea ATCC 10264, Candida krusei Harvard ATCC 6259, Candida tropicalis ВКПГУ — 548/ВКМУ-1004) и 6 клинических изолятов.
Среди клинических изолятов, выделенных у обследованных больных, 4 идентифицированы как Candida albicans, Candida krusei. Для уточнения результатов идентификации проведена оценка биохимических свойств в пестром ряду Гисса с применением индикатора бромтимолового синего. Поскольку наиболее частой причиной «протезных» стоматитов является вид C. albicans, мы прежде всего провели исследование чувствительности штаммов данного вида (1 — референтный и 5 — клинических изолятов). Различия в диаметре зон торможения роста культур грибов для разных штаммов не превышали 1—2 мм.
У всех исследуемых препаратов выявлена фунгицидная активность в отношении данных штаммов дрожжеподобных грибов. Однако степень чувствительности культур к разным препаратам существенно отличалась.
При регистрации результатов установлено, что наиболее выраженная чувствительность дрожжеподобных грибов данного вида была к препаратам — производным группы кетоканазола — зоны торможения роста составляли от 24,4±0,2 мм (для итраконазола) до 33,6±0,4 мм (для флюконазола). Во всех случаях диаметр зон торможения роста был достоверно выше (р<0,05), чем у нистатина (14,2±0,3 мм). Наиболее выраженная противогрибковая активность отмечена нами у флюконазола. Следующим этапом нашей работы было определение минимальных подавляющих концентраций (МПК) препаратов, которые могут быть включены в состав лекарственных форм для местного применения. Данное исследование проводили с помощью кассетного микрометода. В качестве тест-штаммов использовали все перечисленные выше штаммы, относящиеся к видам C. albicans, C. stellatoidea, C. krusei, C. tropicalis.
Данные, полученные с помощью кассетного микрометода, подтверждают, что флюконазол обладает наиболее выраженной фунгицидной активностью в диапазоне от 0,5 до 30 мкг/мл, причем большая часть штаммов (виды C. albicans, C. stellatoidea, C. tropicalis) чувствительны к крайне малым концентрациям препарата — 0,25—0,5 мкг/мл. Только два штамма C. krusei обладали более низкой чувствительностью — 30,0 мкг/мл.
Чувствительность исследуемых штаммов дрожжеподобных грибов к итраконазолу была несколько ниже. Так, большинство штаммов (виды C. albicans, C. stellatoidea, C. tropicalis) проявляли чувствительность к концентрации 1,5±0,2 (р<0,05 по сравнению с флюконазолом), а C. krusei были еще более устойчивы и погибали только при концентрации 50 мкг/мл.
Поэтому, по результатам изучения противогрибковой активности с целью создания лекарственной формы для местного применения, выбор был сделан в сторону флюконазола.
Для выбора антибактериального компонента пленки было проведено сравнительное изучение антимикробного препарата группы бигуанидов хлоргексидина биглюконата и детергентов миристамидопропилдиметилбензила аммония хлорида, цитилпиридина хлорида на микрофлору полости рта и возможность их совместного применения с флюконазолом в составе биорезорбируемой адгезивной пленки диплен-дента.
Как следует из полученных нами данных в отношении грамположительных штаммов бактерий факультативно-анаэробной и аэробной группы получены следующие результаты: активность мирамистина была наименьшей среди сравниваемых препаратов и составляла от 40 до 100 мг/л, причем наиболее чувствительными были S. mutans. В два раза менее чувствительными к препарату были другие кариесогенные виды — S. sanguis и A. naeslundii (80 мг/л). Цитилпиридина хлорид и хлоргексидина биглюконат обладали наибольшей активностью в отношении кариесогенных стрептококков (от 20 до 40 мг/л) и актиномицетов (от 30 до 40 мг/л), причем активность хлоргексидина была несколько выше, чем цитилпиридин хлорида.
Значительно более устойчивыми к антибактериальному действию антисептиков оказались штаммы дрожжеподобных грибов — Candida albicans и C. kruseii. Активность мирамистина была в 2—4 раза ниже, чем цитилпиридина хлорида и хлоргексидина биглюконата.
В отношении грамотрицательных бактерий факультативно-анаэробной и аэробной группы — тест-штаммов кишечной и синегнойной палочек — получены сходные результаты. Активность мирамистина была наименьшей и вызывала гибель штаммов кишечной и синегнойной палочек в концентрации 80 мг/л. Более высокой была чувствительность этих штаммов к цитилпиридина хлориду и хлоргексидина биглюконату, которые проявляли свое бактерицидное действие в концентрациях 40—30 и 30 мг/л соответственно. Облигатно-анаэробные бактерии были высоко чувствительны ко всем используемым антисептикам. Так, мирамистин был активен в диапазоне от 30 до 80 мг/л, цитилпиридина хлорид — от 20 до 40 мг/л, хлоргексидина биглюконат вызывал гибель бактерий в узком диапазоне от 10 до 20 мг/л. Наиболее устойчивыми к действию антисептических препаратов были штаммы Streptococcus intermedius (80 мг/л к мирамистину) и пигментообразующие Porphyromonas gingivalis (80 мг/л к мирамистину).
Более активными были цитилпиридина хлорид и хлоргексидина биглюконат, которые проявляли свое бактерицидное действие в отношении штаммов анаэробных бактерий в концентрациях 20—40 и 10—20 мг/л соответственно.
Таким образом, цитилпиридина хлорид и хлоргексидина биглюконат показали практически одинаковую активность в отношении бактериальной микрофлоры полости рта. Однако по органолептическим свойствам хлоргексидин уступает цитилпиридину, кроме этого известно, что при длительном применении хлоргексидина возможно изменение цвета зубов и слизистой оболочки полости рта. В связи с этим, использование цитилпиридина хлорида нам представляется более перспективным.
На следующем этапе исследования нами проведено сравнительное изучение влияния пленок диплен-дента с хлоргексидином и пленок диплен-дента только с цетилпиридином, диплен-дента только с флюконазолом и диплен-дента с цетилпиридином и флюконазолом на отдельных представителей микроорганизмов полости рта и на смешанную культуру микроорганизмов методом дисков. Для этого из пленок были изготовлены диски диаметром 0,5 см. Концентрации препаратов в пленках соответствовали 0,05 мг на см2.
В качестве тест-штаммов были использованы клинические штаммы Prevotella melaninogenica, Streptococcus intermedius, Fusobacterium nucleatum, Candida albicans, Streptococcus spp., а также смешанные культуры микроорганизмов, полученные у пациентов с заболеваниями пародонта. Установлено, что пленка, содержащая два антимикробных компонента (цетилпиридин и флюконазол), была активна в отношении изученных микроорганизмов. Наибольшие отличия отмечались в отношении Candida albicans, Streptococcus spp. (диметр отсутствия роста для комбинированной пленки составлял 18—22 мм). Еще более выраженные отличия были получены на примере смешанной микрофлоры.
Вывод. Полученные данные свидетельствуют о комбинированном действии пленки диплен-дента с цетилпиридином и флюконазолом, что позволяет считать перспективными работы по клиническому изучению и внедрению такого средства в стоматологическую практику для лечения кандидоза полости рта.