Заживление хирургической раны слизистой оболочки полости рта под влиянием применения рекомбинантного эпидермального фактора роста в эксперименте

Факторы роста при лечении ран

Травма слизистой оболочки полости рта является распространенной причиной обращения за стоматологической помощью. Ее возникновение обусловлено различными причинами: хирургическими вмешательствами, ожогами и повреждениями при местном применении лекарственных препаратов; нарушением целостности слизистой оболочки в период адаптации к съемным протезам; механическим воздействием на десну и слизистую оболочку во время препарирования зубов, краем искусственной коронки и др. Негативные особенности заживления подобных ран обусловлены наличием в полости рта разнообразной микробной флоры, постоянной механической и термической нагрузкой на ткани этой локализации и высокой специфичностью их гистологического строения [9]. Несмотря на различную этиологию поражений, общим принципом лечения таких пациентов в стоматологической клинике является применение средств, направленных на регенеративные процессы в тканях [3]. Учитывая, что регенерация тканей представляет собой четко регулируемый каскадный и многокомпонентный морфофункциональный процесс, обеспечиваемый сложными кооперативными межклеточными взаимодействиями, представляет интерес поиск препаратов, применение которых обеспечило бы наилучший результат регенерации слизистой оболочки полости рта [4, 7]. Получение рекомбинантного эпидермального фактора роста (РЭФР) и его экспериментальное испытание на моделях регенерации эпидермиса явилось мощным толчком к развитию этого направления. РЭФР не обладает видовой специфичностью, т.е. функционирует у животных различных видов. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) специфически связывается с рецепторами на поверхности клеточных мембран, стимулируя тем самым пролиферацию, таксис и дифференциацию клеток, что способствует быстрому и качественному заживлению ран [5, 10]. Этот фактор управляет ростом клеток эпителия, эндотелия и фибробластов, регулирует их хемотаксис [2]. При повреждениях в полости раны количество рецепторов к ЭФР возрастает [6]. Это вызывает перемещение клеток из здоровых неповрежденных тканей в пораженные участки [1, 8]. Эффективность отечественного РЭФР для оптимизации заживления ран слизистой оболочки полости рта еще не была изучена в эксперименте. Сейчас РЭФР проходит экспериментальную проверку, по итогам которой может быть рекомендован в качестве специфического стимулятора заживления ран на слизистой оболочке полости рта.

Целью настоящей работы явилось экспериментальное обоснование применения РЭФР для оптимизации заживления повреждений слизистой оболочки полости рта.

Материал и методы

ЭФР относится к группе факторов роста (цитокины) и является полипептидом, состоящим из 53 аминокислот, его молекулярная масса 6021 Д. Фактор устойчив к действию кислот и высоких температур. Относится к наиболее стабильным из всех изученных белков. ЭФР играет значительную роль в регуляции обменных и восстановительных процессов, присутствуя в клетках всех тканей организма и регулируя рост клеток. Стимулирует таксис противовоспалительных клеток, что способствует быстрому и качественному заживлению ран.

Эксперимент выполнен на 36 белых крысах линии Вистар, массой 220-280 г. Под наркозом (Zoletil 50, «Vibrac», Франция) животным наносили круглые раны диаметром 5 мм на твердом небе до кости. Кровотечение останавливали гемостатической губкой. Животных были разделены на 3 группы по 12 крыс в каждой. В 1-й группе животные постоянно получали чистую питьевую воду; во 2-й группе животным давали воду с РЭФР в концентрации 100 мкг/мл; в 3-й группе животные получали воду с РЭФР в концентрации 500 мкг/мл. Растворы для питья готовили ежедневно, хранили при температуре –40°С. Воду с РЭФР животные 2-й и 3-й групп получали с 9 до 18 ч, в остальное время крысы пили обычную водопроводную воду, потребляли одинаковое количество жидкости, получали сбалансированный брикетированный корм. Из эксперимента животных выводили на 3, 7, 14 и 21-е сутки.

Выделяли верхнюю челюсть, фиксировали в 10% нейтральном формалине, декальцинировали в трилоне Б, заливали в целлоидин. Микропрепараты окрашивали гематоксилином и эозином, PAS-реакцией, азокармином, импрегнировали серебром. Динамику заживления ран оценивали планиметрически и патоморфологически, гистохимическую оценку репаративного процесса проводили по содержанию гликозаминогликанов, гликогена и нуклеиновых кислот.

РЭФР предоставлен ГНИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург). В России РЭФР синтезирован из E. сoli.

Результаты и обсуждение

В 1-й группе на 3-й день наблюдений диаметр раны у всех животных не отличался от первоначального в момент ее нанесения. Края раны ровные, на поверхности тонкий, мягкий струп из сохранивших жизнедеятельность лейкоцитов, склеенных плазмой. Центральная часть раны ограничена пластом многослойного эпителия. Дно дефекта образовано костной тканью твердого неба, покрытой утолщенной надкостницей (рис. 1).

Рисунок 1. Раневой дефект на 3-и сутки (1-я группа). Костная ткань на дне дефекта. Утолщенная надкостница. Окраска гематоксилином и эозином. ×200.

В самой кости и в надкостнице воспалительный процесс. Наряду с ним на границе дефекта с тканью отмечено начало репаративных процессов. На 7-е сутки область раны окружена пластом эпителия, внедряющимся под струп (рис. 2).

Рисунок 2. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 7-м суткам эксперимента (1-я группа). Наползающий пласт эпителия. Окраска гематоксилином и эозином. ×200.

Диаметр дефекта уменьшается за счет наползания пласта эпителия под струп. Под струпом на поверхности кости располагается утолщенная надкостница с клетками фибробластического ряда. В клетках регенерирующего эпителия гранулы гликогена, заполняющие цитоплазму новообразованных клеток (рис. 3).

Рисунок 3. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 7-м суткам эксперимента (1-я группа). Гликоген в наползающем пласте эпителия. Окраска: PAS-реакция. ×200.

По краю дефекта происходит образование грануляционной ткани, ее основная масса представлена фибробластами различной степени зрелости, макрофагами, отдельными сегментоядерными лейкоцитами и тонкими пучками коллагеновых волокон. Фибробласты заполняли саму зону дефекта, формируя поверх костной ткани грануляционную ткань, содержащую кровеносные капилляры, по которой шло напластование эпителия. На 14-е сутки сохранялся тонкий струп. Пласт эпителия продолжал свое движение к центру дефекта. В эпителии появлялись клетки с признаками паракератоза, что свидетельствует о дифференциации клеток. Гликогенсодержащие клетки располагались непосредственно на мигрирующем крае эпителиального пласта. По мере дифференциации эпителиоцитов глыбки гликогена в них исчезали. Наползание пласта эпителия шло по грануляционной ткани, в этот период отмечалось увеличение коллагеновых волокон, происходило восстановление соединительнотканной основы (рис. 4).

Рисунок 4. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 14-м суткам эксперимента (1-я группа). Новообразованные пучки коллагеновых волокон (синего цвета) в зоне дефекта. Окраска азокармином. ×200.

Незакрытым пластом эпителия оставался лишь центральный участок дефекта. На 21-е сутки зона дефекта во всех наблюдениях была перекрыта утолщенным эпителием с менее выраженным роговым слоем. Нижняя поверхность его имела ровную границу. Под эпителием волокнистая соединительная ткань, богатая фибробластами различной степени зрелости. Обнаруживаются кровеносные сосуды, заполненные форменными элементами. В двух случаях центр дефекта оставался незакрытым эпителием, что связано с воспалительным процессом. При этом на поверхности дефекта находился струп, и эпителизация шла под его поверхностью.

Во 2-й группе (РЭФР 100 мкг/мл) на 3-и сутки дефект покрыт эластичным струпом. Отмечается образование грануляционной ткани. По краям раны утолщенный пласт регенерирующего эпителия без ороговения, а в его клетках выявлялся гликоген (рис. 5).

Рисунок 5. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 3-м суткам эксперимента (2-я группа). Начало эпителизации. Наползание эпителия под струпом. В пласте эпителия содержится гликоген. Окраска: PAS-реакция. ×200.

Под струпом скопление фибробластов, макрофагов, лейкоцитов. Средняя часть дефекта заполнена рыхло расположенными лейкоцитами и макрофагами, а также фибробластами различной степени зрелости. Костная ткань покрыта утолщенной надкостницей, в составе которой обнаруживались остеобласты. В некоторых случаях отмечалось образование костной ткани. На 7-е сутки эксперимента по краю раны прогрессирующая эпителизация. Эпителиальный пласт утолщен, внедряется под струп, имеет ровную нижнюю поверхность. Толщина струпа неравномерна и варьировала в широких пределах. Эпителиальные сосочки отсутствовали.

В новообразованном эпителии гликоген в виде мелких глыбок (рис. 6).

Рисунок 6. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 7-м суткам эксперимента (2-я группа). Пласт новообразованного эпителия внедряется под расположенный на поверхности дефекта струп. В эпителии располагается гликоген. Окраска: PAS-реакция. ×200.

Под эпителием типичная грануляционная ткань с наличием капилляров и клеток: фибробластов, отдельных макрофагов, а ближе к центру дефекта располагались лейкоциты. Репаративные процессы шли от периферии к центру дефекта. Это относилось к образованию грануляционной ткани и процессу эпителизации дефекта. Сам процесс эпителизации происходил быстрее по сравнению с аналогичным сроком у животных 1-й группы. Это ускорение репаративных процессов относилось и к дифференциации новообразованного пласта эпителия. На 14-е сутки значительная часть дефекта была покрыта утолщенным пластом новообразованного эпителия. У одной из крыс отмечено полное перекрытие дефекта эпителием, характеризующимся выраженным роговым слоем (рис. 7).

Рисунок 7. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 14-м суткам эксперимента (2-я группа). Большая часть дефекта закрыта эпителием с явлением ороговения. Окраска гематоксилином и эозином. ×200.

Его поверхностную часть образовывали клетки с явлениями ороговения, и лишь клетки самой передней части эпителиального клина не имели признаков ороговения. В них обнаруживались скопления гликогена, которые сливались в однородную массу. Под эпителием располагалась грануляционная ткань с коллагеновыми и аргирофильными волокнами (рис. 8).

Рисунок 8. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 14-м суткам эксперимента (2-я группа). Коллагеновые и аргирофильные волокна в расположенной под эпителием ткани. Окраска: импрегнация серебром. ×400.

У остальных крыс большая часть дефекта покрыта новообразованным пластом эпителия. На 21-е сутки дефекты у всех крыс были эпителизированы. По краям раны структура эпителия была полностью восстановлена, сам пласт немного утолщен (рис. 9).

Рисунок 9. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 21-м суткам эксперимента (2-я группа). Область дефекта закрыта утолщенным пластом эпителия с наличием в клетках шиповатого слоя следов гликогена. Окраска: PAS-реакция. ×400.

Струпа на поверхности раны нет. Дифференциация эпителия шла от центра дефекта к его периферии. По периферии отмечалось полное восстановление структуры эпителиального пласта. Имело место восстановление рогового слоя и соединительнотканной основы, состоявшей из пучков коллагеновых волокон. Нижняя поверхность эпителиального пласта имела на большом протяжении сосочки, их появление шло от периферии дефекта к его центру.

В 3-й группе (РЭФР 500 мкг/мл) уже на 3-и сутки было отмечено наползание эпителия с краев дефекта, на поверхности которого располагался тонкий струп (рис. 10).

Рисунок 10. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 3-м суткам эксперимента (3-я группа). Наползание толстого пласта новообразованного эпителия. Эпителий внедряется под струп. Окраска гематоксилином и эозином. ×400.

Толщина и рост наползающего под струп новообразованного эпителия более интенсивны, чем в 1-й группе. Утолщение идет в основном за счет клеток шиповатого слоя. Под пластом новообразованного эпителия образовывалась грануляционная ткань, богатая фибробластами различной степени зрелости и макрофагами. Новообразованный эпителий имел толстый роговой слой, нижняя поверхность эпителия была неровная за счет образованных здесь эпителиальных сосочков. На 7-е сутки эпителизация дефекта в сравнении с 1-й группой была более интенсивной. Эпителий покрывал большую часть дефекта, имел довольно толстый роговой слой. Активно образовывалась волокнистая соединительная ткань. Струп большей частью отсутствовал, и в этих участках поверхность дефекта была перекрыта тонкой эластичной пленкой, состоящей из плазмы крови и отдельных лейкоцитов. Под пластом эпителия располагалась новообразованная соединительная ткань с пучками рыхло расположенных коллагеновых волокон, а также разнообразных клеточных элементов. Вся площадь дефекта заполнена волокнистой соединительной тканью, которая ниже новообразованного пласта эпителия срасталась с надкостницей. Кость имела строение, типичное для пластинчатой кости, на ее поверхности располагались остеобласты. В некоторых участках отмечались узуры, заполненные соединительной тканью. На 14-е сутки у всех крыс дефект перекрыт эпителием с выраженным роговым слоем (рис. 11).

Рисунок 11. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 14-м суткам эксперимента (3-я группа). Новообразованный пласт эпителия, перекрывающий зону травмы. На поверхности пласта четко виден роговой слой. Окраска гематоксилином и эозином. ×200.

На его поверхности располагались уплощенные роговые чешуйки, которые местами слущивались. Лишь в отдельных случаях в самом центре дефекта имелся утолщенный пласт эпителия. Скорость пролиферации эпителия заметно увеличивалась. Подлежащая соединительная ткань построена из волокнистых структур, изменяющих свое расположение. Часть из них располагалась параллельно пласту эпителия. Нижняя поверхность эпителия образовывала выросты или сосочки. Подлежащая костная ткань имела обычную структуру, характерную для пластинчатой кости. На 21-е сутки выявлена полная регенерация эпителия, восстановлена и структура эпителиального пласта. На всем протяжении на поверхности эпителия имело место восстановление рогового слоя (рис. 12).

Рисунок 12. Слизистая оболочка твердого неба на участке раны к 21-м суткам эксперимента (3-я группа). Новообразованный утолщенный пласт эпителия с выраженным роговым слоем. Коллагеновые волокна в подлежащей соединительной ткани. Окраска азокармином. ×400.

Роговые чешуйки плотно прилежат друг к другу. Сам роговой слой отличался от остальных слоев по окраске. Гликоген в новообразованном эпителии нигде не выявлялся. Нижняя поверхность эпителиального пласта имеет волнообразный вид за счет образовавшихся здесь эпителиальных сосочков. Соединительная ткань собственной пластинки слизистой оболочки содержала волокнистые структуры и клеточные элементы, главным образом фибробласты.

Таким образом, исследование установило благоприятное влияние применения РЭФР при заживлении ран слизистой оболочки полости рта. Анализ полученных данных показал, что наиболее оптимальной концентрацией препарата является 500 мкг/мл. Именно в этом случае происходит выраженное ускорение процесса эпителизации дефекта. В целом процесс репаративной регенерации осуществляется на базе одного и того же комплекса стереотипных реакций без проявления каких-либо новых их вариантов. Говоря о влиянии РЭФР, можно лишь отметить ускорение восстановительных процессов в слизистой оболочке неба у экспериментальных животных.

В целом результаты проведенного исследования показывают хорошую репаративную способность отечественного РЭФР, что может быть использовано в дальнейшем для его клинических испытаний.