МСММ — масс-спектрометрия микробных маркеров

ВДП — верхние дыхательные пути

Слизистые оболочки открытых полостей заселяет единая система микроорганизмов, живущих в этих оболочках в виде биопленки и обеспечивающих их колонизационную резистентность, способную защитить макроорганизм от патогенной флоры и развития воспаления [1]. Изучение микробной эндоэкологии человека позволяет несколько иначе взглянуть на микробиоту верхних дыхательных путей (ВДП) у детей. Это связано, в частности, с влиянием многих факторов окружающей среды, характерных для современной цивилизации, на здоровье человека. Они привели к трансформации в эволюционно выработанной системе взаимоотношений между организмом хозяина и его микробиотой [2]. Сегодня уже доказано, что изменение взаимосвязи между составом кишечной микробиоты и организмом хозяина сопровождается развитием иммунопатологических состояний и ряда заболеваний, таких как различные виды рака, ожирение, воспалительные заболевания кишечника [3].

Заселяющая макроорганизм микробиота выполняет ряд жизненно важных функций по поддержанию организма хозяина в здоровом состоянии. Основа положительного влияния микробиоты на здоровье человека — ее симбиотическая взаимосвязь с макроорганизмом. Роль хозяина заключается в обеспечении микробиоты стабильной средой обитания и питательными веществами. Микробиота же в свою очередь не только снабжает организм хозяина питательными компонентами и защищает его от патогенных возбудителей, но и способствует формированию и поддержанию адекватного иммунного ответа на протяжении всей жизни [3]. Один из первых микробиоценозов формируется в носоглотке сразу после рождения ребенка.

Слизистая оболочка носоглотки с присущей ей микрофлорой образуют единую экосистему — микробный биотоп, или микробиоту, носоглотки, в которой слизистая оболочка контролирует микрофлору, а микрофлора оказывает воздействие на состояние слизистой оболочки [4]. Ключевую роль в этом взаимодействии играет глоточная миндалина: она участвует в формировании адаптивного иммунитета, «воспитывая» эффекторные клетки памяти [5]. В то же время микробиота носоглотки является весьма чувствительной интегральной системой, способной реагировать качественными и количественными изменениями не только на различные физиологические и патологические сдвиги в состоянии макроорганизма, но и на изменения окружающей среды.

Применение современных молекулярных методов исследования состава различных биотопов позволяет выявить труднокультивируемые микроорганизмы. Однако для адекватной оценки результатов этих исследований требуется тщательное изучение как патологических биотопов — биопленок, так и микробиоты носоглотки у здоровых детей [6—8]. В носоглотке в физиологических условиях находятся сотни микроорганизмов. Большую их часть составляют бактерии (аэробы и анаэробы), меньшую — вирусы и грибы [9]. Из-за трудности выявления анаэробная флора редко учитывается в клинической практике, что, возможно, способствует рецидивирующему течению инфекционных заболеваний ВДП.

При оценке микроэкологии слизистой оболочки ВДП зачастую невозможно провести четкую границу между сапрофитной и патогенной флорой. На практике необходимо учитывать не только родовую и видовую принадлежность выделенного микроорганизма, но и в ряде случаев патогенный потенциал штамма, степень обсемененности им клинического материала, а также микробные ассоциации исследуемого биотопа [7].

В изысканиях I. Brook и соавт. продемонстрировано, что у здоровых детей и детей с патологией глоточной миндалины на слизистой оболочке носоглотки и в полости носа определяется как аэробная, так и анаэробная флора, не отличающаяся по своему качественному составу от состава микробиоты здоровых детей. Однако у здоровых детей численность условно-патогенных микроорганизмов была достоверно ниже. Кроме того, авторами доказано присутствие в носоглотке здоровых детей таких микроорганизмов, как гемолитические и негемолитические стрептококки, микрококки, эпидермальные стафилококки, нейссерии, дифтероиды, псевдодифтерийные бактерии, вейлонеллы, бактероиды, актиномицеты, сапрофитические трепонемы, микоплазмы [8]. Тем не менее роль этих микроорганизмов в этиологии воспалительных заболеваний носоглотки до конца не ясна. Спорным остается и вопрос о значении этой микрофлоры у здоровых детей, не страдающих хроническим аденоидитом [10].

Цель работы — охарактеризовать видовую структуру микробиоты носоглотки здоровых детей разных возрастных групп по результатам масс-спектрометрии микробных маркеров.

Обследовано 90 детей в возрасте от 3 до 12 лет, поступивших в Красноярскую межрайонную детскую больницу и детское хирургическое отделение городской больницы № 20 Красноярска на плановые операции (грыжесечение, орхипексия) в 2008—2017 гг. От всех родителей было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании. Всем пациентам проводились углубленное клиническое и параклинические обследования (общий анализ крови, иммунологическое исследование крови, передняя активная риноманометрия, пульсоксиметрия), а также исследование микробиоты носоглотки с использованием метода масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ).

Критерии включения в исследование: отсутствие клинических проявлений хронического аденоидита и антибиотикотерапии в анамнезе не менее 3 мес, подписанное родителями информированное согласие на участие в клиническом исследовании.

Критерии исключения: дети с симптомами воспалительных заболеваний ВДП, тяжелой соматической патологией (сердечно-сосудистой системы, органов кроветворения, заболеваний почек и др.), которые могут повлиять на результаты исследования; отказ родителей от участия в клиническом исследовании.

Все пациенты были разделены на три возрастные группы, соответствующие 3 периодам развития иммунитета. В 1-ю группу вошли дети 3—5 лет, во 2-ю — 6—7 лет, в 3-ю — 8—12 лет [10].

Для изучения микробной эндоэкологии полости носа и носоглотки проводилось исследование соскоба из глубоких отделов носа методом МСММ. Соскоб забирали сухими стерильными щеточками в силиконовом футляре (зонд одноразовый стерильный Эндобраш). Сначала щеточка вводилась легким движением по общему носовому ходу до носоглотки. Затем силиконовый футляр сдвигался, щеточкой выполнялось вращательное движение, после чего она возвращалась в футляр и удалялась через общий носовой ход. Щеточка без футляра погружалась в стерильную пробирку и плотно закрывалась пробкой. Материал в течение 1—4 ч доставлялся в лабораторию.

Метод МСММ позволяет в ускоренном режиме, минуя стадию культивирования и тестовых ферментаций, определить спектр доминирующих микроорганизмов (более 10⁴ клеток в пробе) по молекулярным маркерам — клеточным высшим жирным кислотам, альдегидам и стеринам [7].

Суть анализа состоит в прямом извлечении с помощью ряда химических реакций высших жирных кислот из подлежащего исследованию образца, их разделении на газовом хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализе состава в динамическом режиме на масс-спектрометре. Хроматограф соединен в едином приборе с масс-спектрометром и снабжен компьютером с программами анализа и обработки данных. Сам процесс анализа занимает 30 мин, а с учетом времени подготовки проб и расчета данных — не более 2,5 ч.

Первоначально исследование было определено как описательное, что соответствует однократно обследуемым группам пациентов и оценке видового распределения микроорганизмов в зависимости от возраста и эффективности диагностики. Для обеспечения достоверности результатов исследования статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием программ Microsoft Office Excel версии 7.0, Statistica 7.0. Нормальность распределения определялась по критерию Шапиро—Уилка. Оценка достоверности отличий производилась по t-критерию Стьюдента.

При помощи метода МСММ удалось установить по мазкам, извлеченным из глубоких отделов носа, наличие маркеров микроорганизмов, принадлежащих к 45 таксонам (см. таблицу).

При анализе средних значений в младшей возрастной группе определялась минимальная колонизация микробами при наименьшем разнообразии видов в слизистой оболочке. В то же время именно для этой группы были обнаружены маркеры микроорганизмов, встречающихся у отдельных детей (10%). Среди них присутствовали аэробы Streptococcus spp., Str. pneumoniae, Moraxella cat., Nocardia, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes, Rhodococcus, Corineform CDC-group XX, Staphylococcus, Nocardia asteroids и анаэробы Clostridium propionicum, Lactobacillus, Cl. difficile, Prevotella, Eubacterium/Cl. coccoides, Bifidobacterium, Clostridium perfringens, Eubacterium, Propionibacterium/Cl. subterminale, Propionibacterium acnes, Ruminicoccus, Actinomycetes 10Me14, Actinomyces viscosus, Propionibacterium jensenii. У 24 (80%) детей из этой же группы определялись грибы актиномицеты, Pseudonocardia, Streptomyces, Mycobacterium/Candida и вирус Herpes.

Как оказалось, наибольшее общее число микроорганизмов и их значительное разнообразие было характерно для пациентов 2-й возрастной группы, когда глоточная миндалина является «вакцинной лабораторией» и оказывает существенное влияние на формирование адаптивного иммунитета [5]. При этом среди аэробов определялись Streptococcus sрp., Bacillus cereus, Str. pneumoniae, Moraxella cat., Nocardia, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes, Rhodococcus, Corineform CDC-group XX, Staphylococcus, Helicobacter pylori, h18; Enterococcus, Nocardia asteroides, а среди анаэробов — Peptostreptococcus anaerobius, Porphyromonas, Lactobacillus, Cl. difficile, Prevotella, Eubacterium/Cl. Coccoides, Clostridium perfringens, Eubacterium, Propionibacterium/Cl. Subterminale, Ruminicoccus, Actinomycetes 10Me14, Actinomyces viscosus.

Интересно, что у детей 3-й возрастной группы было выявлено большое разнообразие микроорганизмов при сравнительно незначительном их общем количестве. Среди них встречались аэробы Streptococcus spp., Bacillus cereus, Str. pneumoniae, Bacillus megaterium, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes, Rhodococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Nocardia asteroides и анаэробы Peptostreptococcus anaerobius, Clostridium propionicum, Selenomonas, Lactobacillus, Prevotella, Eubacterium/Cl. coccoides, Clostridium perfringens, Eubacterium, Propionibacterium/Cl. subterminale, Propionibacterium acnes, Ruminicoccus, Actinomyces viscosus, Propionibacterium jensenii. К тому же у всех детей этой группы определялись грибы актиномицеты, Pseudonocardia, Streptomyces, Rhodococcus, Mycobacterium/Candida и вирус Herpes.

В каждой группе присутствовали пациенты, у которых выявлялись Clostridium ramosum, однако у большинства обследуемых они отсутствовали. Дело в том, что у детей без клинических признаков воспаления ВДП имеет место полимикробный состав микробиоты (45 видов аэробов, анаэробов, актинобактерий грибов и вирусов из исследуемых 56 таксонов). Данный факт можно объяснить сукцессией — закономерной сменой одного микробиоценоза другим в определенном возрастном периоде [12]. Сукцессия — процесс спонтанного формирования (первичная сукцессия) или восстановления (вторичная сукцессия) поколений элементов экосистемы. Восстановление в экосистеме всех ее потенциальных членов приводит к полной реализации ее возможностей [13].

Результаты газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией свидетельствуют о том, что измерение микробных маркеров in situ выявляет маркеры микроорганизмов из числа труднокультивируемых, малоизвестных и потому не учитываемых в клинической практике: Clostridium, Eubacterium, Enterobacteriaceae, Lactobacillus, Helicobacter, Haemophylus, Peptostreptococcus anaerobius, Pseudonocardia, Streptomyces, Alcaligenes, Rhodococcus, Prevotella, Actinomyces viscosus. Для клинической практики весьма важно, что среди этих микроорганизмов определяются как аэробы, так и анаэробы, вирусы и грибы.

На сегодняшний день доказано: для анаэробных микроорганизмов формирование ассоциаций с аэробами позволяет находить защиту от вредных последствий воздействия кислорода. Очевидно, что анаэробные микроорганизмы в условиях биопленки защищены от токсического воздействия кислорода за счет их взаимодействия с кислородопотребляющими аэробами, которые редуцируют естественный уровень насыщенности кислородом [14]. C этой точки зрения важным диагностическим преимуществом метода МСММ по сравнению с культуральными методами является следующее: в число определяемых маркеров микроорганизмов входят не только те, что располагаются на поверхности биопленки, но и те, что находятся внутри микробных ассоциаций, из которых химические вещества жизнедеятельности микроорганизмов могут поступать на поверхность.

Результаты МСММ демонстрируют в одном анализе присутствие как резидентной (Actinomyces, Clostridium spp., Candida, Lactobacillus spp., Mycobacterium spp., Neisseria spp., Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., S. epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus spp., Treponema spp.), так и факультативной микрофлоры (Alcaligenes, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacteroides fragilis, Bifidobacterium, Eubacterium/Cl. coccoides, Str. pneumoniae, Nocardia, Pseudonocardia, Campylobacter mucosalis, Corineform CDC-group XX, Clostridium propionicum, Clostridium ramosum, Cl. difficile, Clostridium perfringens, Enterococcus, Flavobacterium, Eubacterium, Herpes, Helicobacter pylori, Prevotella, Porphyromonas, Propionibacterium/Cl. subterminale, Rhodococcus, Stenotrophomonas maltophilia, Selenomonas, Streptomyces). Такое разнообразие микроорганизмов на поверхности слизистой оболочки носоглотки у детей выполняет двоякую роль. С одной стороны, микроорганизмы участвуют в переваривании пищи, обеспечивают баланс между сапрофитной и условно-патогенной флорой, поддерживая иммунитет слизистой оболочки ВДП. С другой стороны, именно глубокие отделы носа вместе с глоточной миндалиной, находясь на ретроназальном пути носового секрета, подвергаются постоянной антигенной стимуляции структур лимфатического глоточного кольца, необходимой для формирования и поддержания иммунологического гомеостаза [9, 15].

Следует отметить, что анализ средних значений микробных маркеров у детей в различных возрастных группах не всегда уместен, поскольку у каждого ребенка всегда определяется проявление индивидуального состава микробиоты, который во многом зависит от пищевых привычек, наличия контакта с животными, географических перемещений. Ввиду этого в ряде случаев за счет анализа средних значений сглаживается участие отдельных представителей микроорганизмов. Из таблицы видно, что маркеры некоторых микроорганизмов определяются лишь у отдельных детей, поэтому они должны индивидуально учитываться при анализе микробного паспорта. В то же время нам удалось выявить целый ряд микроорганизмов, который демонстрирует единую тенденцию изменений в зависимости от возраста (см. рисунок):

Полученные в ходе исследования результаты свидетельствуют о том, что измерение микробных маркеров in situ выявляет новую группу микроорганизмов из числа труднокультивируемых и потому малоизвестных в клинической практике. Когда эти микроорганизмы являются участниками инфекционного процесса (Clostridium, Eubacterium, Enterobacteriaceae, Lactobacillus, Helicobacter pylori), то обладают высокой патогенетической активностью, а вызванные ими заболевания трудно поддаются лечению [12]. Вместе с тем присутствие маркеров таких микроорганизмов в cоскобах из носа здоровых детей можно объяснить сукцессионными изменениями [12]. Дело в том, что все основные функциональные преобразования в организме в ходе сукцессий связаны прежде всего с внутренними особенностями функционирующей системы, в то время как окружающая среда определяет характер, скорость и направление изменений сукцессионных процессов и решение многих задач организма.

1. Использование метода МСММ позволяет оценить экосистему носоглотки как единый биотоп с учетом различных видов бактерий, грибов и даже вирусов.

2. Результаты исследования микробиоты носоглотки у здоровых детей, по данным МСММ, свидетельствуют о наличии сукцессии в количественных показателях видового состава микрофлоры в зависимости от возраста.

3. С помощью метода МСММ удается определять индивидуальные свойства микробиоты слизистой оболочки носоглотки в детском возрасте, что позволяет рекомендовать данный метод к использованию в клинической практике.

В заключение необходимо отметить, что изучение микробных ассоциаций у здоровых детей для оториноларингологов и педиатров крайне важно, так как анализ микробиоты носоглотки даст возможность адекватно оценивать развитие воспаления и устранять патологический процесс без повреждения экологии слизистых оболочек.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И.А.

Сбор и обработка материала: О.К., И.К.

Статистическая обработка данных: А.Ш.

Написание текста: И.А., С.Ш.

Редактирование: С.В., С.Ш.

Сведения об авторах

Андриянова Ирина Владимировна, к.м.н., доцент [Irina V. Andriyanova, MD, PhD]; адрес: Россия, 660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1 [address: 1 Partizana Zheleznyakа str., 660022 Krasnoyarsk, Russia]; https://orcid.org/0000-0002-0258-2687; e-mail: irina-doc@mail.ru