Общепризнанно, что биотопы человека колонизированы большим числом микроорганизмов с различным патогенным потенциалом. Достаточно детально изучена функциональная активность отдельных представителей микробиоты человека, но лишь в последнее время стали уделять внимание роли межмикробных взаимоотношений в патогенезе заболеваний. Более того, ряду условно-патогенных микроорганизмов отводится роль лишь случайных «обитателей» биоценоза. Такая ситуация исторически обусловлена, поскольку исходно в медицинской микробиологии доминировали постулаты Р. Коха, Л. Пастера и Р. Вирхова о едином этиологическом агенте, что справедливо и по сей день, но исключительно для «классических» патогенных микроорганизмов [1]. С развитием микробиологической техники и более детальным изучением группы «условно-патогенных микроорганизмов» пришло понимание того, что поскольку патогенный потенциал отдельных видов оказывается недостаточным для запуска инфекционно-воспалительного процесса, патогенез заболеваний может быть опосредован совокупным действием участников ассоциаций. Так, Х. Плаут и Ж. Венсан одновременно описали особую форму язвенно-некротической ангины, возникновение которой обусловлено симбиозом бактерий. Впоследствии заболевание назвали ангиной Симановского-Плаута-Венсана. Возбудители этого заболевания, Fusobacterium necrophorum и Treponema vincentii, являются представителями нормальной флоры полости рта и по отдельности не участвуют в развитии заболевания. Более того, даже сформированный этими бактериями симбиоз приводит к ангине лишь при определенных условиях. Другим примером может служить язвенный колит Крона — заболевание, обусловленное нарушениями в микробиоте кишечника. Результаты «революционных» пересадок микробиоты показывают, как изменения взаимоотношений между микроорганизмами могут отразиться на функционировании всего организма человека.

Многими авторами признается существенная роль неспецифической микрофлоры в снижении фертильности, но есть и противники такой точки зрения [2—5]. В обзоре [6] представлены данные о прямом негативном влиянии микроорганизмов на сперматозоиды. Напротив, в ряде исследований выдвигается гипотеза, что микрофлора может быть необходимым элементом эякулята здоровых фертильных мужчин [6, 7]. Кроме того, одним из факторов репродуктивных неудач может служить микробная колонизация тканей генеративных органов и, как следствие, обсемененность спермальной жидкости микроорганизмами [8]. Важно подчеркнуть, что в большинстве исследований отслеживается функциональная активность отдельных видов, изменения состава микрофлоры, но не учитываются симбиотические связи между ними. Известно, что в эякуляте здоровых фертильных мужчин обнаруживается преимущественно грамположительная микрофлора, вследствие чего выдвигается предположение о ее необходимости, поскольку она обеспечивает защиту от заселения репродуктивного тракта патогенными видами. Однако эта же микрофлора может успешно увеличивать свою вирулентность за счет генетического обмена, приобретения новых свойств в результате селекции и других факторов и тем самым обусловливать повреждение эукариотических клеток. Приобретение новых свойств может происходить в условиях симбиоза видов, когда у них включаются адаптационно-приспособительные механизмы к новой форме сосуществования. Представляется, что установить роль микрофлоры в снижении фертильности можно на основе изучения микроэкологических отношений в биотопе [9].

Цель исследования — оценить прогностическую значимость бессимптомной бактериоспермии в снижении фертильности с использованием экологического подхода.

Материал и методы

В ходе исследования были сформированы две группы мужчин. В 1-ю группу включили 76 пациентов с бессимптомной бактериоспермией и патологическими изменениями спермограммы в виде снижения подвижности или числа сперматозоидов согласно критериям ВОЗ [10]. Во 2-ю группу вошли 25 здоровых доноров, в эякуляте которых отсутствовали микроорганизмы (культуральный метод), а показатели спермограммы соответствовали норме по рекомендациям ВОЗ [10].

Для бактериологического исследования эякулята использовали традиционные методы [11]. Частоту обнаружения представителей микрофлоры выражали в процентах. Исследования проводили несколько раз в течение 2012—2019 гг.

Для оценки долевого участия разных видов микроорганизмов в структуре микробиоты использовали коэффициент постоянства вида, который рассчитывали по формуле:

С=р·100/Р,

где р — число наблюдений с регистрацией изучаемого вида; Р — общее число наблюдений [12].

Для количественного выражения взаимодействия между членами микробиоценоза использовали коэффициент сходства Жаккара, рассчитываемый по формуле:

q=c/(a+b–c)·100,

где a — число наблюдений с видом а; b — число наблюдений с видом b; c — число наблюдений, содержащих оба вида [12].

Характер взаимоотношений между двумя видами в составе микробиоты определяли по соотношению коэффициента совместного существования двух «случайных» видов и числа наблюдений, содержащих оба исследуемых вида [13].

Результаты

У мужчин 1-й группы общее микробное число спермоплазмы составило 4,8±0,2 lg КОЕ/мл, микроорганизмы были обнаружены в 95,9% проб семенной жидкости. В 62,4% образцов присутствовал один вид бактерий, из которых в 39,7% были детектированы грамотрицательные палочковидные формы. Эти микроорганизмы в 89,6% случаев были выделены в количестве 10³ КОЕ/мл и более. Наиболее часто в семенной жидкости встречались Enterobacter aerogenes. Основную массу выделенных Escherichia coli составили нетипичные варианты: гемолитические (44%) и лактозонегативные (11%). Другие грамотрицательные таксоны в 15,4% проб были представлены Klebsiella spp., в 11,5% — Citrobacter spp., в 3,8% — Proteus spp.

Бактерии родов Staphylococcus и Streptococcus изолировали в 37,6% проб. В том числе стафилококки в количестве 10³ КОЕ/мл и более, обнаруженные в 2/3 из них, в 55% случаев были идентифицированы как S. epidermidis, в 15% — как S. haemolyticus, в 10% — как S. hominis. Численность коагулазопозитивных стафилококков, содержащихся лишь в 2,7% проб, не превышала 10³ КОЕ/мл.

Ассоциации разных микроорганизмов в эякуляте были выявлены у каждого четвертого мужчины: 24% выделенных штаммов относились к грамотрицательным бактериям, 75% — к грамположительным и 1% — к грибкам рода Candida. Наиболее часто встречали ассоциации, образованные двумя видами бактерий, и только в 18,2% случаев — тремя. В трети микробных ассоциаций семенной жидкости численность каждого ассоцианта составляла 10³ КОЕ/мл и более, в 45,5% проб прослеживалось количественное доминирование только одного из них на фоне минимальной концентрации (≤10² КОЕ/мл) прочих микроорганизмов. В формировании ассоциаций из числа E. coli наибольшую роль играли типичные варианты (87,5%), реже встречались лактозонегативные штаммы. Доля участия коагулазопозитивных стафилококков — 5,2%. Streptococcus viridans был определен в 7,3% ассоциаций, а S. agalactiae — в 6%. Из рода Neisseria основной вклад в образование ассоциаций вносили N. mucosa и N. lactamica. В 34,1% случаев ассоциации формировали стафилококки и стрептококки, а в 31,8% — стафилококки и энтеробактерии. Достаточно высокой (в каждой десятой пробе) оказалась совместная индикация нейссерий и стрептококков, стафилококков и энтерококков, стафилококков и нейссерий, а также нескольких видов рода Staphylococcus (6,8%).

Для выявления долевого участия разных видов в структуре биоценоза использовали коэффициент постоянства (КП) [12]. Так, в эякуляте субфертильных мужчин отсутствовали постоянные виды микроорганизмов. Только представители рода Staphylococcus были отнесены к добавочным (КП=30,1%), а остальные — к случайным (КП<25%).

Представляется более ценным изучение не только структуры сообщества микроорганизмов, но и характера взаимоотношений между ними, который отражает показатель, разработанный C. Bern и J. Martines [13]. Для большинства видов, выделенных из эякулята, была отмечена некомфортность совместного существования. Только для представителей родов Staphylococcus и Streptococcus установлено, что они могут присутствовать в пробах совместно. Однако показатель совместимости видов в микробиоценозе [13] указывает на то, что изолированные виды не приспособлены обитать совместно. В целях определения количественной характеристики взаимодействия между членами микробиоценоза вычисляли коэффициент сходства Жаккара (q) [14]. В итоге для всех выделенных видов условия в биотопе характеризовались как антагонистические. Лишь представители родов Enterococcus и Staphylococcus проявляли слабо выраженную экологическую общность (q=26,1).

Более чем у ¹/₂ мужчин при повторных исследованиях были выделены те же самые микроорганизмы, причем у ¹/₁₀ из них однотипные микроорганизмы выделялись более чем 2 раза. При этом бактериоспермия не сопровождалась клиническими симптомами. Кроме того, как правило, у таких мужчин стаж бесплодия составлял не менее 5 лет.

Во всех случаях ассоциаций микроорганизмов в эякуляте регистрировали более 5 лейкоцитов, при выделении одного микроорганизма число лейкоцитов варьировало от 2 до 5 в поле зрения. В пробах мужчин 2-й группы единичные лейкоциты регистрировали как случайные находки. Кроме того, при детальном анализе клеточного состава в пробах, где присутствовали ассоциации микроорганизмов, было выявлено большое число макрофагов (в 1-й группе — 0,69±0,07, во 2-й — 0,48±0,02; p<0,05).

Вязкость эякулята в 1-й группе была 5,4±0,4 см, в контрольной — 2,4±0,1 см (p<0,05).

Обсуждение

В настоящее время наблюдается противоречивость представлений о вкладе микроорганизмов в развитие мужского бесплодия — от абсолютизации роли в первую очередь патогенных микроорганизмов до полного отрицания их значимости, особенно условно-патогенных представителей. Большинство исследователей сконцентрированы на поиске специфических этиопатогенов в эякуляте, а общая структура бактериального сообщества остается крайне малоизученной [15, 16].

Существенное расширение представлений о микробиоте человека и отдельных его биотопов произошло с момента внедрения молекулярно-генетических методов исследования, технологии метагеномного секвенирования генов 16S рРНК. Такой подход позволил обнаружить в репродуктивном тракте генетические маркеры широкого спектра различных по грампринадлежности и степени патогенности таксонов, в том числе относящихся к Lactobacillus spp., Moraxella spp., Morganella spp., Prevotella spp., Bacteroides spp., а также Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae и др. [17]. Стало понятно, что микробное разнообразие весьма значительно и в мужской репродуктивной сфере [15]. Однако интерпретация метагеномных данных применительно к анализу межмикробных взаимоотношений в этом биотопе затруднительна, поскольку исследователи [18, 19], как авторы настоящей работы, при идентичных ситуациях столкнулись с пестротой результатов по долевому участию отдельных видов. Генетический материал одного и того же вида микроорганизмов в некоторых случаях составлял доли процента, а в других — более половины совокупного генома, но при этом соответствующие штаммы не обнаруживались при культуральном исследовании. Возможно, это является следствием другой, не менее существенной дилеммы метагеномного анализа, — невозможности дискриминировать найденные генетические фрагменты по принадлежности живым активным участникам микробиоты либо всего лишь их предшествующему присутствию или миграции в анализируемом биотопе. Так или иначе, оценочную систему межмикробных отношений по результатам молекулярно-генетических методов анализа еще предстоит разработать. Представляется, что не менее ценную информацию о вкладе микроорганизмов в патогенез бесплодия можно получить при изучении не столько структуры сообщества, сколько характера взаимоотношений между ассоциантами на основе сложившихся подходов. При культуральном исследовании установлено, что микрофлора эякулята находится в сложных взаимоотношениях, по большей части антагонистических друг к другу, на что указывают малое число ассоциаций и результаты индексной оценки взаимоотношений микроорганизмов. В такой ситуации можно ожидать активацию ряда синтетических процессов, которые направлены на поддержание антагонизма, а также селекцию таких видов микроорганизмов, которые способны существовать в симбиозе с другими ассоциантами. В результате происходит обеднение микрофлоры репродуктивного тракта у пациентов с бесплодием, что выявлено в настоящем исследовании и согласуется с данными других исследований [20]. Более того, можно говорить, что происходит отбор видов, опосредованный условиями биотопа репродуктивного тракта: метаболиты микроорганизмов-ассоциантов и факторы иммунной системы хозяина — основные эффекторы такого отбора. Например, по данным Ю.Л. Набока и соавт. [21], у пациентов с хроническим простатитом штаммы характеризуются высокой адгезивной способностью и антилизоцимной активностью. По наблюдениям настоящего исследования, представители E. coli в большом числе случаев проявляли гемолитическую активность и, как правило, не участвовали в формировании ассоциаций.

Межмикробный антагонизм не может не отражаться на состоянии эукариотических клеток, особенно в антагонистически «настроенном» микробиоценозе. Так, показано, что E. coli синтезируют метаболиты, обеспечивающие продукцию реактивных форм кислорода, что в свою очередь негативно влияет на подвижность сперматозоидов [22]. Токсины других грамотрицательных энтеробактерий также оказывают негативное влияние на двигательную активность сперматозоидов [23]. Наиболее неблагоприятная ситуация развивается при фрагментации ДНК половых клеток, которую невозможно выявить в рутинной спермограмме с использованием световой микроскопии, а требуются специальные процедуры. Разрушение нуклеиновой кислоты может быть опосредовано продукцией активных форм кислорода, ряда ферментов и метаболитов с токсическими для эукариотических клеток свойствами.

В связи с этим использование индексной оценки взаимоотношений между отдельными микроорганизмами сохраняет свою актуальность, поскольку не требует трудоемкого лабораторного исследования и дает представления о «направленности» ассоциативного симбиоза в биотопе. П.В. Фурсова и A.П. Лeвич [24] подчеркивают, что видовой спектр представляет собой экологическую «систему отсчета», поскольку именно изменения в численности видов дают информацию о структуре и функционировании сообщества. Удобной формой интегрирования информации о сообществе являются экологические индексы, в частности, использованный в настоящем исследовании индекс Жаккара, дающий представление о типе симбиотических отношений.

Двоякое отношение медицинской общественности к бактериоспермии вызвано в том числе отсутствием клинических проявлений и четких корреляций с теми или иными репродуктивными нарушениями. Однако в контексте профилактики репродуктивных неудач, в особенности при реализации вспомогательных технологий, необходимо учитывать способность микроорганизмов к прочной адгезии к сперматозоидам за счет ковалентных связей, что позволяет им проникать в женский репродуктивный тракт и оказывать влияние на оплодотворение яйцеклетки. Так, например, энтерококки способны прочно прикрепляться к хвостовой части сперматозоида и в последующем обусловливать развитие замершей беременности [25].

Ситуация с увеличением числа макрофагов представляется опасной, поскольку дифференцировка последних в М2-тип будет способствовать более длительному течению воспаления, что отчасти и наблюдалось у мужчин 1-й группы — бессимптомная бактериоспермия с минимальным набором клинических проявлений. Увеличение вязкости эякулята косвенно указывает на воспалительный характер изменений. Показано, что достаточно большой спектр условно-патогенных микроорганизмов обладает способностью менять поляризацию макрофагов за счет своих метаболитов, обеспечивая тем самым себе выживание [26].

В целом можно предположить, что в эякуляте формируются антагонистические отношения между отдельными микроорганизмами, которые отчасти обусловливают и противостояние с иммунной системой хозяина, когда синтетическая активность прокариотических клеток значительно меняется. В результате продуцируемые метаболиты более вирулентных штаммов подавляют рост и функционирование микроорганизмов-ассоциантов, а также модулируют работу иммунокомпетентных клеток таким образом, что воспаление протекает бессимптомно и переходит в хронический процесс. Такие ситуации не могут не отражаться на состоянии половых клеток, которые, как было показано ранее [27], при бессимптомной бактериоспермии теряют двигательную активность, меняют морфологию и обеспечивают транспорт микроорганизмов с выраженным патогенным потенциалом в репродуктивный тракт женщины.

Заключение

Таким образом, сложные, в большинстве своем антагонистические отношения между микроорганизмами в эякуляте, не проявляясь клинически, создают условия для снижения репродуктивного потенциала. В частности, длительная персистенция может быть причиной более прочной адгезии микроорганизмов к половым клеткам, что, вероятно, служит предиктором репродуктивных потерь. Использование ряда микроэкологических индексов позволяет количественно оценить взаимоотношения между выделенными микроорганизмами, что важно для расшифровки механизмов снижения фертильности, ассоциированных с неспецифическими инфекциями.

Работа выполнена в рамках научного проекта 17-44-590404р_а, поддержанного РФФИ и Администрацией Пермского края.

Участие авторов равное на всех этапах подготовки статьи.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.