Неоднократные эпидемиологические исследования, проводимые в странах Европы, в том числе в Российской Федерации, показывают стабильное доминирование врожденных пороков сердца (ВПС) в структуре врожденных аномалий развития плода [1, 2]. В промышленных регионах Российской Федерации отмечен рост числа критических ВПС, определяющих уровень перинатальной и младенческой смертности [3]. С позиции генетического детерминирования эту патологию можно разделить как минимум на 3 группы: семейные орфанные моногенные ВПС (миссенс-мутации в генах CRELD1, GATA4, GATA5 и GATA6 и пр.), синдромальные ВПС при хромосомных аномалиях и спорадические ВПС без хромосомных аномалий.

Удельный вес спорадических ВПС без хромосомных аномалий составляет 80% от всех ВПС. Несмотря на значительные достижения в кардиологии и генетике, этиология и патогенез спорадических ВПС без хромосомных аномалий до сих пор не выяснены [4]. Неоднократные исследования миссенс-мутаций генов CRELD1, GATA4, GATA5 и GATA6 при спорадических ВПС показали противоречивые данные об их ассоциации с этой патологией [5—7]. Таким образом, можно предположить, что гены CRELD1, GATA4, GATA5 и GATA6 характеризуются определенной пенетрантностью в отношении семейных ВПС, и их полиморфизм может иметь положительные ассоциативные связи со спорадическими ВПС.

Одной из важных задач современной перинатологии и педиатрии является прегравидарное прогнозирование формирования врожденных аномалий развития плода, в том числе спорадических ВПС.

Цель исследования — изучить взаимосвязь полиморфизма материнских генов CRELD1 и GATA6 с развитием спорадических ВПС без хромосомных аномалий у детей.

Исследование проведено на базе ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» (Кемерово). Все участники исследования подписали добровольное информированное согласие.

В основную группу включены 103 женщины, родившие детей со спорадическими ВПС (пороки со сбросом слева—направо («бледные») — 67; пороки со сбросом справа—налево («синие») — 16; пороки с перекрестным сбросом — 20). Средний возраст участниц основной группы — 26 (от 18 до 48) лет. Дети с ВПС находились на лечении в отделении детской кардиологии ГБУЗ «Кемеровский областной клинический кардиологический диспансер им. акад. Л.С. Барбараша».

Группу контроля составили 105 женщин, родивших 2 здоровых детей и более. Средний возраст обследуемых составил 27 (от 18 до 47) лет.

Все участницы исследования принадлежали к русcкому этносу, были жителями Кемерова, и их предки проживали на территории Кемеровской области не менее чем в трех поколениях.

Исследование одобрено объединенным локальным этическим комитетом двух организаций. Все женщины заполнили анкеты, составленные для определения факторов риска рождения детей с ВПС с позиции наследственной патологии, состояния здоровья и демографических показателей. Основные разделы анкет посвящены социальным и медицинским характеристикам родителей: образование; вредные привычки; профессиональные вредности; адрес и этажность проживания во время беременности; наличие хронических заболеваний; отягощенная по ВПС и другим заболеваниям наследственность; акушерско-гинекологический анамнез; особенности родов и перинатального периода; вопросы о ребенке, рожденном с ВПС.

Качественные показатели представлены двумя категориями: 0 — отсутствие признака, 1 — наличие признака. Другие показатели отражались в соответствующей им размерности.

Изучение семейного анамнеза матерей основной группы показало отсутствие отягощенной наследственности по материнской и отцовской линиям и подтвердило спорадическую природу возникновения ВПС у рожденных ими детей.

У всех обследуемых выполняли забор крови из локтевой вены, помещали ее в вакуумные одноразовые пробирки с антикоагулянтом этилендиаминтетраацетатом — ЭДТА К3 для дальнейшего выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) методом фенолхлороформной экстракции по Маниатис (1984). Концентрацию полученной ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop-2000 (TFS, США). Генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции в 96-луночном формате с учетом результатов в режиме реального времени (ViiA 7, «Аpplied Вiosystem», Сингапур) с использованием меченых флуоресцентными агентами зондов TaqMan («Аpplied Вiosystem», США) в соответствии с инструкциями производителя. Выполнено молекулярно-генетическое типирование генов CRELD1 (int, rs9878047); CRELD1 (ex, rs3774207); CRELD1 (ex, rs73118372); GATA 6 (rs10454095).

Контроль качества генотипирования проводили посредством повторного генотипирования 10% образцов. Несмотря на повторное проведение молекулярно-генетического анализа, для некоторых образцов типирование ДНК по отдельным полиморфным сайтам оказалось невозможным, вследствие чего данные образцы исключены из анализа соответствующих локусов.

Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ Statistica 10.0 и SNPstats. Нормальность распределения данных проверяли с помощью критерия Шапиро—Уилка. Для описания номинальных признаков использованы значения абсолютных (n) и относительных (%) частот. Количественные признаки представлены в виде среднего значения (M), min и max. Подчинение распределения частот аллелей и генотипов равновесию Харди—Вайнберга определяли при помощи критерия Пирсона χ². Для оценки влияния генотипа или аллей использовали отношение шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал (ДИ). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Проведенное молекулярно-генетическое тестирование показало, что частота аллелей полиморфных сайтов rs9878047, rs3774207 CRELD1 и rs10454095 GATA6 соответствовала закону распределения Харди—Вайнберга (табл. 1).

Максимальный уровень наблюдаемой гетерозиготности для локуса rs10454095 GATA6 составил у женщин основной группы 0,43±0,02 и у женщин контрольной группы — 0,458±0,019.

Исследование распределения частот аллелей и генотипов генов CRELD1 (int, rs9878047; ex, rs3774207) и GATA6 (rs10454095) у женщин основной и контрольной групп по пяти моделям наследования показало наличие одной отрицательной ассоциативной связи по овердоминантной модели наследования. Результаты ассоциативного анализа представлены в табл. 2.

Носительство женщиной гомозиготного генотипа C/T rs10454095 GATA6 ассоциируется с более чем двукратным снижением риска формирования ВПС у детей при овердоминантном типе наследования. Соответственно мутационная изменчивость в полиморфном сайте rs10454095 материнского гена GATA6 связана с протективным эффектом в отношении формирования спорадических септальных ВПС у потомства.

Ген CRELD1 расположен в локусе 3p25.3, имеет 11 экзонов и играет важную роль в кардиогенезе. Ранее авторами нескольких научных работ [8, 9] выявлены ассоциации изменчивости CRELD1 с развитием изолированного дефекта атриовентрикулярной перегородки. А. Asim и соавт. [10] обнаружили мутацию c.973G>A (p.Glu325Lys) в кодирующей области гена, которая влияет на сплайсинг прематричной рибонуклеиновой кислоты (РНК). Данная мутация выявлена у одного пациента с дефектом атриовентрикулярной перегородки. Исследование, выполненное P. Ghosh и соавт. [11], показало, что гаплотипы CTC и CTT CRELD1 (rs9878047—rs3774207—rs73118372) являются факторами риска развития дефекта атриовентрикулярной перегородки у пациентов с синдромом Дауна.

Однако в исследовании, проведенном в 2015 г., не установлено ассоциативных связей гена CRELD1 с развитием септальных ВПС у детей с синдромом Дауна [12]. В нашей работе также не найдено ни положительных, ни отрицательных взаимосвязей полиморфных локусов CRELD1 с развитием ВПС, что подтверждает важность репликационных исследований в разных этнических популяциях.

Еще одним геном, вызывающим интерес исследователей, является GATA6. Известно, что продукты генов комплекса GATA представляют собой семейство белков, содержащих мотив «цинковые пальцы» (англ. — zinc finger) и имеющих ДНК-связывающие сайты для соответствующих последовательностей GATA — мишеней промоторов генов. У позвоночных семейство белков GATA состоит из шести членов (GATA1—GATA6), из которых GATA4, GATA5 и GATA6 высоко экспрессированы в различных мезодермальных и эндодермальных тканях, особенно в период эмбриогенеза [8]. Во время эмбрионального развития факторы GATA регулируют дифференцировку клеток, пролиферацию и их выживание. Белки типа «zinc finger» являются белковыми модулями, взаимодействующими с ДНК, РНК, белками или небольшими молекулами и могут играть решающую роль в транскрипции генов. Известно, что экспрессия связывающего белка GATA6 не заканчивается при завершении кардиогенеза в период внутриутробного развития. Поддержание определенного уровня транскрипции GATA6 отмечается и в кардиомиоцитах взрослого человека и взрослых животных (в экспериментальных моделях) [13].

Исследования на моделях животных показали, что GATA6 регулирует дифференциацию и влияет на развитие ВПС. В эксперименте показано, что у гомозиготных по GATA6-нокаут гену мышей обнаруживаются дефекты развития энтодермы, приводящие к эмбриональной смерти [14].

У человека мутации GATA6 зарегистрированы как в семьях, так и у отдельных больных ВПС, в том числе при дефекте межпредсердной перегородки, атриовентрикулярном дефекте межпредсердной перегородки, тетраде Фалло и дефекте межжелудочковой перегородки в различных этнических популяциях [9].

В нашем исследовании показана отрицательная ассоциация между спорадическими ВПС и генной мутацией GATA6 в сайте rs10454095 (1621−3179T>C), который расположен в интронной области NM_005257.5.

Наше исследование не имеет аналогов, судя по данным литературы. Вместе с тем Y. Xu и соавт. [15] на разных популяциях показали, что мутации в этом гене приводят к конотрункальным порокам сердца и, вероятно, являются риском развития несиндромальных дефектов сердца. X. Wang и соавт. [16] в своем исследовании идентифицировали 3 миссенс-мутации GATA6 (E51K, S184N и G245R), ассоциированных с ВПС, при том что две мутации выявлены впервые (E51K и G245R). Авторами сделано предположение, что мутация E51K существенно влияет на структуру, стабильность, следовательно, и транскрипционную активность белка GATA6. Установлено также, что мутация G245R приводит к нарушениям связей и изменяет структуру белка GATA6 [16]. X. Lin и соавт. [17] провели анализ последовательности GATA6 у 270 пациентов с ВПС, выявив новую гетерозиготную мутацию S184N у 3 пациентов, в том числе у одного — с тетрадой Фалло и у двух — с дефектом межпредсердной перегородки.

Другой коллектив авторов во главе с М. Maitra [18] изучили GATA6 у 310 пациентов с ВПС и обнаружили 2 гетерозиготных мутации A178V и L198V, причем мутация L198V выявлена у пациента с тетрадой Фалло, а мутация A178V — у пациента с дефектом межжелудочковой перегородки. Функциональная оценка этих мутаций показала, что A178V увеличивает транскрипционную активность, в то время как L198V не влияет на нее.

Наше исследование направлено на выявление новых закономерностей формирования ВПС, ассоциированных с полиморфизмом генов комплекса GATA, но не связанных с мутациями кодирующих регионов. В результате показано, что мутации в материнском гене GATA6 (rs10454095) играют протективную роль при формировании спорадических ВПС в последующих поколениях.

Следует отметить, что работ, посвященных изучению ассоциаций материнских аллелей и генотипов GATA6 (rs10454095) с формированием ВПС у плода (и наличием у ребенка), нет. Не встречаются и исследовательские работы, посвященные особенностям наследования аллелей и генотипов GATA6 (rs10454095) от родителей к их детям с ВПС. В то же время в российской научной литературе нет публикаций, касающихся генетической детерминированности развития ВПС, связанной с нарушением белков CRELD и GATA, несмотря на то что в мировой научной практике исследования в данном направлении проводятся. С этих позиций наше исследование является актуальным и демонстрирует новые данные о наследственных причинах спорадических ВПС.

Показано, что носительство женщиной гетерозиготного генотипа C/T rs10454095 GATA6 является протективным с точки зрения уменьшения риска внутриутробного развития врожденных пороков сердца.

Однако следует учитывать, что в эмбриогенезе комплекс генов GATA4, GATA5 и GATA6 экспрессируется одновременно, что предполагает вероятное мультипликативное детерминирование формирования врожденных пороков сердца несколькими генами этого семейства. Для проверки этого предположения необходимы дальнейшие исследования.

Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0546−2015−0011 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов, с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Шабалдин Андрей Владимирович — д.м.н., вед.н.с. лаб. клеточных технологий, отдел экспериментальной и клинической кардиологии; https://orcid.org/0000-0002-8785-7896

Цепокина Анна Викторовна — мл.н.с. лаб. геномной медицины, отд. экспериментальной и клинической кардиологии; https://orcid.org/0000-0002-4467-8732

Понасенко Анастасия Валериевна — к.м.н., зав. лаб. геномной медицины, отд. экспериментальной и клинической кардиологии; https://orcid.org/0000-0002-3002-2863

Шмулевич Светлана Александровна — зав. отд. детской кардиологии.

Шабалдина Елена Викторовна — д.м.н., зав. каф. оториноларингологии КемГМУ.