Резус-иммунизация во время беременности — появление у беременной резус-антител в ответ на попадание в кровоток фетальных эритроцитов, имеет большое значение для перинатальных исходов ввиду развития гемолитической болезни плода и новорожденного. В прошлом столетии понятие гемолитической болезни плода и новорожденного было почти синонимом резус-иммунизации. В настоящее время основным неинвазивным методом диагностики гемолитической болезни плода является ультразвуковое исследование с допплерометрией пиковой систолической скорости кровотока в средней мозговой артерии плода. К инвазивным методам диагностики гемолитической болезни плода относятся: амниоцентез (оценка оптической плотности билирубина в околоплодных водах) и кордоцентез с последующим лабораторным исследованием крови плода. Исследование плодовой крови, полученной путем кордоцентеза, позволяет оценить тяжесть заболевания, определить показания к проведению внутриутробной гемотрансфузии. В то же время с внедрением в клиническую практику оценки пиковой систолической скорости кровотока как критерия анемического синдрома у плода инвазивные методики несколько утратили свое значение.

В последнее время с целью снижения частоты акушерских и перинатальных осложнений интенсивно разрабатываются неинвазивные методы дородовой диагностики различной наследственной патологии. Чаще всего неинвазивные методы, не требующие забора плодного материала, применяют для диагностики у плода врожденных пороков развития и хромосомных синдромов. В то же время сфера неинвазивной пренатальной диагностики не ограничивается диагностикой генетических особенностей и анеуплоидий плода. Одно из активно развивающихся направлений — неинвазивное генетическое определение резус-фактора плода у женщин с резус-отрицательной принадлежностью крови [1—4]. До настоящего времени преемственность результатов исследований неинвазивной пренатальной диагностики и клинической практики была довольно ограничена. Успехи в улучшении аналитических характеристик тест-систем, стандартизация протоколов выделения внеклеточной фетальной ДНК и последующей ПЦР (полимеразная цепная реакция)-амплификации, использование современных ПЦР-амплификаторов повысили показатели диагностической точности, чувствительности и специфичности методик и активно способствуют внедрению последних в рутинную клинико-лабораторную практику [5].

Цель исследования — выяснить аналитические возможности (чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результата, диагностическая точность) методики неинвазивного определения резус-фактора плода по крови беременной женщины с использованием тест-систем Тест-RHD плюс (производство ООО «ТестГен», Россия), АмплиПрайм ДНК-сорб-Б (производство ООО «НекстБио», Россия), Rotor-Gene6000 (производство «Corbett Research», Австралия); проанализировать современные данные аналитических возможностей методик тестирования объема фетоматеринского кровотечения (FMH).

В исследование включены результаты обследования 46 беременных с резус-отрицательной принадлежностью крови, наблюдавшихся и родоразрешенных в бюджетном учреждении здравоохранения Омской области «Городской клинический перинатальный центр» (главный врач С.В. Николаев), Омск. Критерии включения в исследование: резус-отрицательная принадлежность крови беременной; факт беременности, подтвержденный объективными методами; срок гестации более 10 нед, наличие информированного добровольного согласия.

Для выделения внеклеточной циркулирующей фетальной ДНК из клинического материала применяли комплект реагентов АмплиПрайм ДНК-сорб-Б (производство ООО «НекстБио», Россия). В результате экстракции получался высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции амплификации, обеспечивающий высокую аналитическую чувствительность ПЦР-исследования. Для определения резус-фактора плода методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией использовался набор реагентов Тест-RHD плюс (производство ООО «ТестГен», Россия), Амплификатор Rotor-Gene6000 (производство «Corbett Research», Австралия).

Для получения плазмы кровь (не менее 8 мл) отбиралась в пробирку с EDTA-антикоагулянтом, последующее отделение плазмы проводилось в течение 3 ч с момента взятия крови. Программа амплификации представлена в таблице.

Все реакции сопровождались постановкой отрицательного и положительного контроля (набор Тест-RHD). Результат ПЦР-исследования считался достоверным при получении совпадения данных для отрицательных и положительных контролей амплификации. Полученные результаты подтверждались серологическим методом исследования крови новорожденного после родоразрешения обследуемой.

Проанализированы аналитические характеристики методики: диагностическая точность, чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность, отрицательная прогностическая ценность.

По результатам ДНК-анализа 46 образцов крови положительный резус-фактор был выявлен в 71,7% (33 образца) наблюдений, резус-фактор плода был отрицательным в 28,3% (13 образцов). Данные результаты подтверждены серологическим методом исследования резус-фактора у новорожденных. В одном случае отмечено несовпадение результата анализа: при положительном результате по данным тест-системы у новорожденного оказалась резус-отрицательная кровь. При этом не представлялось возможным уточнить генетический статус плода, проанализировав буккальный соскоб, ввиду отказа пациентки от исследования. При анализе возможных причин расхождения полученных результатов в вышеуказанном случае установлены нарушения правил транспортировки и хранения материала. Таким образом, данный результат не может учитываться при анализе аналитических возможностей данного метода диагностики.

Проанализированы аналитические характеристики методики. Получены: диагностическая точность — 97,82%, чувствительность — 100%, специфичность — 92,85%, прогностическая ценность положительного результата — 96,96%, прогностическая ценность отрицательного результата — 100%.

В Российской Федерации активно внедряется принятая в европейских странах методика Rh (D)-генотипирования плода [6—10]. Чувствительность данного метода при сроке гестации 10—11 нед, по данным F. Clausen [7], составляет 99,3%, по другим сообщениям [12] — 98,7%, специфичность — 100%. Также разработаны ДНК-зонды к другим антигенам эритроцитов: С, Е, К, FYA, JKA, JKB, M, S (Соединенное Королевство Великобритании) [13].

Учеными отмечена экономическая эффективность внедрения RHD-генотипирования плода в программу наблюдения и ведения беременных[14]. В Дании определение резус-принадлежности плода по крови матери входит в стандарты наблюдения и ведения беременных. Данный рутинный дородовый скрининг позволяет отобрать беременных, нуждающихся в проведении плановой профилактики резус-иммунизации в срок 28—30 нед [15]. Референсная лаборатория в Бристоле выполняет данные исследования с 2001 г., и в настоящее время выполняет около 200 исследований в год у женщин в сроки беременности 26—32 нед, при этом дискордантные результаты отсутствуют с 2005 г.

В мировой клинической практике разработано несколько экономических моделей, позволяющих судить об экономической целесообразности применения вариантов данных моделей для предотвращения резус-иммунизации. Учитывая стоимость проведения исследования, был сделан вывод о том, что проведение плановой иммунопрофилактики остается предпочтительным методом профилактики резус-иммунизации [16]; данная позиция также разделяется Итальянским обществом акушеров-гинекологов (SIGO) [17]. Кроме того, обсуждается возможность внедрения в повседневную практику RHC/c, RHE/e, KEL генотипирования плода [6]. В Норвегии действует программа скрининга, включающая типирование не только резус-принадлежности плода по крови матери, но и определение тромбоцитарных аллелей HPA-1A, с целью идентификации HPA-1b1b и последующего проведения профилактических мероприятий[18].

В Швеции в 2012 г. при внедрении методики в клиническую практику получены следующие результаты: инвазивное определение резус-фактора плода выполнено у 4118 беременных женщин, медиана срока беременности составила 10 нед. Повторный анализ пришлось выполнить в 211 (5,1%) случаях. Выявлен положительный резус-фактор плода в 2401 (58,3%) случае, отрицательный в 1552 (37,7%), результаты были неубедительны в 165 (4,0%) случаях после первого тестирования. После повтора анализа 147 из 165 образцов только у 14 образцов получены неубедительные результаты, во всех случаях по причине слабого или неэкспрессирующегося материнского RHD гена. В качестве «золотого стандарта» для подтверждения резус-фактора новорожденных применялось серологическое определение. Количество ложноотрицательных результатов составило 55 (2,4%) из 2297, ложноположительных — 15 (1,1%) из 1355; чувствительность и специфичность оказались близкими к 99% в образцах после 8-й недели беременности, в срок 22 нед беременности чувствительность составила 100% [19].

В России многоцентровое исследование неинвазивного определения резус-фактора выполнялось на базе 11 учреждений (анализ показателей информативности наборов реагентов Тест-SRY и Тест-RHD при установлении пола и резус-фактора плода). Представлены результаты обширных доклинических испытаний наборов реагентов Тест-SRY и Тест-RHD производства компании «ТестГен» для раннего неинвазивного определения пола и резус-фактора плода по крови беременной женщины. Проведен анализ данных, полученных в ходе мультицентрового исследования на базе 11 лабораторий. В исследовании приняли участие 1817 беременных женщин, у 1006 проведен анализ по полу плода и у 811 — по резус-фактору плода (все женщины, участвовавшие в анализе резус-фактора плода, сами имели отрицательный резус-фактор). Установлено, что методики определения пола и резус-фактора плода по крови беременной женщины с применением наборов Тест-SRY и Тест-RHD обладают высокими показателями диагностической точности, чувствительности и специфичности [20].

Современная стратегия ведения беременных с резус-отрицательной принадлежностью крови в призме современных достижений науки включает не только определение резус-фактора плода по крови беременной женщины, но и тестирование объемов FMH с целью подбора корректной дозы анти-Rh (D) иммуноглобулина G. В настоящее время методом контроля плодово-материнских трансфузий являются проточная цитометрия (FCM), кислотно-связывающий тест Kleinhauer-Betke (KBT). Эти методы применялись для определения объема FMH с целью выбора адекватного объема иммунопрофилактики. По полученным данным, в 92,5 и 87% случаев соответственно регистрировался объем FMH менее 10 мл крови, что потенциально может быть нейтрализовано меньшим объемом анти-Rh (D) иммуноглобулина G. Объем FMH был более 30 мл в 1,3 и 2,7% случаев, рассчитан по KBT и FСМ соответственно. Данная категория женщин нуждалась в дополнительной дозе анти-Rh (D) иммуноглобулина G.

Согласно полученным данным, метод FCM набора FMH QuikQuant с использованием антитела анти-HbF обладал чувствительностью 89,8% и специфичностью 93,2%; значение метода в определении объема FMH отмечено и другими учеными. Данная методика основана на идентификации D-положительных эритроцитов в присутствии D-отрицательных эритроцитов. В прямом тесте используется меченный флюорохромом анти-D, а в непрямой версии этого теста используется меченный флюорохромом анти-IgG. Кроме того, разработаны и опробованы методики, позволяющие минимизировать лейкоцитарный эффект при проведении анализа, с помощью специальных реагентов (FITC анти-D, AEVZ5.3-FITC, FITC, BRAD-3-FITC/anti-CD45, BRAD-3-FITC/anti-CD66b-PE). По данным мониторингового исследования, проведенного в Италии, в 70% случаев оценка объема FMH не происходит, в Российской Федерации подобная методика реализуется в основном в научно-исследовательских работах.

Проспективное исследование, проводимое в Чехии с участием 3457 родильниц, показало, что кесарево сечение не является существенным фактором риска высокого FMH, требующего введения дополнительной дозы анти-Rh (D) иммуноглобулина G, и в большинстве случаев объем FMH составляет менее 5 мл, что вполне компенсируется 100 мкг анти-Rh (D) иммуноглобулина G. Для оценки персистенции фетального гемоглобина (HPFH) Международный комитет по стандартизации в гематологии предлагает использовать метод автоматизированной жидкостной хроматографии высокой производительности и капиллярный электрофорез. Оценка FMH не рекомендуется в случае потенциально сенсибилизирующего события, возникшего до 20 нед беременности.

Методика определения резус-фактора плода по крови женщины на ранних сроках беременности с использованием одноэкзонного метода обладает высокими показателями диагностической точности, чувствительности и специфичности; является простой и надежной в исполнении и может быть рекомендована для применения в рутинной клинической практике. Для правильного определения резус-фактора плода по крови беременной женщины необходимо соблюдение следующих условий: проведение исследования в cрок беременности с 10-й недели; правильное обращение с плазмой и ее транспортировка; выделение ДНК в максимально быстрые сроки; выделение ДНК с использованием надежной технологии; организация работы в ПЦР-лаборатории, согласно действующим национальным нормам; четкое следование инструкции[21].

Конфликт интересов отсутствует.