Молекулярно-генетические аспекты фетального программирования аномальных маточных кровотечений пубертатного периода: роль синдрома эндотелиальной дисфункции

В последние годы в фокусе научного интереса находятся исследования, посвященные изучению внутриутробно программируемых заболеваний человека. Течение беременности и родов у матери оказывает определяющее влияние на становление репродуктивного здоровья девочки [1-3]. Известно, что нарушение менструальной функции, в частности аномальные маточные кровотечения пубертатного периода (АМК ПП), чаще формируются у девочек, рожденных от матерей, беременность которых протекала на фоне привычного невынашивания, преэклампсии и хронической фетоплацентарной недостаточности с исходом в синдром задержки внутриутробного роста плода (СЗРП) [3, 4]. Пусковым механизмом патогенеза этих акушерских осложнений является синдром эндотелиальной дисфункции [6, 7].

Идея о том, что в основе патогенеза основных осложнений гестации лежит патология эндотелия, принадлежит Roberts и соавт. (1989). Дефекты плацентации на этапе имплантации и формирования плаценты приводят к нарушению маточно-плацентарного кровотока и развитию ишемии плаценты. Нарушение гемодинамического равновесия плацентарного кровотока вызывает повышение сопротивления децидуальных артериальных сосудов, снижение тканевой перфузии, что запускает генерализованное поражение эндотелиальной выстилки сосудов и активацию коагуляционного потенциала крови [6, 8].

Доказана роль генетического полиморфизма эндотелиальной NO-синтазы (eNOS3) в развитии преэклампсии и плацентарной недостаточности [9-11]. Поэтому логично предположить, что девочки, рожденные с СЗРП от матерей, у которых беременность протекала на фоне синдрома эндотелиальной дисфункции с исходом в преэклампсию и фетоплацентарную недостаточность, унаследовали определенный полиморфизм генов, регулирующих функцию эндотелиальной системы. Фенотипически эндотелиальная дисфункция у этих девочек может реализоваться в развитие аномальных маточных кровотечений пубертатного периода, связанных с нарушением баланса тканевых эндотелиальных факторов, сосудистого тонуса, ангиогенеза и локального гемостаза в эндометрии [12, 13].

На сегодняшний день среди полиморфизмов гена эндотелиальной NO-синтазы наиболее изученными являются функционально связанные полиморфизмы: 894G/T (rs1799983), 786T/С (rs2070744), определяемые изменением числа тандемных повторов в интроне-7. Данные литературы подтверждают важную роль этих полиморфизмов в увеличении чувствительности к сердечно-сосудистым заболеваниям (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, преэклампсия, гипертензия, инсульт), а также в генезе других заболеваний (инсулинорезистентность, сахарный диабет) [14, 15].

Одними из важнейших регуляторов эндотелиальной функции являются эстрогены. Они оказывают влияние на сосудистую систему и микроциркуляцию, активируя высвобождение оксида азота (NO), простациклина, гиперполяризационного фактора эндотелия, а также уменьшая высвобождение сосудосуживающих субстанций, таких как эндотелин-1 и ангиотензин II [16-18]. Биологический эффект эстрогенов реализуется через специфические ядерные и мембранные негеномные рецепторы, локализованные в эндотелии и гладкомышечных клетках сосудов. Описаны два типа рецепторов эстрогенов - ERα и ERβ, которые относятся к суперсемейству ядерных рецепторов стероидных гормонов. Для эндотелиальной ткани наибольшее значение имеет передача сигнала через рецептор ERα [18].

Ген ERα (ESR1) расположен на хромосоме 6q25. Он состоит из 8 экзонов, 7 интронов и занимает более чем 140 кб. В этом гене были обнаружены несколько полиморфизмов. Наиболее широко изученными являются PvuII (T397C), XbaI (C351G) (RFLPs - restriction fragment length polymorfisms) в первом интроне и вариабельное число тандемных повторов (VNTR) (ТА) n в промоторе [20].

Молекулярные механизмы, благодаря которым эти полиморфизмы влияют на активность рецепторов, остаются малопонятными. ESR1 PvuII полиморфизм может влиять на экспрессию гена ESR1, изменяя связывания транскрипционных факторов [20], и на сплайсинг гена ESR1. Известно, что некоторые из протективных эффектов действия эстрогенов на сосуды реализуются через негеномный механизм, включая пути активации: ras, raf, MEK (mitogen-activated protein kinase), MAPK (mitogen-activated protein kinase) и phosphatidyl-inositol-3-kinase/Akt. Таким образом активируется синтаза эндотелиального NO (NOS3) в совокупности с геномным эффектом эстрадиола на синтез NO [21, 22].

Остаются малоизученными вопросы межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов эндотелиальной NO-синтазы и генов рецепторов к эстрадиолу при ряде заболеваний, в том числе репродуктивной системы. Подобных работ в отечественной и зарубежной литературе встречается немного, и проблема требует дальнейшего изучения.

Цель работы - оценить влияние ассоциации полиморфных генов NOS3 иESR1 на функциональное состояние эндотелиальной системы и рецепцию половых стероидных гормонов у девочек с аномальными маточными кровотечениями (АМК).

Обследованы 96 девочек-подростков, страдающих с менархе АМК ПП, из них 32 девочки, рожденные доношенными c СЗРП, и 37 девочек, рожденных в доношенном сроке с нормальной массой тела. Контрольную группу составили 27 здоровых девочек.

Критерий включения пациенток в основную группу - оценка физического развития при рождении менее 10-й перцентили по массо-ростовым показателям. Срок беременности на момент рождения составлял 37 нед и более. Группы девочек сопоставимы по паритету матерей, сроку и способу родоразрешения.

Исследование проводилось с согласия девочек-подростков и их родителей, в присутствии родителей по желанию девочек.

Содержание маркеров функционального состояния эндотелия и регуляторов ангиогенеза в сыворотке крови оценивали методом иммуноферментного анализа. Детекцию проводили на иммуноферментных анализаторах Wallac 1420 (Victor2) фирмы «PerkinElmer» (Финляндия) и Multiskan МСС/340 фирмы «Labsystems» (Финляндия). Уровень сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF-А) определяли с помощью коммерческих тест-систем BenderMedsystems (Австрия). Определение эндотелина-1 проводилось на аппарате Multiskan МСС/340 фирмы «Labsystems» (Финляндия) с помощью наборов Biomedica (Австрия) в соответствии с инструкциями производителя. Оценку уровня NO проводили на основании его стабильных метаболитов NO-эндогенного, NO-общего в периферической крови методом Грисса с помощью тест-систем Assay R&D Systems (США).

Иммуноцитохимическим методом проводилось исследование мазков-отпечатков со слизистой влагалища девочек-подростков. Исследовался уровень экспрессии рецепторов к эстрогенам типа α ESR1 (моноклональные антитела LabVision, ready-to-use) и рецепторов к прогестерону типа, А (PRa) и В (PRb) (моноклональные антитела LabVision, ready-to-use). Число рецепторов подсчитывали с использованием шкалы Hscore.

У всех пациенток были изучены полиморфизмы гена NOS3 786T>C, 894G>T и полиморфизмы гена ESR1 351A>G(полиморфизм Xbal, VNTR - variable note of tandems repiet) и 397T>C (полиморфизм Pvull, RELPs - restriction fragment length polymorphism). Для генотипирования исследовали венозную кровь. ДНК выделяли с помощью реагентов Проба ГС-Генетика (ООО НПО «ДНК-Технология») из 0,5 мл крови, взятой в пробирку с ЭДТА в качестве антикоагулянта.

Для оценки количества выделенной геномной ДНК использовали набор реагентов КВМ контроля взятия материала для метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (НПО «ДНК-Технология», Россия). В исследование брали не менее 1,0 нг геномной ДНК на реакцию. Генотипирование образцов по аллельным вариантам исследуемых генов проводили методом аллельспецифичной ПЦР в режиме реального времени со снятием кривых плавления продуктов амплификации. Анализ результатов ПЦР проводили в автоматическом режиме программного обеспечения детектирующего амплификатора ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология», Россия).

Статистический анализ данных осуществлялся с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0. Результаты обрабатывались методами вариационной статистики и представлены в виде M±m. Оценка достоверности различий средних величин и относительных показателей проводилась с использованием t-критерия (критерия Стьюдента). За уровень значимости в исследовании принято p<0,05. Различия между непараметрическими переменными проводились при помощи χ² Пирсона. Относительный риск оценивали по показателю отношения шансов (odds ratio - OR) с 95% доверительным интервалом (95% CI). Нулевая гипотеза отвергалась при р<0,05.

Тест на соответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга в обеих выборках проводили с помощью критерия χ² с использованием программы Hardy-Weinberg equilibrium.

Средний возраст обследованных девочек, страдающих АМК ПП, рожденных с нормальной массой тела, составил 14,18±0,31 года, рожденных с СЗРП - 13,50±0,24 года, в контроле - 14,61±0,41 года; р>0,05). Группы сопоставимы по возрасту.

Девочки, рожденные с СЗРП, к моменту пубертатного периода имели достоверно более высокий индекс массы тела, граничащий с нормой, и массу тела, но при этом наименьший рост по сравнению с контрольной группой. Это подтверждает теорию о внутриутробном программировании некоторых заболеваний у людей, рожденных с низкой массой тела, и в первую очередь ожирения [23].

Соматически девочки, страдающие АМК ПП, имели акцентуированный инфекционный фон (частые респираторные инфекции, ангины, воспаление среднего уха и гайморовых пазух носа) - в 46,2% случаев против 14,3% в контроле (р<0,05). Все девочки основной группы страдали вегетососудистой дистонией, в контроле - 12,0% пациенток, синдром дисплазии соединительной ткани определялся у 81,8% девочек основной группы и у 10% в контрольной. Патологией щитовидной железы страдали 4,5% девочек с АМК ПП, в контрольной группе данная патология не определялась. К распространенной соматической патологии у девочек, страдающих АМК ПП, относят заболевания желудочно-кишечного тракта - 40,2%. В группе контроля патологии желудочно-кишечного тракта не выявлено. Следует отметить, что все девочки с АМК ПП страдали различной степени тяжести железодефицитной анемией, а у 9,6% девочек отмечалась тромбоцитопения. В контроле показатели красной крови и уровня тромбоцитов были в пределах нормальных значений.

У девочек, страдающих АМК ПП, отмечалось раннее менархе (10,88±0,31 года - у девочек с СЗРП и 11,73±0,20 года - без СЗРП) в отличие от девочек группы контроля (12,4±0,51 года; р<0,01). У 85,5% девочек основной группы с СЗРП менархе дебютировало с развития АМК, и в 57,4% случаев эта патология носила рецидивирующий характер.

При исследовании функции эндотелиальной системы и факторов ангиогенеза выявлено, что у девочек, страдающих АМК ПП, рожденных с СЗРП, уровень VEGF-A в плазме крови значительно выше - 371,75 (219,9-565,7) нг/мл, чем у девочек, рожденных с нормальной массой тела, - 240,55 (134,3-431,3) нг/мл и девочек контрольной группы - 195,05 (78,21-301,85) нг/мл (р_1-3=0,0017). У девочек с маточными кровотечениями отмечались достоверно более низкие значения фактора вазоконстрикции эндотелина-1 (табл. 1). Отмечалось снижение концентрации общего NO (II) в периферической крови у девочек, страдающих АМК ПП (см. табл. 1).

Известно, что влияние эстрогенов на эндометрий осуществляется через взаимодействие со специфическими внутриядерными эстрогеновыми рецепторами [19, 20]. У девочек с АМК ПП, рожденных с СЗРП, по данным иммуноцитохимического исследования определялся достоверно более высокий локальный уровень экспрессии рецепторов ERα в слизистой влагалища - в 12 раз выше, чем у родившихся с нормальной массой тела, и в 24 раза выше контрольных значений (табл. 2). Уровень рецепторов к прогестерону (PR) в слизистой влагалища достоверно не различался в группах сравнения. Показатель ERα/PR был достоверно выше в группе девочек с АМК ПП: 5,86±0,8 против 1,88±0,17 в группе сравнения и 1,05±0,12 в контрольной группе.

Полученные при анализе результаты независимого распределения аллелей полиморфизмов генов NOS3 и ESR1 свидетельствуют, что характер распределения аллелей и генотипов по полиморфным вариантам гена NOS3 и ESR1 одинаков в обеих группах и соответствует равновесию Харди-Вайнберга.

Возможное влияние особенностей генотипа на функциональное состояние эндотелия оценивалось по общей, мультипликативной и доминантной моделям.

Анализ распределения генотипов по полиморфным вариантам генов NOS3 и ESR1 (табл. 3) показал достоверное увеличение частоты встречаемости генотипов, содержащих полиморфную аллель 786С гена NOS3Т>С в гомо- и гетерозиготном состоянии у девочек с маточными кровотечениями, рожденных с СЗРП (для гомозигот OR=2,03; 95% CI 1,12-3,68; p=0,046; для гетерозигот OR=1,68; 95% CI 1,09-2,60; p=0,046) (см. табл. 3).

Анализ распределения частот аллелей генов NOS3 и ESR1 также показал, что частота встречаемости аллеля 786С гена NOS3 достоверно выше у девочек, страдающих АМК ПП (OR=2,56; 95% CI 1,01-6,50; p=0,04) (табл. 4).

При анализе результатов генотипирования по исследуемым аллельным полиморфизмам генов NOS3 и ESR1 девочек основной группы, рожденных с нормальной массой тела, в сравнении с группой контроля также было выявлено статистически значимое повышение частоты встречаемости полиморфного аллелеля 786С в гене NOS3 786Т>C: (OR=3,46; 95% CI 1,16-10,34; p=0,02) (см. табл. 4).

Использование рецессивной модели наследования позволило выявить различия в частоте встречаемости генотипов по полиморфным локусам генов NOS3 и ESR1 в обследуемых группах девочек. Наличие в генотипе аллеля 786С гена NOS3 в гетеро- и гомозиготном состоянии чаще определяется у девочек, страдающих АМК, рожденных как с СЗРП (ОR=2,56; 95% CI 1,01-6,5; р=0,04) (см. табл. 4), так и с нормальной массой тела (ОR=3,46; 95% CI 1,16-10,34; р=0,02) (см. табл. 4), а носительство генотипа NOS3 786ТТ достоверно чаще встречается у девочек в контрольной группе (ОR=0,12, 95% CI 1,04-0,01; р=0,04). Таким образом, можно утверждать, что полиморфный аллель С в локусе 786 гена эндотелиальной NO-синтазы связан с повышенным риском развития у девочек АМК ПП.

Кроме того, при изучении доминантной модели генотипов NOS3 и ESR1 было выявлено, что у девочек, страдающих АМК ПП, рожденных с СЗРП, достоверно чаще определяется генотип ESR1 397СС с полиморфным локусом 397С в гене эстрогеновых рецепторов α (OR=4,58; 95% CI 0,97-21,68; p=0,04) (табл. 5). Таким образом, полиморфный аллель 397С в гене ESR1 имеет негативный эффект в отношении дополнительного риска развития маточных кровотечений пубертатного периода именно у девочек, рожденных с задержкой внутриутробного роста.

Рождение девочки с синдромом внутриутробной гипотрофии, развивающейся на фоне эндотелиопатии матери при вынашивании беременности, определяет внутриутробно программируемые особенности функционирования эндотелиальной системы девочки [24, 25].

В подростковом периоде на этапе становления менструальной функции данные нарушения функции эндотелия и регуляции ангиогенеза реализуются в развитии с менархе АМК ПП.

Внутриматочный гемостаз в период менструации достигается не только путем образования мелких тромбов в спиральных артериолах, но и за счет их сокращения [26]. Мощными вазоконстрикторами являются эндометриальные эндотелиальные факторы - эндотелины, трансформирующий фактор роста, факторы некроза опухоли. Во время маточного кровотечения происходит активация секреции провоспалительных цитокинов натуральными киллерами (NK), что приводит к запуску механизмов эндотелийзависимой вазоконстрикции под влиянием семейства эндотелинов. Нарушение соотношения модуляторов сосудистого тонуса при синдроме эндотелиальной дисфункции приводит к изменению синтеза и биодоступности тканевых факторов вазоконстрикции и вазодилатации. Так, в исследовании южно-корейских ученых показано, что уровень экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) в ткани эндометрия у пациенток с меноррагиями и миомой матки значительно выше по сравнению с нормальным эндометрием. Установлено, что меноррагии и дисменорея имеют тесную связь с продукцией eNOS [22, 27, 28].

Нарушение соотношения модуляторов сосудистого тонуса при синдроме эндотелиальной дисфункции приводит к изменению синтеза и биодоступности тканевых факторов вазоконстрикции и вазодилатации. В нашем исследовании продемонстрировано снижение уровня эндотелина-1 более чем в 5 раз у пациенток с АМК ПП, рожденных с СЗРП.

Отсутствие полноценной вазоконстрикции на фоне неконтролируемого ангиогенеза в эндометрии является важным механизмом развития АМК [29, 30]. Кроме того, у девочек, рожденных с СЗРП, отмечалось снижение синтеза эндотелием сосудов эндогенного NO, что может расцениваться как одно из проявлений синдрома эндотелиальной дисфункции. Дефицит или уменьшение биодоступности NO и связанное с этим нарушение соотношения модуляторов сосудистого тонуса приводят к снижению релаксации сосудов и вазоспазму, увеличению периферического сопротивления кровотоку, гипоперфузии тканей. Тканевая гипоксия является эпигенетическим механизмом, индуцирующим экспрессию ряда факторов, ведущих к эндотелиальной дисфункции (IL-6, TNFα, Flt-1 и др.) [13, 27, 29]. Реализация этих эффектов происходит у пациенток с определенными особенностями генотипа, заключающимися в ассоциации полиморфных генов, регулирующих функцию эндотелия [9, 10, 14].

Среди многих патогенетических механизмов нарушения менструального цикла обсуждают роль эстрогенов, проявляющих самые разнообразные эффекты. Репродуктивные эффекты эстрогенов, в том числе их влияние на эндометрий, хорошо изучены. В контексте АМК интерес представляют внегонадные эффекты эстрадиола. К одной из внегонадных локализаций ESR1 относится эндотелий сосудов [17]. В эндотелии сосудов расположены как ядерные ESR1, отвечающие за геномный ответ эстрогенопосредованного синтеза NO, так и мембранные ESR1, участвующие в быстрой трансдукции сигнала посредством активации киназного пути [19]. Им отводится роль в регуляции сосудистого тонуса посредством модуляции синтеза eNOS [17]. Согласно последним отчетам, биодоступность eNOS также регулируется посредством эстрогенов [22, 28].

Данные о межгенном взаимодействии генов NOS3 и ESR1 представлены в литературе недостаточно. Британские исследователи выяснили, что приблизительно на 1500 пар оснований выше гена NOS3 в хромосоме 7 расположены сайты транскрипции, которые регулируются, в том числе, уровнем экспрессии эстрогенов [31]. Таким образом, эстрогензависимый эффект биосинтеза eNOS, биодоступности эндогенного NO и вазоактивные эффекты эндотелиальной системы могут зависеть от полиморфизмов генов ESR1 и взаимодействия с генами NOS3.

Нами проведено исследование полиморфизмов генов 786T>C, 894G>T и полиморфизмы гена ESR1 351A>G(Xbal) и 397T>C (Pvull) и некоторых маркеров эндотелиальной дисфункции и ангиогенеза у девочек, рожденных с СЗРП. Анализ распределения частот аллелей генов NOS3 и ESR1 показал, что частота встречаемости аллеля С гена NOS3 786Т>С достоверно выше у девочек, страдающих АМК, которые родились с СЗРП. В последних работах показано, что наличие аллеля С в промоторе гена 786Т>С NOS3 приводит к снижению активности еNOS и уменьшает ее экспрессию в тканях, в результате чего снижаются синтез и высвобождение NO, что и определяет синдром эндотелиальной дисфункции [14, 17, 22, 24]. Сообщается, что носители аллеля С гена 786С NOS3 имеют более низкий уровень нитритов в крови, у них снижена реакция компенсаторой активации кровотока в плечевой артерии на введение ацетилхолина и эстрогенов [25]. Метаанализ из 20 исследований, включающий 11 236 пациенток, продемонстрировал связь полиморфного аллеля С в гене 786 Т>С NOS3 с наличием повышенного тонуса коронарных артерий, склонностью к коронароспазму и извращенной реакцией на введение ацетилхолина, что может служить основой развития ишемической болезни сердца и острого коронарного синдрома (OR 1,32, 95% CI 1,07-1,28; p=0,001) [13]. Таким образом, наличие в генотипе полиморфного аллеля 786С гена NOS3 в гетеро- или гомозиготном состоянии, ассоциированного с риском синдрома эндотелиальной дисфункции, достоверно чаще определяется у девочек, страдающих АМК, рожденных с СВРП.

Кроме того, у девочек, страдающих АМК ПП, рожденных с СЗРП, чаще определяется генотип ESR1 Pvull-CC в гене эстрогеновых рецепторов альфа. В работах, посвященных изучению влияния полиморфизма pVull ESR1 на дисфункцию эндотелия при сердечно-сосудистых заболеваниях, подчеркивается, что генотип ESR1 Pvull-CC несет повышенный риск формирования эндотелиальной дисфункции и клинически чаще проявляется увеличением систолического артериального давления, толщины интимы и частоты ишемической болезни сердца у женщин [19, 26]. В работах других авторов подчеркивается, что генотип ESR1 Pvull-CC значительно уменьшает NO-зависимое увеличение скорости кровотока и биодоступность NO [14, 32].

Ряд исследователей [27, 28] полагают, что синдром эндотелиальной дисфункции вызывает снижение кровотока в строме эндометрия и формирование тканевой гипоксии. Тканевая гипоксия запускает развитие аномального ангиогенеза за счет образования клеток, интенсивно экспрессирующих сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). C. Lоcwood и соавт. [12, 27] показали, что тканевая гипоксия, связанная с ингибированием активности кровотока в эндометрии и гиперпродукцией активных форм кислорода при синдроме эндотелиальной дисфункции, увеличивает синтез ангиогенных факторов роста, таких как VEGF-A в HESC и ангиопоэтин-2 (Ang-2) в эндотелиальных клетках эндометрия, в то время как синтез ангиопоэтина-1 в HESC клетках уменьшается. В результате возрастает хрупкость сосудистой стенки, происходит активация неконтролируемого ангиогенеза в эндометрии, что влечет за собой развитие АМК.

В нашем исследовании определялось повышение уровня VEGF-A у девочек с АМК более чем в 3 раза по сравнению с контрольными значениями. Увеличение продукции проангиогенных факторов роста на фоне снижения выработки ингибиторов ангиогенеза свидетельствует о стремлении организма нивелировать нарушения васкуляризации эндометрия, обусловленные эндотелиальной дисфункцией.

Проангиогенный статус компенсаторно поддерживается высокой экспрессией ESR1 в тканях половых органов у девочек с АМК ПП, рожденных с СЗРП. В нашем исследовании у них определялся достоверно гораздо более высокий локальный уровень экспрессии рецепторов ESR1 в слизистой влагалища - в 12 раз выше, чем у родившихся с нормальной массой тела, и в 24 раза выше контрольных значений. Показатель отношения ERα/PR был достоверно выше в группе девочек с АМК П.П. Стратегия формирования выраженного проангиогенного статуса является, по-видимому, одним из компенсаторных механизмов сохранения оптимальной тканевой перфузии в эндометрии при нарушении условий ее существования [32, 33].

Таким образом, маточные кровотечения пубертатного периода у девочек, рожденных от матерей с осложненным течением гестации в виде преэклампсии, хронической плацентарной недостаточности с исходом в СЗРП, могут иметь в основе патогенеза синдром эндотелиальной дисфункции с нарушением регуляции ангиогенеза и сосудистого тонуса. Дисбаланс активности вазоконстрикторов и вазодилататоров микроциркуляторного русла на фоне активации ангиогенеза и повышения уровня экспрессии рецепторов к эстрадиолу у девочек, рожденных с внутриутробной задержкой роста, является одним из механизмов рецидивирующего характера АМК.

Дальнейшее изучение молекулярно-генетических механизмов реализации данной патологии расширит возможности прогнозирования и профилактики маточных кровотечений у девочек-подростков [34].

Конфликт интересов отсутствует.