Преимплантационный генетический скрининг при выборе эмбриона

В настоящее время технологии лечения бесплодия развиваются и находят все более широкое применение. Приоритетной целью репродуктологов во всем мире является рождение здорового ребенка. В связи с этим встает вопрос о повышении эффективности процедур ВРТ, который напрямую связан с вопросом селекции эмбриона для переноса в матку.

На сегодняшний день мировым стандартом отбора эмбрионов для большинства лабораторий является морфологическая оценка по ряду критериев, таких как количество клеток, вакуолизация, фрагментация бластомеров, размер и наличие ядер, однородность цитоплазмы, время компактизации эмбриона, время формирования и размеры бластоцели и трофобласта и т. д. [1]. Однако при всем многообразии оцениваемых факторов нормальная морфология эмбриона далеко не всегда соответствует нормальному набору его хромосом [1, 2]. По данным литературы [3, 4], среди ооцитов порядка 40% несут хромосомную патологию: нуллисомии, дисомии, трисомии. Также показано, что около 57% эмбрионов анеуплоидны по разным хромосомам к 5-му дню развития [4]. Выбор морфологически нормальных сперматозоидов также не дает гарантии, что эмбрион будет содержать эуплоидный набор хромосом [5].

Одним из частых осложнений ВРТ является невынашивание беременности, при этом, по разным данным [6], более чем в 50% случаев причиной замирания беременности или выкидыша служат хромосомные аномалии эмбриона. Также отмечены различные варианты хромосомных аномалий у детей, рожденных с применением ВРТ [7, 8].

Ю. Верлинским [9] впервые было показано, что по единственной клетке можно судить о генетическом здоровье всего эмбриона. В начале 90-х годов XX века была создана технология, позволяющая до имплантации проверять эмбрионы на наличие анеуплоидий — нарушений количества хромосом, которые приводят к рождению больного ребенка или к выкидышу [10]. Так появился преимплантационный генетический скрининг анеуплоидий (ПГС).

ПГС чаще всего проводят на те хромосомы, анеуплоидии по которым могут привести к рождению больного ребенка (сублетальная патология) либо являются наиболее частыми причинами выкидышей или замирания беременности (летальные анеуплоидии) [11]. К сублетальным нарушениям относят: синдром Шерешевского—Тернера (кариотип 45, Х); синдром Кляйнфельтера (кариотип 47, ХХY); синдром полисомии Y-хромосомы (мужчины с кариотипом 47, ХYY либо большим количеством Y-хромосом); синдром полисомии Х-хромосомы (женщины с кариотипом 47, ХХХ либо большим количеством Х-хромосом); синдромы Патау, Эдвардса, Дауна (трисомии по хромосомам 13, 18, 21 соответственно). В остальных случаях анеуплоидии могут приводить к замиранию беременности в ранних сроках (трисомия по хромосомам 16, 22, триплоидия, тетраплоидия) [12] либо к неудаче имплантации (нуллисомия по Х-хромосоме, гаплоидия, моносомии и нуллисомии по аутосомам и др.).

По данным последних исследований [13], генетическое тестирование повышает эффективность ЭКО только для некоторых групп пациентов и поэтому на сегодняшний день методы ПГС применяются исходя из определенных показаний.

Цель настоящей работы — сравнить данные морфологической оценки эмбрионов и результаты ПГС.

В исследование были включены 116 семейных пар с нормальным кариотипом, которым с марта 2012 г. по май 2015 г. проводился ПГС в Медицинском центре «Авиценна». Диагностика эмбрионов проводилась пациентам как по показаниям, рекомендованным консорциумом по ПГС Европейского сообщества репродуктологии и эмбриологии человека (ESHRE) [14], так и по желанию, в качестве подстраховки от возможных неудач.

Все супружеские пары, вступающие в программу ЭКО-ПГД, проходили обследование, согласно приказу МЗ РФ № 107н [15], и обязательное кариотипирование по внутренним стандартам клиники [16]. Семейным парам проводился скрининг анеуплоидий по 5, 7, 10 парам хромосом методом FISH.

Для проведения ПГС использовали свежие или размороженные криоконсервированные эмбрионы на 3-и или 5-е сутки развития. Перед биопсией проводили морфологическую оценку эмбрионов согласно шкале [17]. Для проведения сортировки по качеству эмбрионов были выделены три группы: «отличные», «хорошие» и «плохие» эмбрионы (табл. 1).

К биопсии не допускали эмбрионы, имеющие плохую оценку и малое количество бластомеров, а также ранние бластоцисты, так как трофобласт в них не доступен для биопсии. На 3-и сутки развития получали 132 бластомера, на 5-е сутки развития — 2—6 клеток трофобласта.

Для проведения ПГС методом FISH использовали центромерные, теломерные и локусспецифичные ДНК-пробы разных производителей («Abbott Labs», США; «Cytocell», Великобритания; «MetaSystems», Германия; «Cymogen DX», США).

Для проведения ПГС на эмбрионах использовали наборы на 5, 7, 10 хромосом [18]. В набор на 5 хромосом входят 13, 18, 21, X, Y; в набор на 7 хромосом входят 13, 16, 18, 21, 22, X, Y; в набор на 10 хромосом входят 11, 13, 14, 15, 16, 18, X, Y.

Все выявленные хромосомные аномалии были разделены на две группы: «сублетальные» и «летальные» нарушения. Сублетальные нарушения — анеуплоидии, присутствие которых в эмбрионе в регулярной или мозаичной форме может привести к рождению больного ребенка. Летальные нарушения — это нарушения, не приводящие к родам (регулярные трисомии хромосом 11, 14, 15, 16, 22, все моносомии аутосом, нарушения плоидности и сочетанные анеуплоидии).

Всего были обследованы 116 семейных пар. Средний возраст пациенток составил 34,4 года, среднее число полученных яйцеклеток — 16, среднее количество зигот — 5,7, количество перенесенных эмбрионов — 1,4, частота наступления беременности — 31,1%.

Данные по циклам без проведения ПГС (n=230) составили контрольную выборку: средний возраст пациенток — 32,1 года, среднее количество полученных яйцеклеток — 12,5, среднее количество зигот — 8, количество перенесенных эмбрионов — 1,5, частота наступления беременности — 36,3%.

Всего было исследовано 688 эмбрионов, из них 48,8% имели нормальный хромосомный набор. Частота применения ПГС с анализом 5, 7, 10 хромосом составила 42,8, 42,2 и 14,9% соответственно. Из всех состоявшихся переносов эмбрионов после каждого четвертого наступила и нормально развивалась беременность, завершившаяся родами (25%).

Мы проанализировали долю нормальных кариотипов в зависимости от количества тестируемых хромосом и получили определенную закономерность: чем больше хромосом включено в анализ, тем меньше доля нормальных кариотипов (р<0,001) (табл. 2).

Так, при анализе 5 хромосом доля эмбрионов с нормальным набором хромосом составляет 57,3%, при анализе 7 хромосом — 46,9%, а при анализе 10 хромосом — всего 30,1%. Полученные данные в целом согласуются c результатами ретроспективного анализа циклов ПГС на разное количество хромосом, проведенное американскими исследователями D. Wells и S. Munné [19]: тест на 5 хромосом выявляет только 28—31% хромосомных аномалий, на 9 хромосом — 70—72%, при анализе 12 хромосом выявляется до 80% анеуплоидий.

Все эмбрионы на 3-и и 5-е сутки развития были поделены на три группы в зависимости от морфологической оценки (см. табл. 1). Проведена оценка доли нормальных эмбрионов и носителей анеуплоидий на 3-и и 5-е сутки развития в группах эмбрионов разного качества и обнаружена корреляция между морфологической оценкой эмбрионов и на 3-й, и на 5-й день развития, и результатами ПГС. При оценке корреляции по Спирмену на 3-й день развития получен коэффициент корреляции 0,112 (р<0,001) — корреляция очень слабая, но при этом высокодостоверная. Корреляция на 5-й день развития между морфологической оценкой и результатами ПГС оказалась более сильной и достоверной — коэффициент корреляции составил 0,275 (р<0,001). Выполнено сравнение доли разных кариотипов (нормальный, сублетальный, летальный) в группах эмбрионов, разделенных по морфологической оценке на три категории (отличные, хорошие, плохие). Сравнение проводилось с помощью таблиц сопряженности по критерию χ², различие достоверно: р=0,025 на 3-й день развития эмбрионов, р<0,001 на 5-й день развития.

Доля эуплоидных эмбрионов последовательно снижается в ряду морфологических оценок (отличные — 57%, хорошие — 49%, плохие — 40%). Процент сублетальных эмбрионов в этом же ряду не меняется, а доля летальных эмбрионов, напротив, нарастает: 30,8% среди эмбрионов отличного качества, 38,1% при оценке «хороший» и 48,3% при оценке «плохой» (рис. 1).

Данное соотношение еще более ярко выражено при рассмотрении эмбрионов на 5-е сутки развития (рис. 2): доля нормальных эмбрионов последовательно снижается в ряду морфологических оценок (отличные — 80%, хорошие — 59%, плохие — 39%). Процент сублетальных анеуплоидий в этом же ряду остается практически неизмененным, а доля летальных анеуплоидий нарастает: 11% среди эмбрионов отличного качества, 29% при оценке «хороший» и 48% при оценке «плохой».

Полученные нами данные сопоставимы с результатами, опубликованными группой бразильских исследователей в 2015 г.: они показали, что морфология бластоцисты, в частности, внутренней клеточной массы, связана с набором хромосом в эмбрионе [20]. Так, при анализе 9 хромосом на 3-и сутки развития авторы обнаружили, что среди эмбрионов, которые к 5-му дню достигли стадии бластоцисты, доля эуплоидных достоверно выше. Авторы книги «Новое в переносе эмбриона» [21] полагают, что хромосомные аномалии бластомера могут влиять на задержку развития бластоцисты. В итальянском исследовании [22], напротив, не было найдено корреляции между шестнадцатью морфокинетическими параметрами развития эмбриона in vitro и анеуплоидиями. Авторы считают, что морфокинетические параметры не могут быть использованы для выбора эуплоидных бластоцист у пациентов с плохим прогнозом.

В нашей работе была обнаружена корреляция между результатами ПГС и морфологической оценкой эмбрионов и на 3-й, и на 5-й день развития эмбриона. Так, при наилучшем качестве эмбрионов по морфологической оценке на 3-й и 5-й дни развития доля сублетальных анеуплоидий среди эмбрионов практически неизменна, доля летальных анеуплоидий на 5-й день развития в 3 раза меньше, чем на 3-й день развития (11% против 31%), а доля генетически нормальных эмбрионов, наоборот, выше на 5-е сутки развития (80% против 57%). При хорошем качестве эмбрионов по морфологической оценке на 3-й и 5-й дни развития различия есть, а при плохом качестве эмбрионов на 3-й и 5-й дни развития различия в долях разных анеуплоидий и нормальных эмбрионов отсутствуют (см. рис. 1 и 2).

Исходя из этих результатов, наибольшая вероятность переноса эмбриона с нормальным набором хромосом получится, если будет взят эмбрион наилучшего качества по морфологической оценке на 5-й день развития: 4 эмбриона из 5 взятых будут иметь нормальный набор хромосом. На практике это означает, что если ориентироваться только на морфологическую оценку эмбриона на 5-й день развития и брать для переноса эмбрионы отличного и хорошего качества, то в 30% случаев в матку будет перенесен эмбрион с летальной или сублетальной хромосомной аномалией, что может служить причиной ненаступления, невынашивания беременности или рождения больного ребенка.

1. При проведении ПГС методом FISH доля эмбрионов с нормальным набором хромосом убывает с увеличением числа анализируемых хромосом.

2. Доля эмбрионов с нормальным набором хромосом достоверно выше среди эмбрионов отличного качества на 3-й и 5-й дни развития.

3. Доля эмбрионов с сублетальными анеуплоидиями не зависит от морфологической оценки эмбриона.

4. Если основываться только на морфологической оценке, то в 30% случаев для переноса будет выбран эмбрион с летальной или сублетальной хромосомной аномалией.

Конфликт интересов отсутствует.

Статья опубликована на средства ЗАО Медицинский центр «АВИЦЕННА».