Нарушение репродуктивного здоровья мужчин является одной из актуальных проблем медицины во всем мире. К сожалению, несмотря на выдающиеся достижения репродуктивной медицины, частота мужского бесплодия не только не снижается, но и имеет тенденцию к росту. В России, например, прирост абсолютного числа пациентов с мужским бесплодием за 10 лет составил 67,7% [1]. Особенностью патоспермии в России является существенное преобладание среди этиологических факторов инфекционно-воспалительных и аутоиммунных процессов репродуктивной системы по сравнению со странами Европы и Северной Америки [2].

Наиболее часто при воспалительных заболеваниях как у мужчин, так и у женщин из бесплодных пар выявлялась в виде моноинфекции или микстинфекции Trichomonas vaginalis [3] (род Trichomonas, семейство Trichomonadidae, отряд Trichomonadida, класс Parabasalea, тип Polymastigota) [4, 5]. Что не является случайностью, учитывая широкую распространенность этого патогена. По данным ВОЗ, в мире урогенитальным трихомониазом ежегодно заболевают около 200 млн человек. Считается, что около 10% населения Земли инфицированы T. vaginalis [5]. Наиболее широко трихомониаз распространен в Африке, Южной и Юго-Восточной Азии и странах с активными миграционными процессами [6]. По данным официальной статистики, несмотря на некоторую тенденцию к снижению, уровень заболеваемости трихомониазом в России в XXI веке высок и колеблется около 200—250 случаев на 100 000 населения [4, 7]. Количество пациентов кожно-венерологических диспансеров с инфекцией, вызванной T. vaginalis, составляет около 60% [8]. Ненамного лучше ситуация и у наших ближайших соседей: в Республике Беларусь уровень заболеваемости трихомониазом чуть ниже 200 на 100 000 населения [9], в Республике Казахстан — около 100 на 100 000 населения [10].

Исследования показали, что урогенитальный трихомониаз достаточно часто (20—40%) ассоциируется с субфертильностью и инфертильностью у мужчин [5]. При обследовании мужчин с хроническим урогенитальным трихомониазом патоспермия наблюдалась в 62% случаев, чаще всего авторы отмечали нарушение подвижности и жизнеспособности сперматозоидов [11].

В большинстве случаев (93%) трихомонадная инфекция у бесплодных мужчин протекает малосимптомно или вообще бессимптомно [12], что в настоящее время стало характерной особенностью этой инфекции [8, 11].

Особая острота проблемы трихомонадной инфекции обусловлена высокой частотой встречаемости метронидазолустойчивости, которая составляет от 5 до 20% штаммов, резистентных к препаратам 5’-нитроимидазольного ряда. К 2010 г. было известно о более 120 метронидазолустойчивых штаммах T. vaginalis, выделенных в разных странах мира [9].

Кроме того, трихомонады способны активно воздействовать на разные звенья иммунной системы организма-хозяина, значительно снижая ее эффективность [13—16]. Определенные сложности в последнее десятилетие возникают и в связи с широким распространением метаболически малоактивной округлой формы патогена, лишенной органоидов движения [7], которая плохо поддается диагностике и лечению [4].

Известно, что продуцируемые микроорганизмами вещества могут напрямую повреждать сперматозоиды [17—19], хроническая трихомонадная инфекция не является исключением и может приводить к повреждению сперматозоидов на ультраструктурном уровне [20]. Необходимо отметить, что негативное влияние инфекции на мужскую фертильность может наблюдаться и после элиминации возбудителя из организма, что объясняется, вероятно, сохранением неспецифического воспалительного процесса [20].

Все это делает актуальным всестороннее изучение T. vaginalis и особенностей ее воздействия на репродуктивную систему человека в общем и, в частности, на сперматозоиды.

Экспериментальное исследование влияния продуктов секреции T. vaginalis на человеческие сперматозоиды стало целью нашей работы.

В качестве биологического материала для выделения T. vaginalis использовали сперму пациентов с диагнозом по МКБ-10 А59.0 (урогенитальный трихомониаз). Всем пациентам дополнительно проводили исследование эякулята по протоколу ВОЗ с тестом на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (HOS-тест). Некоторые характеристики исследуемого биологического материала приведены в табл. 1.

В работе использовали бессывороточную селективную питательную среду для культивирования T. vaginalis (СВТ) производства ОНТ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Состав СВТ (на 1 л готовой среды): NaCl — 5,0 г, K2HPO4 — 2,0 г, KH2PO4 — 1 г, мальтоза — 6,0 г, солянокислый цистеин — 1,2 г, аскорбиновая кислота — 0,24 г, плацентарный бульон — 100,0 мл, дрожжевой экстракт — 11,0 г, аминопептид — 25 мл, лизат клеточной линии L-41 — 24 мл, бензилпенициллин — 1 000 000 МЕ/л, стрептомицин — 2 г/л, линкомицин — 0,57 г/л, флуконазол — 0,066 г/л [21].

Продукты секреции T. vaginalis готовили для эксперимента по следующей схеме:

1. В log-фазе роста проводили сбор Trichomonas vaginalis с последующей однократной промывкой сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) (NaCl — 8,0 г/л, KCl — 0,4 г/л, СаСl2 — 0,14 г/л, MgSO4 ·7H2O — 0,1 г/л, MgCl2·6H2O — 0,1 г/л, Na2HPO4·2H2O — 0,06 г/л, KH2PO4 — 0,06 г/л, D-глюкоза — 1,0 г/л, NaHCO3 — 0,35 г/л [22].

2. Отмытые T. vaginalis ресуспендировали в 1,0 мл HBSS (до концентрации 1,0·10⁷/мл) и инкубировали 60 мин при 37 °C (для максимального накопления продуктов секреции патогена) [13, 15, 16].

3. После инкубации супернатант культуральной среды центрифугировали 10 мин при 10 000 g, а затем пропускали через фильтр (диаметр 0,22 мкм) [13].

Отфильтрованный раствор продуктов секреции патогена использовали для дальнейших экспериментов.

В качестве тестового материала в экспериментах использовали сперматозоиды здоровых мужчин (n=5, возраст 24,4±1,68 года) с подтвержденной фертильностью (наличие ребенка в возрасте от 2 до 11 мес) и заключением по спермограмме «нормозооспермия» (табл. 2).

Сперматозоиды для эксперимента выделяли после полного разжижения эякулята центрифугированием в градиенте перколла. Все растворы перколла готовили на HBS + BSA буфере рН 8,0 (0,13 М NaCl, 0,004 М KCl, 0,001 М CaCl2, 0,0005 М MgCl2, 0,014 М фруктозы, 0,01 М N2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) [23].

Отмытые таким образом сперматозоиды разводили жидкостью Гиние до концентрации 2,0·10⁶/мл. Жидкость Гиние готовили на основе свежего раствора Тироде с фруктозой по следующей схеме [23]:

1. Готовили раствор Тироде I (NaCl — 20%, CaCl — 0,5%, KCl — 0,5%, MgCl2 — 0,25%).

2. Готовили раствор Тироде II (NaHCO3 — 0,5%, Na3PO4 — 0,25%).

3. Смешивали 4 мл раствора Тироде I в 50 мл дистиллированной воды и 2 мл раствораТироде II в 50 мл дистиллированной воды.

4. В полученный раствор добавляли 1,5 г фруктозы в 33 мл дистиллированной воды.

Подготовленные сперматозоиды использовали для дальнейших экспериментов ex tempore.

Исследование двигательных характеристик сперматозоидов проводили по стандартной методике в соответствии с рекомендациями Руководства ВОЗ 4-го издания [24].

Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов и оценку его результатов проводили по стандартной методике в соответствии с рекомендациями Руководства ВОЗ 5-го издания [25].

Для статистической обработки результатов эксперимента проводили расчет среднего значения и стандартного отклонения [26]. Дизайн эксперимента предусматривал получение сверхмалых выборок, поэтому для выявления статистически значимых различий полученных результатов использовали непараметрические методы анализа, а именно U-критерий Вилкоксона—Манна—Уитни [27], так как в нашем случае критерий знаков и T-критерий Вилкоксона—Манна—Уитни из-за методических ограничений не позволяли корректно оценить полученные данные [28].

В первом опыте (опыт-1) к 100 мкл подготовленных сперматозоидов добавляли 100 мкл продуктов секреции округлой формы T. vaginalis. Во втором опыте (опыт-2) к 100 мкл подготовленных сперматозоидов добавляли 100 мкл продуктов секреции грушевидной (жгутиковой) формы T. vaginalis.

Параллельно опытам ставили три контроля. Чтобы исключить влияние компонентов сбалансированного солевого раствора Хенкса, в первом контроле (контроль-1) к 100 мкл подготовленных сперматозоидов добавляли 100 мкл HBSS. Для исключения влияния компонентов среды для выделения трихомонад во втором контроле (контроль-2) к 100 мкл подготовленных сперматозоидов добавляли 100 мкл стерильной среды СВТ. Для общего контроля (контроль-3) к 100 мкл подготовленных сперматозоидов добавляли 100 мкл 0,85% раствора хлорида натрия.

Все контрольные и опытные образцы параллельно инкубировали 120 мин в термостате при температуре 37 °C. Общий план проводимого эксперимента представлен в виде схемы (см. рисунок).

После инкубации проводили исследование двигательных характеристик сперматозоидов в контрольных и опытных образцах (табл. 3).

Во всех контрольных группах и в первой опытной группе статистически значимых различий выявить не удалось. Вторая контрольная группа показала статистически значимые отличия как от всех контрольных групп, так и от первой опытной группы. Так, сперматозоидов с подвижностью категории, а и a+b во второй группе было в среднем в 3 раза меньше, чем в контролях и в первой опытной группе.

Скорость сперматозоидов в среднем была почти в 2 раза ниже во второй опытной группе по сравнению и с контрольными группами, и с первой опытной группой.

Для оценки влияния продуктов секреции клинических изолятов T. vaginalis на функциональное состояние мембран сперматозоидов мы использовали тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (HOS-тест).

Полученные результаты (табл. 4) не выявили статистически значимых различий между контрольными группами. Результаты, полученные в эксперименте с первой опытной группой, статистически значимо отличались от результатов контрольных групп. Еще более выраженные отличия от контрольных групп наблюдались во второй экспериментальной группе (средние значения отличались более чем в 3,5 раза) (см. табл. 4).

Исследования T. vaginalis и факторов ее вирулентности представляют весьма сложную задачу. Геном этого патогена кодирует около 60 000 белков, что почти в 2 раза больше, чем у человека. Кроме того, часть генома T. vaginalis приобретена в ходе эволюции у прокариот, много транспозонов, встроенных элементов вирусных геномов, что свидетельствует о межвидовом обмене, который связан, вероятно, со способностью патогена фагоцитировать сопутствующую микрофлору [5]. Трихомонады гетерогенны по набору патогенных свойств, в настоящее время известно 8 серотипов и около 120 разновидностей T. vaginalis, которые отличаются антигенными свойствами, культуральными характеристиками, вирулентностью, инвазивностью, способностью к адгезии [5]. Доказано, что T. vaginalis может существовать в разных формах: грушевидной (жгутиковой), амебовидной и округлой (шаровидной) [4]. Причем патогенными для человека являются все три формы [29].

При экспериментальных исследованиях, проведенных J. Roh и соавт. [15], были получены убедительные доказательства токсического влияния продуктов секреции T. vaginalis на мышиные сперматозоиды: по сравнению с контролем наблюдалось двукратное снижение общей подвижности сперматозоидов, почти трехкратное снижение количества активно подвижных сперматозоидов, почти двукратное ухудшение показателей HOS-теста.

Нами в большей части экспериментов на человеческих сперматозоидах (экспериментальная группа-1) статистически значимых отличий от контрольных групп при изучении двигательных характеристик сперматозоидов выявлено не было. И лишь частично (экспериментальная группа-2) были выявлены статистически значимые признаки токсического воздействия продуктов секреции T. vaginalis на двигательные характеристики сперматозоидов (подвижность категории а, a+b, скорость). На наш взгляд, это обусловлено не межвидовыми различиями сперматозоидов, использованных в экспериментах (мышиные и человеческие), а разными формами трихомонад. В экспериментах J. Roh и соавт. [15] для получения продуктов секреции использовались музейные штаммы T. vaginalis (изолят Т016) «классической» грушевидной (жгутиковой) формы, а нами были использованы клинические изоляты T. vaginalis как грушевидной (опыт-2), так и более часто встречающейся округлой формы (опыт-1).

Оказалось, что 100% клинических изолятов T. vaginalis, продукты секреции которых не вызывали значимого воздействия на двигательные характеристики сперматозоидов, были из экспериментальной группы-1 (округлые формы). Объяснение этому мы видим в различии метаболической активности грушевидных и округлых форм T. vaginalis. Округлые формы характеризуются снижением физиологической активности патогена [29] и не вырабатывают или, что более вероятно, вырабатывают относительно мало токсичных для сперматозоидов экскреторных продуктов, влияющих на подвижность. Поэтому статистически значимое снижение двигательных характеристик сперматозоидов мы наблюдали только в экспериментальной группе-2, содержавшей клинические изоляты T. vaginalis грушевидной формы, обладающей высокой метаболической активностью.

Для оценки функционального состояния мембран сперматозоидов мы использовали HOS-тест. Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов успешно используется у разных видов млекопитающих и птиц (свиньи, слоны, обезьяны, крысы, эму [30], буйволы, бараны, жеребцы, собаки [31], быки [32]), причем со схожими значениями осмолярности, что свидетельствует об универсальности и информативности HOS-теста при оценке функционального состояния сперматозоидов [33, 34] и прогнозирования их жизнеспособности [35]. Клинические наблюдения показали высокую корреляцию результатов HOS-теста и ВРТ (искусственная инсеминация) [36], а также корреляцию результатов HOS-теста и прогноза развития привычного невынашивания беременности [37], что подтверждает значимость этого исследования при оценке фертильности сперматозоидов. Также HOS-тест показал высокую информативность при оценке фертильности сперматозоидов в экспериментальных условиях, моделирующих бактериальную контаминацию спермы [38] и различные токсические воздействия [39, 40].

Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов оказался более чувствительным и в нашем экспериментальном исследовании. HOS-тест статистически значимо реагировал как на секреторные продукты округлых форм (менее выраженно), так и на секреторные продукты грушевидных форм (более выраженно) T. vaginalis.

Таким образом, можно считать установленным факт токсического воздействия продуктов секреции и грушевидных (жгутиковые), и округлых форм T. vaginalis.

Секреторные продукты метаболически более активных грушевидных форм T. vaginalis оказывали и более сильное (по сравнению с округлыми формами) повреждающее действие на человеческие сперматозоиды, что выражалось в статистически значимом снижении двигательных характеристик сперматозоидов и нарушении функционального состояния мембран сперматозоидов (неблагоприятные результаты HOS-теста).

Округлая форма, хотя появляется преимущественно при неблагоприятных условиях и характеризуется снижением физиологической активности патогена, но не является стадией покоя или дегенеративной формой [29]. Результаты наших экспериментов показали, что секреторные продукты округлых форм T. vaginalis способны оказывать неблагоприятное воздействие на сперматозоиды человека, но значительно менее выраженное, чем грушевидные формы.

В ряде случаев инфекции репродуктивной системы мужчин, обусловленной округлыми формами T. vaginalis, двигательные характеристики сперматозоидов в течение некоторого времени могут сохраняться на уровне нормальных величин. Но учитывая, что при адаптации патогена к изменению условий внешней среды разные формы T. vaginalis могут переходить друг в друга [9, 41], следует считать опасными в плане неблагоприятного воздействия на фертильность сперматозоидов любые формы патогена.

Для раннего выявления повреждающего действия секреторных продуктов как грушевидных, так и округлых форм T. vaginalis целесообразно использовать тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов, который показал более высокую чувствительность к токсичным продуктам патогена. На наш взгляд, в связи с высоким риском развития нарушения функционального состояния мембран сперматозоидов и для контроля над эффективностью проводимой терапии необходимо включать тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (HOS-тест) наряду со стандартной спермограммой в план исследования фертильности сперматозоидов мужчин с трихомонадной инфекцией в анамнезе.

Конфликт интересов отсутствует.

Источник финансирования: ООО «РЕПРОДИАМЕД» (Астрахань, Российская Федерация).