Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) является аутосомно-рецессивным заболеванием, причина которого кроится в дефекте ферментов или транспортных белков, необходимых для синтеза кортизола в коре надпочечников. Наиболее частым вариантом ВДКН является недостаточность фермента 21-гидроксилазы, которая в классическом варианте встречается в разных популяциях с частотой приблизительно 1:10 000-1:18 000 новорожденных [1-4]. Избыток надпочечниковых андрогенов в пренатальном периоде приводит к разной степени вирилизации наружных половых органов у плодов с кариотипом 46ХХ. Для восстановления правильной структуры наружных гениталий девочкам с ВДКН проводится реконструктивное хирургическое лечение - феминизирующая пластика, которая выполняется в один или два этапа в зависимости от степени маскулинизации половых органов [5-7]. При проведении двухэтапной пластики создание входа во влагалище (интроитопластика) выполняется в пубертатном возрасте обычно через 1,5-2 года после менархе, когда окончательно заканчивается формирование влагалища и достигается оптимальная эстрогенизация слизистой влагалища [5, 6, 8, 9].
Пубертатный возраст является критическим моментом при ведении пациенток с ВДКН, учитывая физиологические гормональные изменения организма в этот период, которые могут снижать терапевтической эффект глюкокортикоидов, усугублять тяжесть надпочечниковой и яичниковой гиперандрогении и соответственно снижать продукцию эстрогенов [10-14]. Гипоэстрогенизм при неудовлетворительной компенсации заболевания в течение пре- и пубертатного периодов обусловлен супрессией продукции гонадотропинов, а соответственно и яичниковых эстрогенов избытком надпочечниковых андрогенов. В результате у таких пациенток отмечается задержка полового развития (позднее развитие молочных желез, уменьшение размеров матки, первичная аменорея), а также снижение эстрогенизации наружных половых органов, что в целом может приводить к неудовлетворительным результатам феминизирующей пластики и снижению фертильности в репродуктивном возрасте. Осложнение оперативного лечения, такое как стеноз входа во влагалище (интроитуса), у этих пациенток встречается достаточно часто и требует в дальнейшем проведения повторных интроитопластик и/или бужирований [9, 15-17]. Остается нерешенным вопрос, есть ли другие причины снижения эстрогенизации внутренних и наружных половых органов у пациенток с ВДКН, кроме декомпенсации заболевания. Возможно ли снижение местной эстрогеновой насыщенности гениталий при условии удовлетворительного контроля гиперандрогении?
Косвенными признаками удовлетворительной эстрогенизации внутренних гениталий могут служить регулярный менструальный цикл и ультразвуковые размеры матки, соответствующие хронологическому возрасту и стадии пубертата. По мере полового созревания и повышения уровня эстрогенов в крови матка претерпевает ряд изменений и увеличивается в объеме [18-20]. Методов, позволяющих достоверно определить уровень местной эстрогенизации наружных гениталий, помимо визуального гинекологического осмотра, в настоящий момент немного. Определение клеточного состава вагинального мазка, широко применявшееся до появления гормональной диагностики, в настоящий момент используется для диагностики урогенитальной атрофии у женщин менопаузального возраста, динамического контроля после лечения гормональными препаратами и в качестве ранней диагностики рака шейки матки [21-23]. Известно, что созревание клеток плоского эпителия влагалища носит гормонально-зависимый характер [24, 25]. По мере увеличения воздействия эстрогенов происходит созревание эпителиальных клеток и соответственно увеличение в мазке клеток поверхностного слоя с пикнотичным ядром и зрелых промежуточных клеток. Наиболее незрелыми являются клетки глубоких слоев эпителия (базально-парабазальные клетки), которые появляются в мазке при эстрогеновой недостаточности и/или избытке андрогенов [21, 22, 24, 26].
Цель настоящего исследования - оценка степени созревания клеток эпителия влагалища как маркера эстрогенизации наружных гениталий у девочек-подростков с ВДКН, выявление зависимости изменения цитологических индексов от формы и степени компенсации заболевания, а также от показателей эстрогенизации внутренних гениталий.
Материал и методы
В исследовании участвовали 17 девочек-подростков с классическими формами ВДКН: сольтеряющая (СТ) форма - у 8 девочек, простая вирильная (ПВ) форма - у 9. Критериями включения девочек в исследование были: генетически верифицированный диагноз ВДКН, возраст более 13 лет, половой статус по классификации Таннера (1968) более 3, костный возраст более 13 лет и объем яичников более 4 мл по данным ультразвукового исследования (УЗИ). Все пациентки регулярно обследовались в детском отделении ФГБУ ЭНЦ с периодичностью 1-2 раза в год. У обследованных нами пациенток возраст составлял 15,8 года (14,9; 16,9 года), костный возраст 17,6±1,37 года, половой статус по Таннеру - 4 (3-5), возраст менархе - 12,5 года (n=15, 11; 13 лет), объем яичников - 7,22 мл (4,69; 10,16 мл).
Пациентки были разделены на две группы в зависимости от степени компенсации заболевания. В 1-ю группу вошли 9 девочек, имеющих удовлетворительную компенсацию или субкомпенсацию заболевания. К этой группе были отнесены пациентки с показателем 17-гидроксипрогестерона (17-ОHП) менее 50 нмоль/л, отсутствием или слабовыраженными клиническими симптомами гиперандрогении в течение последних 3 лет и пациентки с показателем 17-OHП более 50 нмоль/л, но с отсутствием симптомов гиперандрогении и регулярным менструальным циклом. Во 2-ю группу были включены 8 девочек в состоянии длительной декомпенсации заболевания. К этой группе были отнесены пациентки с показателем 17-OHП более 50 нмоль/л и выраженными признаками гиперандрогении в течение последних 3 лет и более. В 1-й группе были выделены две подгруппы в зависимости от фазы менструального цикла, в которой был получен мазок для цитологического исследования: в фолликулиновую фазу цикла - 6 девочек, в лютеиновую фазу цикла - 3 (табл. 1).
Группу сравнения для 1-й группы составили 12 здоровых девочек-подростков, сопоставимых по возрасту - 16 лет (14,75; 16 лет) и стадии полового развития по Таннеру (4-5), имеющие регулярный менструальный цикл. Пациентки группы контроля также были разделены на две подгруппы в зависимости от фазы менструального цикла: фолликулиновая фаза - 6 девочек, лютеиновая фаза - 6.
Критериями исключения из исследования являлись: невозможность получения материала для цитологического исследования ввиду особенностей строения наружных половых органов (наличие узкого урогенитального синуса, рубцовые изменения интроитуса после перенесенной феминизирующей пластики), получение неполноценного материала для цитологического исследования (малоклеточность мазка, наличие в материале большого количества элементов крови и/или воспаления).
Клинический осмотр пациенток включал определение антропометрических показателей, стадии полового развития по Таннеру, оценку выраженности симптомов гиперандрогении. Также оценивался возраст менархе, наличие/отсутствие регулярного менструального цикла на момент осмотра. Всем пациенткам с ВДКН проводилось гормональное обследование, при котором определялся уровень тестостерона, 17-OHП, эстрадиола. Содержание общего тестостерона, эстрадиола в сыворотке определяли методом усиленной хемилюминесценции с помощью автоматического иммунохимического анализатора Vitros 3600 (Ortho Clinical Diagnoxtics, «Johnson& Johnson»). Для оценки концентрации 17-OHП в сыворотке использовали радиоиммунологический анализ (Immunotech, ISO 9001-13485). УЗИ органов малого таза с оценкой размеров матки проводили у всех девочек-подростков трансабдоминально, объем матки был рассчитан по формуле А×В×С×0,5233, где А - длина матки вместе с шейкой; В - ширина, С - переднезадний размер матки. Для оценки КВ проводилась рентгенография кистей с лучезапястными суставами. КВ пациентов определялся в соответствии с общепринятой методикой W. Greulich, S. Pyle (1959).
Всем пациенткам было проведено цитологическое исследование вагинального эпителия. Образцы были получены с помощью желобоватого зонда с латеральных стенок средней трети влагалища. После получения материала образцы высушивали на воздухе, окраска стекол выполнена по методу Романовского в модификации Паппенгейма. Цитологическое исследование было проведено на микроскопе Zeiss Primo Star путем подсчета 200 клеток в нескольких полях зрения (используемые объективы - 10× (для выбора поля зрения) и 100× (для подсчета эпителиальных клеток). После подсчета количества поверхностных (с пикнотичными ядрами - КП), промежуточных (ПР) и базально-парабазальных (ПБ) клеток был вычислен процент каждого типа. Для статистической обработки данных были использованы общепринятые показатели: кариопикнотический индекс (КПИ) - процент всех клеток с кариопикнозом из числа всех поверхностных и зрелых промежуточных клеток; атрофический индекс (АИ) - процент парабазальных и базальных клеток из общего числа клеток; индекс созревания (ИС), вычисленный по формуле: ИС = (% ПР·0,5)+% КП [22, 24].
Статистическую обработку данных проводили с использованием прикладных программ Statistica версия 8.0 («StatSoft Inc.», США). Данные представлены в виде медианы с указанием 25-75 процентилей. Оценку достоверности различий между группами проводили с помощью теста Манна-Уитни. Для анализа связи двух признаков использовался анализ ранговой корреляции по Спирмену. Критический уровень значимости различий принимался равным 0,05.
Результаты
На первом этапе исследования была проведена оценка взаимосвязи цитологических индексов (КПИ и ИС) и объема матки с гормональными показателями (17-OHП, тестостерон, эстрадиол) в общей группе пациенток с ВДКН (табл. 2).
На втором этапе проводили сравнение результатов цитологического исследования вагинального эпителия и УЗИ матки в 1-й и 2-й группах с разной степенью компенсации ВДКН (табл. 3).
Показатели КПИ и ИС были достоверно выше в 1-й группе по сравнению с этими показателями во 2-й группе (p=0,009 и р=0,003 соответственно; рис. 3 и 4).
Клетки поверхностного слоя отсутствовали или встречались в очень небольшом количестве у пациенток с неудовлетворительным контролем гиперандрогении. Наоборот, клетки парабазального слоя полностью отсутствовали в мазках, полученных у девочек с удовлетворительной компенсацией заболевания, тогда как у декомпенсированных по ВДКН пациенток встречались незрелые клетки плоского эпителия [медиана процента парабазальных клеток - АИ] во 2-й группе соответствовала 8,5 (0,0; 20,25) (рис. 5-7).
Объем матки у девочек, получавших адекватную заместительную терапию, соответствовал нормальным популяционным значениям для данного параметра при достижении полового статуса по Таннеру 4-5 [объем матки в 1-й группе 36 мл (26,57; 48), в популяции, по разным данным, - 24±14,4-37 (11-56) мл) [19, 20], во 2-й группе этот показатель был статистически значимо ниже - 22,78 (14,7; 30,15)] (рис. 8).
При разделении пациенток в 1-й и 2-й группах на подгруппы в зависимости от формы заболевания (CТ и ПВ) не было выявлено статистически значимых различий в исследуемых индексах (КПИ и ИС) между девочками с СТ и ПВ формами ВДКН в 1-й группе (р=0,39 и р=1,0 соответственно) (табл. 4).
При сравнении результатов цитологического исследования в зависимости от фазы цикла, в которую был взят мазок для исследования, не было выявлено статистически значимой разницы между фолликулиновой и лютеиновой фазой в показателях КПИ и ИС как в 1-й группе с ВДКН, так и в контрольной группе (табл. 5).
Обсуждение
По результатам нашего исследования степень созревания эпителия влагалища у девочек-подростков с ВДКН строго зависит от компенсации заболевания. При сравнении групп пациенток с удовлетворительной и неудовлетворительной компенсацией заболевания можно сделать вывод об одинаковом влиянии декомпенсации на эстрогенизацию как наружных, так и внутренних гениталий (уменьшение объема матки по данным УЗИ). Наличие сильной отрицательной корреляционной связи уровня тестостерона с ИС подтверждает отрицательное влияние гиперандрогении на пролиферацию и эстрогенизацию слизистой влагалища, приводя к ее атрофическим изменениям. Этот результат сопоставим с данными литературы [26, 27].
Учитывая наличие сильной положительной корреляционной связи между КПИ, ИС и объемом матки, можно сделать вывод о сопоставимости уровня эстрогенизации внутренних и наружных гениталий пациенток. Небольшой объем обследуемой группы, а также использование для корреляционного анализа гормональных показателей, определенных однократно на момент исследования, может объяснять отсутствие корреляции между ними, объемом матки и показателями созревания эпителия.
При распределении по формам ВДКН отмечено, что снижение степени созревания клеток вагинального эпителия более выражено при декомпенсации СТ формы по сравнению с ПВ формой заболевания. При удовлетворительном контроле гиперандрогении и адекватной заместительной терапии различий между вариантами заболевания не отмечается.
По нашим наблюдениям, у девочек-подростков с удовлетворительной компенсацией ВДКН возраст менархе [13,0 лет (12,5; 13 лет)] не отличается от возраста менархе в группе контроля [12,0 лет (11,0; 13,0 лет] и от этого показателя в популяции в целом [в среднем 12,6 года (12,5-13 лет)] [28, 29]. Объем матки также соответствует нормальным пубертатным значениям данного параметра [19, 20]. При цитологическом анализе мазков, полученных от здоровых девочек пубертатного возраста и от компенсированных по ВДКН пациенток, необходимо отметить отсутствие разницы в показателях клеточного созревания между фолликулиновой и лютеиновой фазами цикла как в контрольной, так и в 1-й группе. Данный результат, возможно, объясняется преобладанием ановуляторного цикла у девочек-подростков на этапе становления менструального цикла. Пациентки с низкими показателями андрогенов в крови имеют достаточную степень эстрогенизации слизистой влагалища. Это следует из отсутствия статистической разницы ИС эпителия между группой контроля и 1-й группой. Полученные результаты согласуются с данными литературы. В норме КПИ у женщин репродуктивного возраста равен 20-60%, а ИС колеблется от 60 до 70% в зависимости от фазы менструального цикла.
Заключение
Результаты нашего исследования позволяют заключить, что степень эстрогенизации наружных гениталий в период полового созревания соответствует эстрогенизации внутренних гениталий и в основном зависит от степени компенсации ВДКН. По сравнению с ПВ формой заболевания достижение адекватной компенсации и соответственно эстрогеновой насыщенности у девочек-подростков с СТ формой является более трудной задачей, поэтому данные пациентки нуждаются в наиболее тщательном наблюдении и контроле в периоды пре- и пубертата. Таким образом, ранняя постановка диагноза, адекватная и регулярная заместительная терапия должны способствовать достаточной эстрогенизации слизистой и снижать риск возникновения послеоперационного стеноза интроитуса.