Роль экспрессии Толл-подобных рецепторов в рецидивировании генитального герпеса

По данным ВОЗ на ноябрь 2013 г., более 530 млн человек в мире заражены вирусом генитального герпеса (ГГ) [10]. ГГ способен вызывать самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды, синдром задержки роста плода, врожденные пороки развития, неонатальный сепсис, энцефалит и менингоэнцефалит у новорожденного [5].

Одной из главных проблем является рецидивирующая форма ГГ. По данным литературы [1], более чем у 20-30% больных ГГ в течение первых 2-3 лет развивается рецидив. Рецидивирующая форма ГГ оказывает не только негативное влияние на психо­эмоциональный статус пациентов, но и отражает несостоятельность местного противовирусного ответа [9]. В частности, наличие рецидивирующего ГГ в последнее время связывают с повышенным риском заражения ВИЧ [8].

Ключевым звеном в распознавании вирусных агентов являются Toлл-подобные рецепторы, которые экспрессируются на клетках системы врожденного иммунитета - макрофагах, нейтрофилах, дендритных и эпителиальных клетках, а также натуральных киллерах. В распознавании вируса простого герпеса (HSV) участвуют TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9. Они запускают каскад иммунных реакций посредством сигнальной молекулы MyD88 (белок первичного ответа миелоидной дифференцировки 88) или без нее - по MyD88-независимому пути, что требует присутствия адаптерного белка, индуцирующего интерферон-1β (Toll/IL-1 domaincontaining adaptor inducing interferon-1β, TRIF). Далее происходит активация интерлейкинсвязывающей киназы 4 (IRAK4) и ядерного транскрипционного фактора NF-kB. Итогом каскада этих реакций является продукция интерферонов (INF) и интерферонстимулированных генов, которые и определяют качество противовирусного ответа [2].

Цель настоящего исследования - оценка экспрессии TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9, TRIF и IRAK4 при различных клинических формах ГГ.

Сбор материала для исследования проводился на базе Областного кожно-венерологического диспансера Белгорода. Обследованы 150 женщин с ГГ. Всем пациенткам проводилось анкетирование. В 1-ю группу вошли 56 пациенток с первым эпизодом непервичной инфекции (первым клиническим эпизодом ГГ при существующем HSV); во 2-ю группу - 53 пациентки с редко рецидивирующим ГГ (рецидивы 3-4 раза в год, ремиссия менее 4 мес); в 3-ю группу - 41 пациентка с часто рецидивирующим ГГ (рецидивы 4-6 раз в год, ремиссия менее 2-3 мес).

Материалом для исследования был соскоб эпителия с поверхности везикул, полученный с помощью цитощетки или урогенитального зонда, который хранили в пробирках по 1,5 мл типа Эппендорф с 0,5 мл реагента RNAlater («Ambion», США) при –20 °С. Выделение РНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции с использованием реагента TRIzol («Евроген», Россия). Качество РНК проверяли методом электрофореза в течение 15 мин при напряжении 10 В/см по интенсивности свечения полос рибосомальной РНК в 1,1% агарозном геле с бромида этидием. Затем образцы обрабатывали ДНКазой DNAse I RNAse free («Fermentas», США) для удаления геномной ДНК согласно инструкции производителя. Концентрацию мРНК определяли на спектрофотометре Nanodrop («ThermoScientific», США). В реакцию вносили 1 мкг мРНК. Для проведения обратной транскрипции использовали обратную транскриптазу Mint («Евроген», Россия). Определение экспрессии мРНК TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9, TRIF и IRAK4 проводили методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в НИЛ «Молекулярная генетика человека» НИУ БелГУ. Подбор праймеров осуществлялся с помощью базы данных BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov). В качестве генов-нормировщиков использовали бета-актин и пептидилпролилизомеразу A (PPIA). Количественную ПЦР проводили со смесью qPCRmix-HS SYBR с интеркалирующим красителем SYBR I («Евроген», Россия) на амплификаторе CFX96 («Biorad», США). Экспрессию мРНК исследуемых генов вычисляли методом &Dgr;&Dgr;cq. Статистический анализ выполняли с использованием программы Statistica 6,0 (лицензия №AXXR505C705306FAN12, «Statsoft», США). Для оценки достоверности различий использовали критерий Манна-Уитни, для корреляционного анализа - критерий Спирмена.

Обнаружено снижение экспрессии TLR7 в группе пациентов с редко рецидивирующей формой ГГ в сравнении с пациентами с первым эпизодом непервичной инфекции [7,62 (5,98; 10,3) против 11,67 (7,36; 20,04) соответственно; p<0,05]. В этих же группах сравнения было обнаружено снижение экспрессии IRAK4 [0,004542 (0,000112; 0,046) и 0,09 (0,0014; 12,16) соответственно; p<0,05].

Также выявлено снижение экспрессии TLR3 в группе с часто рецидивирующей формой ГГ в сравнении с группой с редко рецидивирующей формой ГГ [0,63 (14,6; 40,02) против 31,3 (23,9; 48,0) соответственно; p<0,05] (табл. 1).

Это соотносится с данными литературы [11], согласно которым снижение экспрессии TLR3 и TLR7 связано с повышением восприимчивости к HSV. В исследовании K. Yang [12] также было отмечено, что при дефиците IRAK4 продукция цитокинов не всегда может быть эффективной, что, вероятно, приводит к рецидивам ГГ. В частности, продукция IFN посредством активации TLR7 и TLR9 осуществляется только через IRAK4 и соответственно при дефиците IRAK4 не может быть полноценной. С другой стороны, IRAK4-дефицитные пациенты могут контролировать противовирусную защиту посредством TLR3/4-зависимой продукции IFN. В нашем исследовании у пациенток с редко рецидивирующей формой ГГ снижена экспрессия TLR7 и IRAK4 по сравнению с пациентками с первым эпизодом непервичной инфекции, а также снижена экспрессия TLR3 в группе с часто рецидивирующей формой в сравнении с группой с редко рецидивирующим ГГ, но нет изменений экспрессии TLR4 и TLR9. Возможно, именно такой профиль характерен для пациенток этих групп.

Для выявления корреляционных взаимосвязей между экспрессией TLRs и белков их сигнального пути использовали критерий Спирмена. Умеренная положительная корреляционная связь наблюдалась только между экспрессией мРНК TRIF и TLR3 (R=0,37; p<0,05). Это согласуется с данными литературы [3], так как именно TLR3 для активации внутриклеточного каскада продукции IFN необходима адапторная молекула TRIF. Также была выявлена слабая корреляционная связь между TLR9 и TRIF (R=0,25; p<0,05) и IRAK4 и TRIF (R=0,24; p<0,05) (табл. 2).

Выявлена умеренно положительная корреляционная связь между экспрессией большинства TLRs (табл. 3).

TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9 комплексно участвуют в распознавании лигандов HSV, имеют общий MyD88-зависимый путь активации. Исключение составляют TLR3, которому необходима адапторная молекула TRIF, и TLR4, который может активироваться и посредством MyD88, и TRIF [7]. Как видно из табл. 3, корреляционная связь при HSV есть практически между всеми TLRs, независимо от дальнейшего пути активации [6].

Кроме того, обнаружена слабая положительная корреляционная связь между экспрессией TLR7 и IRAK4 (R=0,22; p<0,05), а также между экспрессией TLR9 и IRAK4 (R=0,26; p<0,05) (табл. 4).

В клинической картине наблюдалась умеренная положительная корреляционная связь между экспрессией TLR2 (R=0,33; p<0,05) и наличием болевого синдрома, между экспрессией TLR4 и увеличением паховых лимфатических узлов (R=0,31; p<0,05), а также между экспрессией TLR3 и TLR8 и лихорадкой (R=0,23; p<0,05 и R=0,26; p<0,05 соответственно) (табл. 5).

Таким образом, особенности клинической картины при ГГ в большей степени коррелируют с экспрессией TLRs, лигандами которых являются бактериальные антигены.

Также обнаружена сильная положительная корреляционная связь между наличием у женщин в анамнезе хламидийной инфекции и количеством обострений ГГ (R=0,74; p<0,05). В исследовании S. Deka [4] установлено, что наличие HSV-2, возможно, обеспечивает длительную персистенцию хламидийной инфекции. В частности, под влиянием HSV-2 происходит накопление хламидийного белка теплового шока HSP60-1, обладающего иммуносупрессивными свойствами. Таким образом, наличие в анамнезе хламидийной инфекции, возможно, является фактором, усугубляющим течение ГГ.

1. В нашем исследовании в группе пациенток с редко рецидивирующей формой ГГ выявлено снижение экспрессии TLR7 и IRAK4. Обнаружено снижение экспрессии TLR3 при сравнении пациенток с часто и редко рецидивирующей формой ГГ. Это свидетельствует о том, что снижение экспрессии сигнальных рецепторов, ответственных за распознавание вируса, способствует увеличению частоты рецидивов ГГ.

2. Особенности клинической картины при ГГ в большей степени коррелируют с экспрессией TLRs, лигандами которых являются бактериальные антигены. Так, наблюдается умеренно положительная корреляционная связь между экспрессией TLR2 и наличием болевого синдрома, между экспрессией TLR4 и увеличением паховых лимфатических узлов, между экспрессией TLR3 и TLR8 и лихорадкой.

3. Обнаружена сильная положительная корреляционная связь между наличием у женщин в анамнезе хламидийной инфекции и количеством обострений ГГ. Возможно, наличие в анамнезе хламидийной инфекции является фактором, усугубляющим течение ГГ.

Исследование выполнено при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований №12-04-32165.