Прогрессирующее ухудшение состояния здоровья населения, обусловленное комплексом социальных, экономических и медицинских аспектов, приводит к постепенному росту частоты бесплодных браков, которая колеблется в разных регионах от 10—15 до 18—20% и может считаться прямыми репродуктивными потерями [1, 2]. Как правило, рождения детей таким парам удается достигнуть лишь с применением вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), эффективность которых составляет в среднем 27,4% после года лечения [3], зависит от ряда факторов со стороны как пациента, так и центра ВРТ. При этом до ²/₃ пациентов репродуктивных клиник сталкиваются с проблемой повторного отсутствия имплантации. В подавляющем большинстве случаев это обусловлено анеуплоидией эмбрионов [4—6] и может быть диагностировано с применением методов преимплантационного генетического скрининга (ПГС). В связи с тем что наиболее широко используемыми с этой целью являются методы ограниченного хромосомного скрининга (FISH, QF-PCR), на сегодня структура хромосомных нарушений эмбрионов остается неизученной, что обусловливает отсутствие конкретных клинических рекомендаций по ведению таких пациентов и выбору тактики и метода ПГС.

Цель настоящей работы — сравнительный анализ частоты и спектра хромосомных аномалий эмбрионов супружеских пар с многократными неудачными программами ВРТ и в абортном материале I триместра беременности.

Исследования эмбрионов на стадии бластоцисты проводили в рамках циклов ВРТ с информированного согласия пациентов. В выборку включены 364 эмбриона из 64 циклов ПГС супружеских пар с нормальным кариотипом и многократными предварительно проведенными неудачными циклами ВРТ (4,3±0,8 цикла) женщинам в возрасте 34,7±6,1 года. Оплодотворение ооцитов осуществляли методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ICSI) независимо от состояния сперматогенеза. Лазерную биопсию эмбрионов проводили на стадии бластоцисты (5-е сутки развития), исследуемый материал — клетки трофэктодермальной оболочки. Эмбрионы после биопсии витрифицировали для дальнейшего использования в криоциклах. ПГС проводили методом тотального геномного скрининга — сравнительной геномной гибридизации на микрочипах (aCGH). С целью проведения анализа клетки трофэктодермы эмбрионов лизировали с последующим проведением полногеномной амплификации (SurePlex DNA Amplification system, «BlueGnome, Ltd.», Великобритания). Пробы и референсную ДНК метили различными красителями (Су3 и Су5) (Fluorescent Labelling System [dCTP], «BlueGnome, Ltd.», Великобритания), после чего комбинировали согласно протоколу производителя, смешивали с Cot Human DNA (1 мг/мл, «BlueGnome, Ltd.», Великобритания), DS Hybridization buffer («BlueGnome, Ltd.», Великобритания), денатурировали на протяжении 10 мин при температуре 75 °С и гибридизировали на протяжении 18 ч на чипах 24sureV3 («BlueGnome, Ltd.», Великобритания) при температуре 47 °С. После отмывки чипы сканировали с помощью Innocsan 710 («Innopsys», Франция), полученные изображения обрабатывали программным обеспечением BlueFuseMulti v. 3.1 («BlueGnome, Ltd.», Великобритания). Наложение «сетки», количественную оценку, нормализацию и пост-процессинг проводили в автоматическом режиме. Хромосомный профиль оценивали на предмет наличия дополнительного либо потери генетического материала (gain & loss) на основании отклонения сегмента от изолинии на величину 3×SD и/или 0,3 log2-ratio [7].

Информативность преимплантационной диагностики методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с пробами на пять (13, 18, 21, Х, Y), девять (13—18, 21, 22, X, Y) и двенадцать (8, 13—18, 20—22, X, Y) хромосом оценивали путем экстраполяции результатов aCGH. Хромосомную аномалию считали определяемой методом FISH при условии, что она затрагивала район хромосомы, представленный пробой из скрининговой панели ПГС методом FISH.

Цитогенетическое исследование абортного материала в случаях самопроизвольных абортов и неразвивающейся беременности в I триместре беременности было проведено на 750 образцах: в 602 случаях на ворсинах хориона, в 148 — на эмбриональных фибробластах. Препараты метафазных хромосом готовили из ворсин хориона полупрямым методом [8]. Хромосомный анализ эмбриональных фибробластов проводили после культивирования [8]. В случаях отсутствия жизнеспособных клеток в абортном материале и соответственно отсутствия метафазных пластин в препаратах проводили интерфазную FISH для выявления анеуплоидий хромосом 13, 15, 16, 18, 21, 22, X, Y. Использовали коммерческие пробы AneuVysion, BCR22, CEP15, TelVysion16q («Vysis»). Пре- и постгибридизационную обработку проводили согласно протоколам производителя.

Статистический анализ (сопоставление двух групп по структуре вовлечения хромосом в перестройку) проводили с использованием непараметрического критерия Пирсона (χ²) c учетом поправки жесткости Йетса или точного одностороннего критерия Фишера.

При проведении цитогенетического исследования абортного материала хромосомные аномалии были выявлены в 324 (43,2%) случаях (в 58 образцах методом FISH и в 256 — с помощью стандартного цитогенетического исследования). В целом частота хромосомных аномалий, выявляемых при стандартном кариотипировании в материале самопроизвольных абортов, варьирует от 46 [9] до 67,5% [10] и зависит от особенностей исследуемой группы. Так, [11] отмечают, что при цитогенетическом исследовании абортного материала I триместра патологию кариотипа определяют в 72,3% случаев при спонтанном невынашивании и 51,3% в случае привычного невынашивания беременности. Полученные различия с данными литературы могут быть обусловлены несколькими факторами. Первый — в нашей работе не было возможности разделить пациенток на группы по количеству невынашиваний беременности, так как данная информация не является обязательной составляющей форм направления материала на исследование и в большинстве случаев просто отсутствует. Потому полученные нами данные являются интегральным показателем в общей группе. Второй — в случаях замершей беременности не всегда удается получить цитогенетические препараты высокого качества, позволяющие определить мелкие хромосомные перестройки, либо метафазные пластинки получить вообще невозможно (до 20% случаев). Использование метода FISH в таких случаях, безусловно, связано с неполным выявлением хромосомных аномалий, а именно: определением количества копий отдельных районов хромосом, что позволяет исключить лишь наиболее частые анеуплоидии, составляющие от 69 [12] до 83% [13] хромосомных аномалий в материале самопроизвольных абортов.

Согласно данным [14], применение технологий сравнительной геномной гибридизации в этих случаях является более обоснованным, так как позволяет определить несбалансированные хромосомные нарушения (включая микроструктурные аномалии) в 65,6% случаев при невынашиваниях беременности и в 89% при анэмбрионии.

В материале самопроизвольных абортов нами выявлено всего 324 случая хромосомных аномалий, характеристика которых представлена в табл. 1.

Мозаичный кариотип был установлен в 19 (5,86%) случаях. Структура хромосомных аномалий характеризовалась следующим распределением (табл. 2).

Помимо представленных в табл. 2 данных был установлен 21 случай анеуплоидий хромосом, идентифицировать которые из-за низкого качества препаратов можно было только до группы. А именно: хромосом группы В — 1 случай, группы С — 5, группы D — 8, группы Е — 1, группы G — 2 и 4 случая маркерных хромосом. Как следует из табл. 2, наиболее часто в абортном материале выявляли анеуплоидии хромосом 15, 16, 18, 21, 22, X, Y. Резкий контраст, связанный со сравнительно низкой частотой вовлечения других хромосом, может свидетельствовать о том, что эмбрионы, имеющие аномалии таких хромосом, в меньшей степени совместимы с развитием и имплантацией. При этом нами не было установлено ни одного случая вовлечения в анеуплоидию хромосом 11 и 17 (из 502 полных кариотипов), что, возможно, ассоциировано с более редким их вовлечением и требует анализа большей выборки. Описаны единичные случаи выявления полной трисомии хромосом 17 и 11 в абортном материале [15, 16], но случаи живорождения с полной трисомией хромосом 17 и 11 не зарегистрированы, что может свидетельствовать о летальности этих трисомий in utero. В масштабном 10-летнем исследовании абортного материала методами стандартного кариотипирования и aCGH [17] патология кариотипа была показана в 35,6% случаев, среди которых 63,9% трисомий (за исключением хромосом 1 и 19), аномалии половых хромосом — 8,8%. Моносомии аутосом встречались крайне редко (1,9%). Структурные аномалии — 9,5%. Полученные нами результаты согласуются с данными цитируемой публикации.

Остановимся теперь на результатах исследований преимплантационных эмбрионов. Результат не был получен по 19 эмбрионам по причине неэффективной амплификации всего генома (5,22%). Методом aCGH кариотип эмбрионов был установлен как нормальный/сбалансированный в 169 (48,99% — от числа эмбрионов с полученным результатом — 345) случаях, несбалансированный — в 176 (51,01%). При этом, по данным [18], у пациенток с хорошим прогнозом достижения беременности методами ВРТ анеуплоидия эмбрионов определялась методом aCGH в 44,9% случаев (в 191 из 425). Приведенная в цитируемом источнике детализация исследования дала возможность сопоставить результаты с полученными нами данными, что статистически подтвердило тенденцию к повышению частоты хромосомных нарушений у эмбрионов в группе пациенток с многократными неудачными циклами ВРТ (p=0,054 по точному критерию Фишера; χ²=2,816; p=0,093).

Всего было установлено 219 случаев хромосомных аномалий в преимплантационных эмбрионах, распределение которых имело следующую структуру: числовые аномалии — 131 (59,82%) случай, в том числе моносомии — 61 (46,56%), трисомии — 70 (53,44%). Структурные хромосомные аномалии были установлены в 37 (19,18%) случаях. Множественные хромосомные аномалии (структурные и/или числовые по трем и более хромосомам одновременно) в эмбрионах были выявлены в 46 (21,0%). Структура вовлечения хромосом в перестройки характеризовалась следующим распределением (см. табл. 2).

В отличие от материала самопроизвольных абортов, в преимплантационных эмбрионах на стадии бластоцисты все 23 пары хромосом вовлекались в структурные или численные аномалии кариотипа.

Проведем попытку сопоставить полученные данные.

Примечательно, что по ряду хромосом тенденции частот вовлечения в перестройки сохраняются: наблюдается лишь незначительная разница в частотах. Однако по некоторым — существуют значительные различия, что проанализировано в табл. 2. Статистически значимые различия частот вовлечения хромосом в аномалии наблюдались нами по хромосомам 1, 10, 17—19, а также по X и Y.

Моносомии по аутосомам часто встречаются у доимплантационных эмбрионов и крайне редко — в абортном материале (см. табл. 2 и [17]), что свидетельствует о несовместимости таких нарушений с развитием уже на ранних этапах эмбриогенеза. Исключение составляет моносомия по Х-хромосоме (синдром Шершевского—Тернера), совместимая с живорождением. Однако даже в этом случае наблюдается повышенная частота гибели зародышей, что, вероятно, может быть объяснено проявлением Х-сцепленных рецессивных летальных генов в гемизиготном состоянии. Трисомия — наиболее частая патология кариотипа в абортном материале. При этом аномалии, затрагивающие хромосомы 1, 3—12, 14, 17 и 19, встречаются сравнительно редко, что может быть объяснено большой морфогенетической ролью локализованных на них структурных генов и гибелью зародышей с анеуплоидией этих хромосом на ранних сроках развития. Трисомии 15, 16 и 22 преимущественно приводят к потере беременности, что объясняет высокую частоту их детекции в абортном материале. Высокой частотой определения характеризуется и трисомия по хромосоме 18. Она относится к совместимым с жизнью аномалиям, однако приводит к летальности в первые месяцы жизни.

Нарушения плоидности, установленные при кариотипировании продуктов зачатия, также являются несовместимыми с жизнью [19]. Описаны лишь единичные случаи рождения детей с полным и мозаичным триплоидным хромосомным набором, имеющих множественные врожденные пороки развития [20—22].

Справедливости ради следует отметить, что проведенное сопоставление частот аномалий в абортном материале и преимплантационных эмбрионах не лишено ряда методических недостатков, что может отчасти влиять на точность представленной информации и быть связанным с объективными ограничениями методов. А именно: метод aCGH, использованный при проведении преимплантационных исследований, является общепризнанным наиболее объективным методом тотального хромосомного скрининга, способным выявлять невидимые при стандартном кариотипировании микроделеционные и дупликационные нарушения, однако он не в состоянии определять наличие сбалансированных перестроек, не сопровождающихся изменением количества генетического материала [23], имеет ограниченные возможности детекции мозаицизма и полиплоидии. Полиплоидные эмбрионы могут возникать в случаях дигении или диандрии. Однако, согласно данным [24], 98,2% полиплоидных эмбрионов будут выбракованы с помощью aCGH по причине наличия хромосомной аномалии относительно плоидности эмбриона, что и позволит выявить хромосомный дисбаланс. Но 1,8% полиплоидных эмбрионов, не имеющих других хромосомных нарушений, могут быть пропущены. Анализ одного бластомера (при использовании FISH для ПГС) проводится по ограниченному числу хромосом и не позволяет исключить мозаицизм, в то время как анализ клеток трофэктодермы характеризуется редкими случаями несоответствия их генетического состава клеткам внутренней клеточной массы, что отмечено лишь в 5,8% случаев и относится только к анеуплоидным эмбрионам (по внутриклеточной массе) [25]. При кариотипировании абортного материала крайне сложно, а иногда невозможно достичь высокого качества и необходимого для объективного заключения количества метафаз, что связано с гибелью клеток ворсин хориона и самого эмбриона. Поэтому часть микроструктурных хромосомных нарушений, составляющих, по данным [12], приблизительно 16%, может остаться упущенной. В нередких случаях по тем же причинам стандартное кариотипирование является невозможным, из-за чего прибегают к FISH анализу на интерфазных ядрах. Однако он позволяет выявить исключительно несбалансированные хромосомные нарушения, затрагивающие в нашем случае участки восьми исследуемых хромосом. Таким образом, данное сопоставление даже при наличии определенного субъективизма позволяет сравнить спектр и структуру хромосомных аномалий преимплантационных эмбрионов и абортного материала. Полученные данные являются яркой характеристикой гетерогенности выявляемых аномалий и обосновывают концепцию необходимости преимплантационных исследований эмбрионов, по крайней мере, в группах повышенного риска (возраст женщины более 35 лет, выраженные нарушения спермограммы, подтвержденные случаи хромосомной патологии плода в предыдущих беременностях).

Сегодня существуют принципиально два разных подхода к преимплантационным исследованиям: ограниченный и полный хромосомный скрининг. К первому относятся широко распространенные в ВРТ-технологиях FISH и QF-PCR. Однако современные тенденции характеризуются постепенным переходом к полногеномному скринингу, группа методов которого представлена сравнительной геномной гибридизацией (aCGH), SNP-эрреями и секвенированием нового «второго» поколения. Однако данная тенденция не должна привести к вытеснению методов ограниченного скрининга, тем более в условиях экономической ситуации в странах СНГ, что требует выделения отдельных показаний к их применению, обусловленных как методическими, так и социально-экономическими аспектами.

В попытке обосновать выбор метода преимплантационного исследования в группе пациентов с многократными неудачными циклами ВРТ была проведена экстраполяция данных aCGH, принятых в качестве максимально достоверных результатов, на распространенные панели FISH-диагностики (табл. 3).

Как следует из табл. 3, частота детекции хромосомной патологии в преимплантационных исследованиях варьирует в зависимости от количества исследуемых хромосом. Так, используя стандартные панели FISH можно достичь определения ≤57,4% аномалий, детектируемых методом aCGH, что обеспечит точность диагностики на уровне ≤78,3%. Результаты расчетов согласовываются с данными, полученными экспериментальным путем [26], где показано, что панели FISH позволяют выявить 37—67% аномалий. Результаты свидетельствуют о целесообразности применения методов тотального хромосомного скрининга в исследованиях преимплантационных эмбрионов пациенток с многократными неудачными циклами ВРТ, что объясняется не только спектром хромосом, включенных в анализ, но и возможностью определения сегментарных несбалансированных нарушений. Разумеется, если возможности проведения aCGH в лаборатории/клинике ограничены, отдается предпочтение скринингу по ограниченному числу хромосом (FISH, QF-PCR). Также, в силу ограниченности aCGH в детекции полиплоидии и мозаицизма, прерогативой FISH-анализа остается селекция эмбрионов по полу (проводящаяся исключительно в рамках циклов ВРТ для носителей сцепленных с полом болезней) [27].

Эмбрионы пациенток с многократными неудачными циклами ВРТ характеризуются широким спектром хромосомных перестроек. Различие структуры аномалий хромосом в эмбрионах и абортном материале может быть обусловлено описанными ограничениями использованных диагностических методов, а также снижением жизнеспособности и имплантационного потенциала эмбрионов по причине наличия генетического дефекта. Вместе с тем изложенное выше служит весомым аргументом в пользу целесообразности применения технологий ПГС при лечении бесплодия у пациенток с многократными неудачными циклами ВРТ. Наиболее приемлемыми с этой целью в случае анализированной группы пациенток являются технологии полного хромосомного скрининга, одним из представителей которых служит сравнительная геномная гибридизация.