Эндометриоз является распространенным заболеванием, которое встречается у женщин главным образом репродуктивного возраста. Эта патология характеризуется наличием ткани эндометрия вне области матки. Поскольку внематочные эндометриальные импланты (ЭИ) реагируют на природные или индуцированные изменения уровня эстрогена, расстройство считается «эстрогензависимым» [1]. Симптомы эндометриоза включают снижение возможности оплодотворения и несколько видов болей, таких как тяжелая дисменорея (чрезмерная менструальная боль), глубокая диспареуния (боль в области таза, сопряженная с половым актом), дисшезия (тазовая боль при дефекации в период менструации) и хронические тазовые боли. У некоторых женщин боль может быть усилена совместным проявлением и других тяжелых хронических болей, таких как синдром раздраженного кишечника, интерстициальный цистит, повторяющиеся камни в почках, вульводиния, мигрени и фибромиалгии [2—4]. Хронические тазовые боли вызывают у женщин психологические расстройства, такие как депрессивный синдром и повышение уровня тревожности [5]. Немногое известно о связях между ЭИ и болью, однако последние исследования симптомов у пациенток и животных с моделью эндометриоза начинают прояснять эти связи. Серия блестящих работ группы К. Беркли [6—9] во многом прояснила загадочный факт присутствия тазовых болей после хирургического удаления ЭИ и перерезания соответствующих нервных волокон.

Значение производных оксида азота (NO) в нейрональных процессах трудно переоценить. NO участвует в процессах как передачи сигнала, так и в носисепции и антиносисепции [10, 11]. В настоящее время считается доказанным тот факт, что ни сигнальная функция, ни взаимодействие NO с рецепторами невозможны без привлечения свободных сульфгидрильных групп, входящих в состав аминокислот, высоко- или низкомолекулярных пептидов [12, 13]. Поскольку период жизни свободного NO чрезвычайно мал, сразу после его выделения одной из NO-синтаз NO связывается со свободным низкомолекулярным тиолом, нитрозилируя его. Для создания и последующей деградации нитрозотиолов необходимы металлы переменной валентности, допирующие электрон [14] и создающие динитрозильные комплексы, вначале низко-, а затем и высокомолекулярные. В виде такого комплекса период жизни NO значительно увеличивается, и он может депонироваться, передвигаться вместе с током крови и взаимодействовать с соответствующими мишенями [15]. Однако роль таких комплексов, содержащих и выделяющих NO, в передаче и блокировании болевого сигнала изучена мало.

Экспериментальный эндометриоз индуцировали у крыс-самок линии Вистар (питомник «Столбовая») массой 160—180 г, находящихся в фазе проэструса. Заболевание моделировали аутотрансплантацией (эндометрием внутрь перитонеума) двух фрагментов эндометрия с миометрием (2×2 мм), полученных из левого рога матки, к поверхности брюшины передней брюшной стенки (расстояние между имплантами 15—20 мм). Все эксперименты проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции «International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals» (Женева, 1990). Для моделирования эндометриоза была выбрана модификация операции, описанная в работе [16]. Оперативные вмешательства проводились на иммобилизационном станке c премедикацией ксилазином (3 мг/кг) под тиопенталовым наркозом (0,05 г на 1 кг живой массы) в течение 40—45 мин. После перевязки и удаления левого рога матки фрагменты разрезали и промывали стерильным физиологическим раствором. Перитонеальную полость и дермальные слои зашивали последовательно синтетическим рассасывающимся шовным материалом из полигликолевой кислоты (тем же, которым проводили и оперативные вмешательства внутри брюшной полости). После операции животных содержали в виварии в условиях регулируемого светового дня (12—12 ч) и постоянной комнатной температуры (23±2 °С) на стандартном пищевом рационе и свободном доступе к воде в течение 4 нед для приживления имплантов. Стерильные стружечные подстилки после операции менялись ежедневно. Животные контрольной группы (12 особей) содержались в условиях, общих с опытной группой. В те же сроки, что и в опыте, им вводили физиологический раствор в дозе 0,5 мл. Введение животным (10 особей) опытной группы 5 мМ раствора биядерного динитрозильного комплекса железа (ДНКЖ) с глутатионом (внутрибрюшинное введение в объеме 0,5 мл) проводили ежедневно в 13 ч по московскому времени в течение 10 дней, после двухчасовых наблюдений за поведением животных.

Наблюдения за проявлением болезненных симптомов у животных контрольной и опытной групп проводились в соответствии с указаниями в работе [17] 4 наблюдателями в течение 2 ч ежедневно (животные содержались по одному в изолированных клетках). Животные из контрольной и опытной групп выбирались произвольно, но в фазе проэструса. Клетки с животными не сообщались и имели непрозрачные заднюю и боковые стенки. Для снижения воздействия личностных факторов наблюдатели каждый день меняли группы исследования (контрольная — опытная). Длительность нахождения животных в позах, отражающих проявления боли [18], фиксировали секундомерами.

После окончания курса инъекций животные содержались в вышеописанных условиях еще в течение 1 нед, после чего их забивали под тиопенталовым наркозом в соответствии с вышеуказанными условиями и требованиями. Общая продолжительность эксперимента составляла для животных 45 сут.

После вскрытия брюшной полости импланты и другие органы измеряли (длина, ширина и высота), фотографировали, отделяли от окружения и направляли на гистологическое исследование. Для этого ткани помещали в 20% раствор формалина (после стандартной проводки и заливки образцов ткани в парафин и гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином). Объем имплантов (в мм³) определяли по формуле для эллипсоидов: длина × ширина × высота × π/6 [19].

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с использованием параметрического критерия Стьюдента. Выравнивание эмпирических рядов, полученных для данных о средней продолжительности единичного болевого приступа и общей продолжительности болевых приступов в течение наблюдаемого периода, проводили способом взвешенной скользящей средней [20].

Синтез биядерного ДНКЖ с глутатионом проводили по ранее описанному методу [21] в аппарате Тунберга, смешивая в нем в присутствии газообразного NO под давлением 100 мм рт.ст. растворы сернокислого закисного железа («Fluka», Швейцария) и глутатиона при конечной их концентрации соответственно 5 и 20 мМ. Полученный раствор ДНКЖ с глутатионом замораживали и хранили в жидком азоте. Раствор размораживали непосредственно перед его введением животным.

Спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) растворов ДНКЖ и изолированных тканей животных регистрировали при температуре 77 К (–196 °С) на модифицированном радиоспектрометре SE/X 2544 фирмы «Радиопан» (Польша) при амплитуде высокочастотной модуляции магнитного поля 0,5 мТ и микроволновой мощности 10 мВт. Значения напряженности магнитного поля составляли H=160 мТ для ткани брюшины и 320 мТ для крови. Усиление спектрометра составляло 105.

Гистологическое исследование показало, что в образцах ткани брюшины и имплантов у животных контрольной группы было зафиксировано наличие эндометриоидных желез, т.е. присутствовали клетки эктопического эндометрия с элементами воспаления (детрит, нейтрофилы) и перерождения ткани (фиброз). В части представленных опытных образцов не отмечали присутствия эндометриальных желез, что говорит о регрессии экспериментального эндометриоза. В оставшихся опытных образцах эндометриоидных желез выявлены дистрофические изменения эпителия и стромы. Эндометриоидные железы имели дистрофические изменения эпителия в виде набухания, слущивания в просвет железы, отсутствия стратификации, потери клеточных границ. Строма была с выраженной нейтрофильной инфильтрацией, имела отсутствие фигур митозов стромальных клеток; толщина стромального слоя была уменьшена.

На рис. 1 и 2

На рис. 3

Данные о средних объемах имплантов в группах таковы (рис. 5):

— контрольная группа — 447,32±281,73 мм³;

— опытная группа — 213,00±174,81 мм³.

Анализ соотношения значений объемов ЭИ в контрольной и опытной группах животных показывает, что применение ДНКЖ с глутатионом уменьшает средний размер ЭИ в группе более чем в 2 раза (медиана см. рис. 5). Это доказывает, что данное средство сочетает в себе неспецифическое противовоспалительное действие и специфическое, блокирующее рост ЭИ. С этой точки зрения, данное средство представляется мультитерапевтическим. Есть еще одно проявление эндометриоза — хронические тазовые боли. Далее мы рассмотрим влияние ДНКЖ на болевые проявления при эндометриозе.

Три вида лечения облегчают боль у женщин с эндометриозом: применение нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) и других анальгетиков, гормональных препаратов и хирургическое удаление ЭИ. Хотя многое известно о влиянии НПВС на ЭИ [22], данных о влиянии провоспалительных факторов на болевые симптомы очень мало, кроме того факта, что их выход в брюшную полость может активировать ряд сенсорных нервных волокон, тем самым вызывая боль [23]. Помимо этого, другие факторы также, вероятно, участвуют в создании болевого импульса, потому что НПВС часто оказываются неэффективными [24], даже в сочетании с хирургическим удалением повреждений или гормональной терапией.

Тот факт, что гормональные препараты, которые снижают уровень эстрадиола и прогестерона, облегчают боль у женщин с эндометриозом, подтверждает вывод о том, что эстрадиол способствует проявлению болевых симптомов и применение прогестагенов может снизить боль [25]. Однако вопрос о том, как гормоны оказывают свое воздействие на боль при эндометриозе, до конца не ясен.

Хирургическое удаление или устранение очагов поражения облегчает боль у некоторых пациенток и показывает, что ЭИ способствуют боли, но механизм этого действия еще плохо изучен. Во-первых, казалось бы, полное хирургическое удаление не может облегчить боль, по крайней мере у 50% пациенток в течение 1 года [7]. Во-вторых, даже у тех пациенток, боль у которых была облегчена с помощью хирургического лечения ЭИ, она часто возвращается, иногда без достаточных доказательств возникновения новых очагов. В-третьих, тяжесть болевых симптомов не коррелирует со степенью заболевания [26].

Таким образом, болевые симптомы, наблюдаемые у пациенток, имеющих несколько очагов поражения, могут отражать ремоделирование центральной нервной системы, которое не зависит от устранения этих повреждений [7].

Мультитерапевтический подход к лечению, сочетающий применение всех трех типов средств, уменьшающих боль и воспаление, способствует лечению эндометриоза, как и других болезненных состояний. Поэтому мы ранее предприняли определенные исследования на модели эндометриоза у крыс, связанные с применением доноров NO (содержащих тиольные остатки) в качестве НПВС, сдерживающих рост ЭИ, уменьшающих воспаление и снижающих уровень боли [27, 28]. Выбор состава НПВС — ДНКЖ с тиоловыми остатками — отражал новый подход к конструированию средств, подавляющих развитие ЭИ и снижающих интенсивность хронических тазовых болей.

NO является ключевой сигнальной молекулой, которая играет важную роль в острых и хронических болевых состояниях как на центральном [29], так и на периферическом [30] уровне. NO способен индуцировать аналгезию, а также опосредовать обезболивающий эффект таких соединений, как опиоиды, каннабиноиды, НПВС, токсины животных и экстракты трав [31, 32]. Помимо сказанного, велико значение NO в отношении альтернативных видов обезболивающего лечения, таких как терапия гипербарической оксигенацией и электроакупунктура, лечение натуральными продуктами, а также для обезболивающего действия физических упражнений [10]. Эндогенный NO продуцируется четырьмя формами NO-синтаз: эндотелиальной (eNOS), нейрональной (nNOS), индуцибельной ( iNOS ) и митохондриальной (mNOS). Нейрональная NO-синтаза (nNOS) является доминирующей формой NO-синтез в дорсальном роге и играет определенную роль в питании спинного мозга. Кроме индуцибельной NO-синтазы (iNOS), эндотелиальная NO-синтаза (eNOS) также содержится в некоторых популяциях нейронов и кровеносных сосудах. Предполагают, что индуцибельная NO-синтаза (iNOS ) в нервной системе экспрессируется только периферически, в течение воспаления или невропатических болей. Оба — нейрональный и ненейрональный — пула NO играют сложную и разнообразную роль в модуляции носисепции. Боль описывается как неприятное ощущение, запускающее процессы, которые либо повреждают, либо могут вызвать повреждение тканей. Клиническая боль может возникать либо в результате повреждения нервной системы (невропатическая боль), либо при воспалительных состояниях (воспалительная боль) [33]. Этот тип боли характеризуется наличием спонтанных болей, гипералгезией (увеличение боли в ответ на действие вредных раздражителей) и аллодинией (наличие боли в ответ на нормально безобидные раздражители). В генерации клинической боли участвует несколько механизмов. Воспаление тканей или повреждение вызывает выброс различных веществ (брадикинина, цитокинов, эйкозаноидов, серотонина, гистамина, катионов), которые, воздействуя на собственные рецепторы, способствуют изменению схемы срабатывания первичных сенсорных нейронов, что приводит к носисепции. Связывание этих веществ с рецепторами приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей.

Фармакологический контроль воспалительной боли основан на двух стратегиях. Первая из них предполагает использование препаратов, которые подавляют чувствительность носисепторов и, следовательно, развитие гиперносисепции. Это основной механизм действия как аспирина, так и наркотиков, которые путем ингибирования циклооксигеназы предотвращают сенсибилизацию носисепторов [34]. Вторая стратегия предполагает использование препаратов, которые непосредственно блокируют постоянную боль, в результате чего происходит антиносисепция. Это может быть достигнуто за счет использования морфина, анальгина, оксида азота или NO доноров, а также других противовоспалительных препаратов, действующих через активацию NO—цГМФ пути. Модификация уже существующих обезболивающих и противовоспалительных препаратов путем добавления NO-рилизинг-фрагментов продемонстрировала улучшение анальгетической эффективности этих препаратов, а также уменьшение выраженности их побочных эффектов. Ингибиторы циклооксигеназы доноры оксида азота (CINODs) являются примером нового класса НПВС, созданных на основе добавления NO [35]. Эта стратегия уменьшает желудочно-кишечную токсичность НПВС.

Тиоловые группы глутатиона, цистеина и белков могут принимать участие в различных окислительно-восстановительных реакциях и комплексообразовании с переходными металлами (главным образом с железом и медью). Таким образом, разные реакции могут конкурировать за одни и те же тиоловые группы, и одиночный остаток цистеина или глутатиона может работать как молекулярный переключатель системы управления функцией белка. NO, по всей видимости, играет доминирующую роль в этих изменениях и стал основным посредником для быстрой, а также длительной адаптации сигнальных путей боли [36]. Многообразные функции NO для эндогенного контроля боли еще полностью не выяснены. В настоящее время ясно, что часть из них базируется на основе производства цГМФ опосредованного активацией растворимой гуанилатциклазы(sGC1) и цГМФ-зависимой протеинкиназы. Активация посредством NO гуанилатциклазы зависит от окислительно-восстановительных модификаций цистеиновых остатков в ее каталитическом центре. Активация NMDA-рецепторов еще больше повышает S-нитрозилирование путем активации nNOS и высвобождения NO в постсинаптическом нейроне. Гиперстимуляция рецепторов NMDA и постоянное S-нитрозилирование таким образом могут привести к переизбытку железа и нейротоксичности.

Известно, что основным метаболитом морфина является 8S-(глутатион-) дигидроморфинон, аддукт дигидроморфинона и эндогенного глутатиона. При высоких дозах, однако, запас глутатиона быстро истощается и морфин может реагировать с тиоловыми группами белков, включая опиоидные рецепторы, чтобы начать токсичную последовательность реакций.

Как описано выше, NO и тиольные остатки порознь и вместе являются важными медиаторами носисепции и участвуют как в носисепции, так и в антиносисепции.

На рис. 1 видно, что такой показатель, как значение средней продолжительности единичного болевого приступа, изменяется в течение курса лечения. Обе кривые меняются симбатно, но в случае применения динитрозильных комплексов продолжительность единичного приступа со временем уменьшается быстрее, нежели в контрольной группе. Это говорит о том, что применение динитрозильных комплексов с глутатионом оказывает антиносисептивное действие.

На рис. 2, где представлены значения суммарной продолжительности болевых приступов в течение 2 ч наблюдений, видно повышение указанной величины для контрольной группы на 8-й день введения. Это повышение можно объяснить как внешними, так и внутренними факторами воздействия на животных. К внешним факторам можно отнести резкие изменения атмосферного давления, влияющие на поведенческие характеристики животных, и возможное влияние смены эстральных фаз, не замеченное экспериментаторами (с другой стороны, изменения атмосферного давления должны бы одинаково сказываться на животных обеих групп). К внутренним факторам можно отнести усиление гипералгезии за счет новой функциональной иннервации области ЭИ [8]. Как описано в данной работе, первоначально, через 2 нед после пересадки, эндометриальные кисты приобретают элементарную сенсорную и симпатическую иннервации. Через 1—3 нед после трансплантации эти ненормальные иннервации становятся функциональными, т.е. способными внести вклад в нейрогенное воспаление. По истечении 4—5 нед (в это время кисты заполнены сенсорными и симпатическими нервными волокнами) гипералгезия становится существенной. Возможно, изменения плотности нервных волокон в области имплантации и соответственно увеличение общего времени болевых приступов, приходящиеся на 5-ю неделю после операции, дают подобное увеличение значений в контрольной группе. В опытной группе подобные значения монотонно уменьшаются. Это может свидетельствовать о том, что запаса эндогенного NO, производимого конститутивными NO-синтазами, к этому времени уже не хватает для антиносисепции и внесение его в виде комплекса с восстановленными тиолами дает новые возможности для обезболивания.

К другим внутренним факторам можно отнести появление у животных с экспериментальным эндометриозом изменения геометрии железосвязывающего центра в трансферрине — основном железотранспортном белке крови. Мы фиксируем подобные изменения, анализируя спектры ЭПР крови животных (см. рис. 3). Сигнал железа трансферрина (g=4,3) у животных с экспериментальным эндометриозом отличается по форме от сигнала трансферрина в крови животных, не подвергавшихся операции. Такого рода изменение конфигурации железосвязывающего центра влечет за собой многочисленные дефекты утилизации железа и приводит к анемическим синдромам наряду с избыточным количеством железа в тканях, непосредственно прилегающим к ЭИ [37]. У больных с эндометриозом изменения связывания железа наблюдают не только в трансферрине крови, но и в лактоферрине из перитонеальной жидкости. Поскольку ген ТФ*С2, отвечающий за синтез трансферрина, относится к группе наиболее эстрогензависимых [38], гиперэстрогенное состояние при эндометриозе порождает, по-видимому, дефекты в этих белках у животных, подвергавшихся операции экспериментального эндометриоза. Исследования методом ЭПР модели невропатических болей [39] показали, что характерный для всех воспалительных реакций процесс возрастания в крови концентрации активной формы церулоплазмина и уменьшение содержания активной формы трансферрина имеют в этом случае свою специфику. Возрастание уровня церулоплазмина намного опережает по времени снижение уровня трансферрина. Возможно, дополнительный пик увеличения суммарной продолжительности болевых приступов связан с этим запаздыванием, наряду с нарушением конфигурации центра трансферрина (которая не фиксируется в модели невропатической боли и характерна для эндометриоза).

Еще одним аспектом применения ДНКЖ с глутатионом является обнаружение в образцах ткани ЭИ и тканей брюшины крыс контрольной и опытной групп активной формы рибонуклеотидредуктазы (см. рис. 4). Рибонуклеотидредуктаза — РНР (КФ 1.17.4.1) катализирует скорость-лимитирующую стадию синтеза ДНК, превращение рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды. От концентрации активной формы этого железосодержащего фермента зависит скорость роста клеток. Ингибирование активной формы этого радикального фермента приводит к существенному снижению скорости роста тканей. Наиболее эффективным ингибитором РНР является NO. Введение животным несвязанного NO не приводит к ингибированию РНР, поскольку время жизни этой малой молекулы (NO) невелико. Динитрозильные комплексы в силу специфики их деградации в организме способны продлить это время в несколько раз, что позволяет NO достичь каталитического центра этого фермента и заблокировать его.

Дублетный сигнал ЭПР РНР с g=2,005 и ΔH=2,2 мT фиксировали не только в ЭИ, но и в тканях, взятых с противоположной стороны брюшины, что сигнализирует о возможности появления там новых очагов эндометриоза. Примечателен тот факт, что содержание активной формы РНР в самих имплантах (см. рис. 4, а, б) меньше, нежели в непосредственно окружающих их тканях (см. рис. 4, в, г). В данном случае очаги прирастают краями, в то время как в середине очага идут деструктивные изменения ткани, вызванные воспалительным процессом. Такую же картину мы фиксировали при изучении содержания активной формы РНР в лейомиомах матки [40].

ДНКЖ с глутатионом при введении их животным с экспериментальным эндометриозом уменьшают средний размер имплантов в группе и снижают болевые ощущения.

Работа выполнена при финансовой поддержке Pоccийcкого фонда фундаментальныx иccледований (гpант 12-04-00346а) и гpанта Пpезидиума PАН по пpогpамме «Фундаментальные науки — медицине» на 2013 г.