Применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) очень часто становится единственным путем, позволяющим пациентам с бесплодием иметь генетически родных детей. Однако кумулятивная частота наступления беременности после года лечения методами ВРТ составляет в среднем 27,4% [1] и зависит от причин бесплодия, возраста женщины, конкретного ВРТ-центра. Это обусловливает необходимость дальнейшего поиска путей повышения эффективности лечения. В частности, это относится к прогностически неблагоприятной группе пациентов в отношении достижения беременности — супружеских пар с множественными неудачными попытками ВРТ, на долю которых в структуре обращаемости в репродуктивные клиники приходится около 20—30%. Многократное отсутствие имплантации может быть обусловлено комплексом причин, среди которых основными являются генетические, анатомические и гормональные факторы. Эмбриональный фактор является ключевым, так как он на 70% определяет вероятность имплантации [2]. Как правило, у таких пациентов возникает дополнительный фактор риска — длительность бесплодия [3], которая ассоциируется с повышением риска получения анеуплоидных эмбрионов, что позволяет предположить: группа пациентов с множественными неудачными циклами ВРТ характеризуется повышенной частотой получения генетически аномальных эмбрионов. В этой связи целесообразно применение методов преимплантационного генетического скрининга (ПГС) с целью селекции эуплоидных эмбрионов и повышения эффективности ВРТ-процедур.

Имплементация технологий преимплантационной диагностики в клиническую практику дала возможность проводить хромосомный анализ эмбрионов до переноса в полость матки, тем самым исключая основную причину спонтанных абортов на ранних сроках и повторных нарушений имплантации — хромосомные аберрации.

Цель работы — анализ эффективности применения метода сравнительной геномной гибридизации на микрочипах (aCGH) для преимплантационной диагностики эмбрионов у супружеских пар, характеризующихся множественными неудачными попытками ВРТ.

Преимплантационные исследования эмбрионов проводили в рамках циклов ВРТ с информированного согласия пациентов. В выборку вошли 182 эмбриона в 33 циклах ПГС пациентов с множественными неудачными циклами ВРТ (3,9±0,8 цикла), нормальным кариотипом супругов и возрастом женщины 33,9±5,4 года. Все пациенты имели нормальный кариотип. Оплодотворение ооцитов осуществлялось методом ICSI независимо от показателей спермограммы. Лазерная биопсия эмбрионов проводилась на стадии бластоцисты (5-е сутки развития), исследуемый материал — клетки трофэктодермальной оболочки. Биопсия проводилась при условии наличия не менее 3 эмбрионов качества не ниже 3ВВ и начавшегося хэтчинга. Эмбрионы после биопсии витрифицировались для дальнейшего использования в криоциклах. ПГС проводился методом тотального геномного скрининга — aCGH. С целью проведения анализа клетки трофэктодермы эмбрионов лизировали с последующим проведением полногеномной амплификации (SurePlex DNA Amplification system, «BlueGnome, Ltd.», UK). Пробы и референсную ДНК метили различными красителями (Су3 и Су5) (Fluorescent Labelling System [dCTP], «BlueGnome, Ltd.», UK), после чего комбинировали согласно протоколу производителя, смешивали с COT Human DNA (1 мг/мл, «BlueGnome, Ltd.», UK), DS Hybridization buffer («BlueGnome, Ltd.», UK), денатурировали на протяжении 10 мин при температуре 75 °С и гибридизировали на протяжении 18 ч на чипах 24sureV3 («BlueGnome, Ltd.», UK) при температуре 47 °С. После отмывки чипы сканировали с помощью Innocsan 710 («Innopsys», Франция), полученные изображения обрабатывали программным обеспечением BlueFuseMulti v. 3.1 («BlueGnome, Ltd.», UK). Наложение «сетки», количественную оценку, нормализацию и пост-процессинг проводили в автоматическом режиме. Хромосомный профиль оценивали на предмет наличия дополнительного либо потери генетического материала (gain & loss) на основании отклонения сегмента от изолинии на величину 3×SD и/или 0,3 log₂-ratio [4].

Группу контроля составили ретроспективно выбранные 134 пары с нормальным кариотипом и множественными неудачными попытками ВРТ (3,2±0,4 цикла), возрастом женщины 34,3±4,3 года, которым ПГС не проводился.

Статистический анализ выполнен с использованием F-теста и непараметрического критерия Пирсона (χ²). Критическим уровнем значимости статистических критериев считали значение p≥0,05.

Проведение ПГС методом aCGH позволило установить, что 52,7% 5-дневных эмбрионов в группе с множественными неудачными циклами ВРТ не имели несбалансированных хромосомных аномалий, что позволяло считать их эуплоидными/сбалансированными. Соответственно 47,3% были с хромосомными аномалиями. По данным [5], среди 3-дневных эмбрионов в аналогичной группе пациентов анеуплоидные эмбрионы составили 53,9% при исследовании методом aCGH и 36,2% — методом FISH. По данным [6], доля анеуплоидных эмбрионов в группе пациентов с множественными неудачными попытками ВРТ при исследовании методом FISH колеблется от 25,4 до 67,5% и зависит от количества детектируемых хромосом и также свидетельствует о возможных различиях в подходах к формированию выборки. В отношении aCGH, то в силу новизны метода еще не накоплена детальная статистика в научной литературе. Например, авторы [7] отмечают, что у пациенток с хорошим прогнозом в отношении достижения беременности анеуплоидия эмбрионов методом aCGH определяется на 5-й день развития в 44,9% случаев. По данным [8], в общей (безвыборочной) группе доля анеуплоидных эмбрионов составляет 69 и 51% на 3-й и 5-й дни развития соответственно.

Проведенное нами исследование позволило установить значительные различия в эффективности циклов ВРТ в зависимости от применения ПГС (см. таблицу).

Как видно из таблицы, в группе пациенток, которым проводился ПГС, частота наступления беременности была достоверно выше, чем в контрольной группе (63,6% против 13,6%). То же относится и к показателю имплантации (48,6% против 8,6%). Частота невынашивания беременности в нашем исследовании статистически значимо не различалась между группами. А более высокий процент оконченных циклов в контрольной группе связан с тем, что в группе с проведением ПГС были случаи отмены переноса эмбрионов по причине отсутствия эуплоидных эмбрионов. В контрольной же группе эмбриотрансфер не производился лишь в случае отсутствия морфологически нормальных эмбрионов на день предполагаемого переноса.

Сопоставляя собственные данные с результатами, опубликованными в доступной научной литературе, касающимися пациенток с множественными неудачными попытками ВРТ, отметим, что в работе [5] удалось достичь частоты беременности на перенос 21% при частоте имплантации 15% в случае использования aCGH. В случае использования FISH аналогичные показатели составляли 11 и 7% соответственно. Обзорные данные [6] свидетельствуют о том, что при применении FISH с целью ПГС в аналогичной группе пациентов частота беременности на перенос составляет, как правило, 14—34,7% при частоте имплантации 10—24,2%. В безвыборочной группе пациенток, по данным Reprogenetics [8], применение aCGH при использовании 3-дневных эмбрионов с целью ПГС позволяет достичь частоты наступления беременности 39 и 54% на цикл и перенос соответственно при частоте имплантации 39%. В случае анализа 5-дневных эмбрионов эти показатели составляют соответственно 50% (с разбросом 26—73% в зависимости от клиники) и 67% (53—94%) при частоте имплантации 61%. В группе пациенток с хорошим прогнозом [7] отмечают частоту наступления беременности в расчете на перенос 71%.

Анализируя приведенную информацию, можно подытожить, что применение aCGH-ПГС в группе пациенток с множественными неудачными циклами ВРТ является действенным механизмом повышения эффективности лечения. Однако при переносе хромосомно «нормального» эмбриона мы не можем иметь абсолютной гарантии адекватного функционирования генетического аппарата и элиминировать целый ряд причин невынашивания беременности, о чем может свидетельствовать обнаружение нормального кариотипа в материале спонтанных выкидышей и замерших беременностей. Не следует также абсолютизировать роль генетических факторов в имплантации. Да, этот аспект является одним из основных. Однако помимо него необходимо учитывать и морфологические характеристики эмбрионов, готовность эндометрия, гормональный статус женщины. Становится понятным, что частота наступления беременности является интегральным показателем эффективности и слаженности работы отдельных подразделений клиники и применение aCGH с целью ПГС в группе пациенток с множественными неудачными циклами ВРТ является одним из возможных путей повышения результативности работы репродуктивной клиники.