В настоящее время риск потери фертильности у женщин при онкологической патологии вследствие применения системной химиотерапии и лучевого лечения составляет 15—20%; это означает, что после окончания комплексного лечения каждая пятая женщина бесплодна [1]. В худших случаях речь идет о кастрации, т.е. о полной потере яичниковых функций. В то же время лечение солидных опухолей и некоторых видов рака (рак щитовидной железы), а также лимфом обеспечивает стойкую ремиссию и не препятствует наступлению в последующем беременности [2].
Потеря овариального резерва (ОР) — состояние, характеризующееся как снижением объема кортикального слоя в результате операций на яичниках (резекция, цистэктомия), так и потерей нормальной эндокринной и овуляторной функции в результате воздействия токсичных агентов при сохраненном объеме яичниковой ткани [3]. Некоторые схемы лечения аутоиммунных заболеваний также являются гонадотоксичными. Химиотерапия алкилирующими препаратами широко используется при болезни Бехчета, аутоиммунном гломерулонефрите, болезни Крона, неспецифическом язвенном колите и вульгарной пузырчатке (табл. 1).
Гонадотоксичность и отрицательное воздействие химиолучевого лечения в 99% случаев являются необратимыми, приводя как к снижению числа жизнеспособных примордиальных фолликулов, так и к полному замещению фолликулярного аппарата фиброзной тканью (табл. 2) [4].
Не только опухолевые заболевания, требующие системной гонадотоксичной терапии, приводят к потере ОР. Повторные операции на яичниках при рецидиве эндометриоидных кист, особенно с трудноконтролируемым применением коагуляции для достижения гемостаза, приводят к выраженному дефициту ОР, а иногда и к кастрации [3, 9]. Нередки случаи, когда выполняется овариэктомия или аднексэктомия при доказанном доброкачественном характере кисты, но при технической невозможности сохранения яичника или его адекватного кровоснабжения. Следует подчеркнуть, что любая лапароскопическая цистэктомия приводит к потере ОР, в том числе и по причине вторичного ожогового некроза в зоне коагуляции. Изучение функции яичников после второй лапароскопической операции по поводу двусторонних эндометриоидных кист показало полную потерю овуляторной функции у 7,3% женщин и кастрацию у 1,4%, даже в том случае, если хирурги оставляли какие-либо фрагменты яичниковой ткани — зона коагуляционного некроза полностью замещалась фиброзной тканью [5].
Описанные в настоящее время методы возможного сохранения эндокринной функции и фертильности могут можно условно разделить на следующие группы:
1. Фармакологическая протекция путем назначения агонистов ГнРГ (Бусерелин-депо). Назначение Бусерелина-депо за 7—10 сут до начала химиотерапии снижает риск снижения или потери ОР с 55 до 5% при лечении лимфом [6, 7].
2. Ингибиция апоптоза сфингозин-1-фосфатом. В настоящее время данная методика находится на экспериментальном этапе [6, 8].
3. Транспозиция яичников — методика, используемая и эффективная только при изолированной лучевой терапии при лечении болезни Ходжкина, раке шейки матки [5, 7].
4. Криоконсервация и последующая отсроченная трансплантация яичниковой ткани. Основные трудности реализации данной методики заключаются в том, что в отличие от витрификации отдельных клеточных элементов (широко применяемая методика в ВРТ) замораживание и размораживание многоклеточных тканевых структур значительной толщины (около 1—2 мм) приводят к гипоксическим нарушениям в тканях, а также к миграции воды из клеток в межклеточное пространство, несмотря на использование самых различных криопротекторных рецептур [7—12].
Предложенные на сегодняшний день методы сохранения «больших» объемов кортикального слоя (2×2×0,2 см) сопряжены с проблемой асептичности хранения, а также проблемой девитрификации. Кроме того, постоянный поиск «идеального» витрификационного раствора или раствора для криоконсервации сопряжен с включением в их состав новых соединений с неясной гаметотоксичностью при непосредственном контакте с тканью [5, 7, 9, 13].
Таким образом, для обеспечения адекватной сохранности кортикального слоя яичника необходимо располагать гарантированно нетоксичной технологией, которая позволяла бы сохранять большие объемы ткани (10 мм3 и более), не создавая проблем с девитрификацией, а также обеспечивала полную асептичность хранения образцов. В свете того, что благородные газы, обладающие химической инертностью (а значит, нулевой потенциальной токсичностью) способны вступать в физические взаимодействия с водой, выводя ее из метаболизма с образованием газовых гидратов при определенных условиях и, как следствие, препятствовать образованию кристаллов льда, их можно рассматривать в качестве перспективных «антифризов» [8, 14].
Нами был разработан оригинальный способ консервации кортикального слоя яичника с использованием в качестве криопротектора ксенона. Данный инертный газ обладает рядом преимуществ: тяжелее воздуха, имеет высокую проникающую способность в тканях человека, и главное — имеет наиболее «комфортные» условия для метастабилизации клатратов (около 1,6 бара при 0 °С).
Данный способ подразумевает экспозицию фрагментов кортикального слоя яичника в атмосфере ксенона для насыщения образцов и метастабилизации газовых гидратов при соответствующих условиях. Для консервации использовались фрагменты (страйпы) размером (20×5×2 мм). Хранение консервированных образцов осуществлялось в жидком азоте. Отогревание кортикального слоя выполняли при комнатной температуре в течение 15 мин. Эффективность сохранения кортикального слоя на преклиническом этапе оценивали с помощью суправитального окрашивания трипановым синим и электронно-микроскопического и гистологического исследований, по результатам которых обнаружена 100% выживаемость ткани после оттаивания, сохранность внутриклеточных мембран и митохондрий, отсутствие морфологических различий с незамораживаемым контролем.
Пациентка Р., 1974 г. рождения. В анамнезе в 1999 г. лапаротомия, овариэктомия слева (гистологическое заключение отсутствует). 2001 г. — лапароскопия, попытка адгезиолизиса, правый яичник не обнаружен. 2006 г. — лапароскопия по поводу полостного образования справа (киста яичника?). Частично из спаек выделено кистозное образование, предположительно исходящее из правого яичника, — частичная резекция кисты. Гистология — серозная киста. 17.08.12 — лапаротомия, правосторонняя аднексэктомия по поводу крупного (10 см) полостного образования в области правых придатков. В ходе операции дифференцировать ткань яичника и правую маточную трубу не представляется возможным. В проекции правых придатков — киста около 10 см в диаметре, тонкостенная, источники кровоснабжения четко не дифференцированы. Выполнено удаление кисты (предположительно правосторонняя овариэктомия). Манипуляции затрудняет тотальный спаечный процесс органов брюшной полости. После операции путем препаровки в стерильных условиях выделены 3 страйпа кортикального слоя 20×2×4 мм. Выполнена криоконсервация в ксеноне. После операции на 8-е сутки: антимюллеров гормон (АМГ) — 0,05 нг/мл, эстрадиол 19,66 пг/мл, ФСГ — 63,39 мМЕ/мл, ЛГ — 47,33 мМЕ/мл. Через 1 мес после операции: АМГ — 0,02 нг/мл, эстрадиол — 5 пг/мл, ФСГ — 86 мМЕ/мл. Стойкая аменорея; заместительную гормонотерапию пациентка не получала. 31.10.12 — реимплантация размороженных страйпов кортикального слоя под париетальную брюшину минилапаротомным доступом. Реимплантация одномоментная, без этапа формирования грануляций. Аутотрансплантаты фиксированы к брюшине с использованием микрохирургической техники. Через 76 сут после операции: спонтанная менструация. АМГ 4,6 нг/мл, эстрадиол 87,23 пг/мл; ФСГ — 13,48 мМЕ/мл, ЛГ — 13,42 мМЕ/мл. Ультразвуковое исследование области аутотрансплантатов 13.02.13 выявило субперитонеальный мультифолликулярный комплекс с диаметром фолликулов до 23 мм (см. рисунок).
Методика ксеноновой витрификации позволила провести криоконсервацию трансплантатов значительного объема (около 100 мм3) и достаточной толщины (1—1,5 мм), а также их сохранность после оттаивания. Такой результат недостижим при использовании традиционных методик витрификации или программном замораживании. Технологическим ограничением к объемам консервируемых тканей служит лишь форма, размер и устройство носителя, позволяющего работать с ксеноном. Применение таких аутотрансплантатов в отличие от более мелкой фрагментации кортикального слоя — до 1—2 мм3 позволяет выполнять фиксацию в тканях пересаживаемых фрагментов, что также положительным образом сказывается на последующей васкуляризации [3]. Щадящая фиксация аутотрасплантатов в хорошо кровоснабженных тканях позволяет избежать этапа формирования грануляций на донорской поверхности. Следовательно, как и в нашем случае, возврат кортикального слоя можно выполнять одномоментно подбрюшинно с локализацией, которая зависит от преследуемых целей (дальнейшая необходимость пункции для взятия яйцеклетки или размещение intra cavitas peritonei для спонтанного оплодотворения).
В то же время существует мнение, что поскольку трансплантация фрагментов коркового вещества яичников производится без создания сосудистых анастомозов, серьезные препятствия для восстановления репродуктивной функции создает ишемическая травма трансплантата в период его реваскуляризации [12]. Из-за ишемии ткани ОР сокращается, а срок «жизни» трансплантата уменьшается. В нашем случае восстановление менструального цикла на 76-е сутки после трансплантации свидетельствует в пользу того, что в ходе замораживания, хранения и расконсервации сохранными остался не только пул примордиальных фолликулов, наиболее стойких к гипоксии и повреждающему действию холода, но и фолликулы на 8—9-суточных стадиях развития (при полном цикле созревания ооцита 85 сут) [15]. В отличие от подкожной пересадки фрагментов яичника субперитонеальная трансплантация обеспечивает наиболее физиологичный температурный режим, адекватное кровоснабжение за счет возможности щадящей фиксации и развитой микроциркуляторной сети париетальной брюшины, а также отличную от жировой ткани кислотно-основную буферную емкость [13, 16].
Отработка и дальнейшее совершенствование данного метода ксенонового замораживания тканей позволят оценить возможность трансплантации криоконсервированных тканевых фрагментов значительных объемов.