Аллельные полиморфизмы генов фолатного обмена у мужчин со сниженной репродуктивной функцией

В последнее время в мире актуальным становится изучение причин снижения репродуктивной функции у мужчин. Следует отметить, что по статистике практически в 40% случаев причиной бесплодия супружеских пар является мужской фактор. Снижение репродуктивной функции у мужчин в 15% случаев обусловлено генетическим фактором [1]. Нарушение процесса сперматогенеза на разных его стадиях может привести к нарушению целостности ДНК или наличию хромосомных отклонений в ядрах сперматозоидов. Причиной нерасхождения хромосом при формировании зрелых мужских половых клеток и фрагментации ДНК сперматозоидов может быть нарушение фолатного обмена [2]. Фолатный обмен является одним из ключевых биохимических циклов в организме. Процессы, происходящие в каскадном превращении фолатов, играют важную роль в функционировании ДНК, дезинтоксикации генотоксичных веществ и т.д. Гены фолатного обмена, исследование которых представляет интерес для выявления причин бесплодия: 5,10-метилентетрагидрофолат-редуктаза (MTHFR), метионин-синтаза (MTR), метионин-синтаза-редуктаза (MTRR). Существует ряд аллельных вариантов гена MTHFR, вызывающих тяжелую недостаточность фермента, но большинство из этих вариантов редки. Практическое значение имеют два полиморфизма: С677Т в экзоне 4 и А1298С в экзоне 7. Наименее изученными из генов фолатного обмена являются гены MTRR A66G, MTR A2756G [3].

Цель настоящего исследования — на основании комплексного генетического обследования мужчин со сниженной репродуктивной функцией исследовать связь между нарушением мейоза и нарушением целостности ДНК сперматозоидов в ходе сперматогенеза и особенностями полиморфизмов генов фолатного обмена MTHFR (C677T, A1298C), MTRR (A66G).

Проведено комплексное генетическое обследование 107 пациентов в рамках программы лечения бесплодия методом ВРТ. Материалом исследования для дальнейшего анализа были лейкоциты периферической крови. Для выделения ДНК из лейкоцитов был использован общепринятый метод [4]. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphisms, SNP) генов MTHFR (C677T, A1298C), MTRR (A66G) был проведен с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), которую проводили на термоциклере ABI PRISM 7500 («Applied Biosystems», США) при следующих температурных и временных параметрах: начальная инкубация для денатурации ДНК-матрицы и активации FastStart Taq ДНК-полимеразы: 95 °С, 8 мин; денатурация: 95 °С, 15 с; отжиг: при 60 °С — 2 мин; число циклов — 40. Для проведения ПЦР-РВ использовали универсальный набор реагентов TaqMan Environmental Master mix фирмы «Applied Biosystems» (США), в состав которого входит референсный краситель ROX (6΄-карбокси-X-родамин). ПЦР-РВ проводили в объеме реакционной смеси 25 мкл, включая 12 мкл буфера TaqMan, 0,8 мкмоль каждого праймера, 0,07 мкмоль специфической пробы и 5 мкл ДНК [5]. Общее время амплификации составило 1 ч 32 мин.

Для выявления анеуплоидий в ядрах сперматозоидов по хромосомам 13, 16, 18, 21, X, Y был применен метод флюоресцентной гибридизации in situ (fluorescence hybridization in situ, FISH). Для проведения исследования сперма изначально была отмыта с помощью раствора PBS (phosphate buffer saline, «Sigma»). Затем каждый исследуемый образец был зафиксирован с помощью 96% этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). Зафиксированный препарат был выдержан при –20 °С в течение 12—14 ч. Для последующей отмывки и фиксации были использованы растворы 70%, 90% и 96% этанола. Для флюоресцентной гибридизации были применены следующие ДНК-зонды: CEP 16 (D16Z3) Satellite II DNA SpectrumAqua, LSI 13 (13q14) SpectrumGreen, CEP Y (DYZ3) Satellite  DNA SpectrumOrange, CEP X (DXZ1) Alpha Satellite  DNA SpectrumGreen, CEP 18(D18Z1) Alpha Satellite DNA SpectrumAqua, LSI 21 (loci D21S259, D21S341, D21S342, region 21q22.13-q22.2) SpectrumOrange («Vysis-Abbott», США). С целью денатурации ДНК-препарат с добавленными ДНК-зондами был в течение 10 мин выдержан при 75 °С. Последующая гибридизация ДНК-зонда с ДНК-мишенью занимала 5 ч при 42 °С. Анализ флюоресцентного сигнала был проведен с помощью флюоресцентного микроскопа Nikon Eclipse 80i. В норме содержание анеуплоидных сперматозоидов в эякуляте не должно превышать 1,3% [6]. Полученные данные статистически обработаны с помощью φ-критерия Фишера [7].

Содержание анеуплоидных сперматозоидов в эякуляте превысило 1,3% у 46 из 107 пациентов. Полиморфные варианты С677Т в экзоне 4 и А1298С в экзоне 7 гена MTHFR и полиморфный вариант гена MTRR A66G были выявлены в различных сочетаниях у 80 мужчин. У 27 пациентов полиморфные состояния исследуемых генов не выявлены. Среди мужчин с нормальным генотипом высокое содержание анеуплоидных сперматозоидов обнаружено у 22,2% (у 6 из 27 пациентов). Среди носителей полиморфных вариантов исследуемых генов высокое содержание сперматозоидов с хромосомными нарушениями было выявлено у 50,0% (у 40 из 80 пациентов). Результаты приведены в таблице.

Фото отдельных анеуплоидных ядер сперматозоидов представлены на рис. 1, 2.

Настоящее исследование подтверждает связь между генетически обусловленным нарушением процессов фолатного обмена и наличием численных хромосомных нарушений в мужских половых клетках. Высокое содержание анеуплоидных сперматозоидов значительно чаще выявляется для носителей полиморфных вариантов генов фолатного обмена MTHFR (C677T, A1298C) и MTRR (A66G) (р<0,05). Анализ полиморфизмов генов фолатного обмена MTHFR (C677T, A1298C), MTRR (A66G) необходимо использовать в комплексном генетическом обследовании мужчин со сниженной репродуктивной функцией.