Экспрессия индоламин-2,3-диоксигеназы у пациенток с самопроизвольными выкидышами ранних сроков

Среди причин преждевременного прерывания беременности одно из лидирующих мест занимают воспалительные заболевания [1, 2]. Женщины с хроническим эндометритом имеют достоверно более низкую частоту имплантации эмбриона по сравнению с пациентками с нормальным эндометрием (11 и 58% соответственно) [3]. В большинстве случаев при обнаружении хронического эндометрита, являющегося причиной невынашивания беременности, специфический возбудитель установить не удается, что свидетельствует о неспецифическом характере воспаления в связи с изменениями местной иммунореактивности [4].

В этой связи представляет интерес изучение роли фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (indoleamine-2,3-dioxygenase, IDO), оказывающей иммуносупрессивное и антимикробное действие, в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков. IDO представляет собой фермент, который катаболизирует триптофан по кинурениновому пути и тем самым способствует супрессии Т-клеточного звена иммунитета из-за образования токсичных для них продуктов катаболизма [5—7]. Показана способность IDO блокировать пролиферацию Т-лимфоцитов и подавлять активацию комплемента, а также препятствовать активации дендритных клеток [8—10].

IDO широко экспрессируется в большинстве органов и тканей, в том числе в хорионе, плаценте и децидуальной оболочке [11, 12]. In vitro установлено, что активация IDO в клетках трофобласта способствует подавлению клеточного иммунитета и развитию иммунной толерантности к эмбриону [13]. В культуре клеток показано, что экспрессия IDO стимулируется γ-интерфероном, синтез которого в свою очередь зависит от экспрессии Толл-подобного рецептора 3 [14]. Кроме того, IDO является основным внутриклеточным механизмом защиты от ряда патогенов, в частности, хламидий, лишая их незаменимой аминокислоты — триптофана [15, 16].

Однако роль IDO в патогенезе невынашивания беременности in vivo и ее взаимосвязь с экспрессией Толл-подобных рецепторов (TLR) практически не изучалась.

В связи с этим представляет интерес изучение особенностей экспрессии IDO у пациенток с самопроизвольными выкидышами ранних сроков.

Цель работы — изучить экспрессию IDO в эпителии цервикального канала у женщин с самопроизвольными выкидышами на ранних сроках беременности и ее взаимосвязь с экспрессией TLR.

Основную группу составили 57 пациенток, поступивших в МУЗ «Городская клиническая больница №1» Белгорода с симптомами самопроизвольного выкидыша на сроке 6—10 нед беременности, контрольную — 57 женщин, обратившихся для проведения медицинского аборта на этих же сроках. В качестве материала использовали соскоб эпителиальных клеток, полученных из цервикального канала, которые помещали в консервирующий раствор RNAlater («Ambion»). Для определения экспрессии мРНК TLR 1—4 и IDO использовали метод количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). РНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции с использованием реактива Тризол («Invitrogen», США). Полученную РНК обрабатывали ДНКазой с использованием набора DNAse I RNAse free («Fermentas», США). Для проведения обратной транскрипции использовали обратную транскриптазу Mint и oligoDT («Евроген», Россия). В смесь для реакции вносили 500 нг РНК. Для ПЦР в режиме реального времени был произведен подбор специфических праймеров в базе данных Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov). В качестве генов-нормировщиков использовали β-актин и пептидилпролилизомеразу А. Амплификацию проводили на аппарате SFX96 («Bio-Rad», США) со смесью qPCR-mix HS SYBR («Евроген», Россия). Полученные результаты выражали в относительных единицах (relative units), вычисляя их по формуле:

R= 2[(Cq ref1+ Cq ref2)/2 — Cq target], где R — нормализованная экспрессия мРНК исследуемых генов, Cq ref1 и Cq ref2 — Cq генов-нормировщиков, Cq target — Cq исследуемого гена [17].

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы Statistica 6.0. Достоверность различий оценивали по Манну—Уитни, представляя результаты как медиану (нижний квартиль; верхний квартиль). Для корреляционного анализа использовали критерий Спирмена.

Установлено, что уровень экспрессии мРНК IDO у пациенток с самопроизвольными выкидышами был достоверно выше, чем в группе контроля [33,61 (0,69; 314,08) против 11,47 (0,39; 1230,47) соответственно; p=0,001; табл. 1].

Согласно данным литературы, повышение уровня IDO способствует формированию иммунной толерантности к антигенам плодного яйца. Поэтому повышение уровня IDO у пациенток с самопроизвольным выкидышем, по-видимому, является защитным механизмом, направленным на борьбу с внутриклеточными патогенами и способствующим супрессии клеточного звена иммунитета.

Между экспрессией мРНК IDO и TLR3 наблюдалась умеренная высокодостоверная положительная корреляционная связь (R=0,31; p=0,009). Это соотносится с данными литературы, согласно которым in vitro экспрессия IDO в клетках трофобласта зависит от активации TLR3, приводит к повышению продукции γ-интерферона, являющегося индуктором синтеза IDO [14]. Так как лигандом для TLR3 является двухцепочечная РНК вирусов, то описанный механизм активации IDO характерен для вирусных инфекций [18, 19]. Однако так как достоверных различий в экспрессии мРНК TLR3 в основной и контрольной группах не наблюдалось, можно предположить, что вышеуказанный механизм активации IDO во время беременности не является основным.

Поэтому было изучено влияние на экспрессию IDO TLR, стимуляторами которых являются бактериальные лиганды, — TLR1, TLR2 и TLR4. У пациенток с самопроизвольными выкидышами наблюдалась достоверно более высокая экспрессия мРНК TLR1 — 0,00051 (0,000005; 0,00130) против 0,00001 (0,000001; 0,000005) в контроле (p<0,01), а также TLR2 — 0,00266 (0,00061; 0,00923) по сравнению с 0,00024 (0,00005; 0,00123) в контрольной группе (p<0,01). Также было выявлено достоверное увеличение уровня экспрессии мРНК TLR4 — 0,000021 (0,000002; 0,000078) против 0,000003 (0,000001; 0,000046) в контроле (p<0,05).

Отмечалась достоверная сильная корреляционная связь между уровнем экспрессии мРНК TLR1 и TLR2 (R=0,76; p=0,000028) (табл. 2).

Экспрессия IDO достоверно коррелировала с уровнем TLR2 (R=0,39; p=0,002) и TLR4 (R=0,30; p=0,013).

В немногочисленных работах на культурах клеток было показано, что экспрессия IDO зависит от стимуляции TLR2 и TLR4. Так, в эксперименте на человеческих десневых фибробластах в культуре клеток была показана возможность стимуляции экспрессии IDO лигандами TLR2 и TLR4 [21]. M. Park и соавт. [22] также в работе на фибробластах показали возможность стимуляции синтеза IDO через активацию не только TLR3, но и TLR4, причем активация TLR4 происходит по MyD88-зависимому пути, который не приводит к синтезу γ-интерферона.

Однако корреляцию между экспрессией мРНК IDO и TLR, активируемых бактериальными лигандами, можно объяснить не только прямой стимуляцией экспрессии IDO через TLR2 и TLR4. Описан механизм стимуляции TLR3 вирусными лигандами, что приводит к повышению экспрессии IDO, которое в свою очередь способствует снижению уровня интерлейкина 10 и фактора некроза опухоли-α.

В эксперименте на мышах повышение экспрессии IDO, индуцированное вирусом гриппа, приводило к развитию вторичной бактериальной пневмонии из-за иммуносупрессии [23]. Поэтому повышение экспрессии TLR2 и TLR4 может быть вторичным в ответ на увеличение бактериальной обсемененности.

Таким образом, у пациенток с самопроизвольными выкидышами ранних сроков беременности наблюдается достоверное увеличение экспрессии мРНК TLR 1, 2 и 4, лигандами которых являются структуры бактерий, что, вероятно, способствует гиперактивации системы врожденного иммунитета и отторжению плодного яйца. Это увеличение сопровождается активацией синтеза IDO, которая, возможно, является компенсаторной или способствует избыточной иммуносупрессии Т-клеточного иммунитета. Однако не исключен механизм вторичной гиперактивации TLR в ответ на увеличение роста бактериальной флоры вследствие иммуносупрессии, вызванной избытком синтеза IDO.

Исследование выполнено по гранту Президента РФ МД-936.2012.7.