В последние годы наблюдается тенденция к увеличению нарушений мужской репродуктивной функции, сопровождаемых снижением уровня фертильности. Причиной таких изменений служат факторы внешних и внутренних воздействий. Нормальное развитие процесса сперматогенеза регулируется физиологическим уровнем концентрации половых гормонов, ферментов, микроэлементов, витаминов, белков и других веществ. Для осуществления функции оплодотворения женской яйцеклетки сперматозоиду необходимо иметь нормальную морфологию, генетические и эпигенетические структуры, в частности правильную упаковку хроматина протаминами, модификацию гистонов и др. [1, 3, 7, 8].

Известно, что часть сперматозоидов в процессе дифференцировки подвергается апоптозу, который на ранних стадиях характеризуется активацией эндонуклеаз, расщеплением ДНК, протеолитической деградацией ядерной оболочки, а завершающей стадией процесса является нарушение проницаемости клеточной мембраны, за которой следует деструкция клетки [2, 5, 9, 11].

Одним из критериев оценки качества спермы, рекомендованных ВОЗ, является подсчет процента жизнеспособных сперматозоидов, точнее тех, клеточная мембрана которых непроницаема для витальных красителей, в частности для эозина.

Краситель добавляют к сперматозоидам и подсчитывают число окрашенных клеток при помощи световой микроскопии [4, 13].

В последние годы стало возможным применение флюоресцирующих красителей, которые, как и эозин, проникают только в клетки с поврежденной мембраной. Такое окрашивание позволяет проводить подсчет жизнеспособных клеток на проточном цитометре, что имеет ряд преимуществ — быстрый подсчет большого количества объектов с оценкой их величины и анализом внутриклеточных структур, в частности состояния хроматина [6, 10, 12].

Цель исследования — сравнение двух методов определения жизнеспособности сперматозоидов, а также изучение изменения подвижности сперматозоидов, находившихся в разных условиях инкубации.

Обследованы 43 пациента: 12 здоровых мужчин, 20 больных, страдающих варикоцеле, и 11 больных с хроническим простатитом.

Эякулят получали общепринятым способом по рекомендациям ВОЗ 4-го издания [13, 14 |.

Проницаемость клеточной мембраны для эозина (ЭО) осуществляли, исходя из методов того же издания. Использовали 1% раствор водорастворимого ЭО с дальнейшим подсчетом процента окрашенных сперматозоидов под световым микроскопом с увеличением 400.

Для исследования жизнеспособности сперматозоидов с помощью проточного цитометра Culler lipix XL применяли метод, разработанный фирмой «Molecular Probes», предполагающий использование двух флюорохромов: пропидия йодида (ПИ) и сибра-14 (СИ-14), испускающих свет в различных областях спектра и регистрируемых разными каналами. ПИ проникает только в клетки с поврежденной мембраной и окрашивает их ДНК (красная флюоресценция). СИ-14 способен проникать также через неповрежденную мембрану, окрашивая нуклеиновые кислоты (зеленая флюоресценция) всех сперматозоидов. При инкубации спермы с обоими красителями жизнеспособные клетки окрашиваются только СИ-14, а мертвые клетки с поврежденной мембраной — и СИ-14, и ПИ.

Образец спермы разводили солевым буфером HEPES 1:100 и последовательно окрашивали вначале СИ-14 в концентрации 0,2 мМ с последующей инкубацией в течение 10 мин при 37 °С, затем вносили ПИ в концентрации 2,4 мМ с дальнейшей 10-минутной инкубацией. Далее результаты подсчитывали на проточном цитометре. В каждом образце подсчитано 10—15 тыс. объектов.

При подсчете свежевыделенных (в течение первых 3 ч) сперматозоидов обоими методами результаты обычно были очень близки, в редких случаях различаясь на 10—15%.

Из табл. 1

Это позволяет рекомендовать использованные методы в рутинную практику клинической андрологической лаборатории.

Наряду с исследованием свежевыделенных сперматозоидов в ряде случаев сперму оставляли на 24 ч при комнатной температуре (20—22 °С), после чего вновь подсчитывали количество клеток, окрашиваемых ЭО и ПИ (для ЭО — из общего числа 100—200 сперматозоидов).

Полученные данные (см. табл. 1) свидетельствуют, что после 24 ч инкубации флюоресцентный метод с более высокой степенью достоверности выявляет большее количество клеток с поврежденной мембраной, чем световая микроскопия.

Определение жизнеспособности сперматозоидов после криоконсервации — важная проблема в современной андрологии и репродуктологии, связанная с необходимостью длительного хранения полноценной спермы для использования как в программах ВРТ, так и в животноводстве.

В этой связи было проведено определение жизнеспособности сперматозоидов вышеописанными методами после криоконсервации спермы человека в жидком азоте. В качестве криоконсервантов применяли стерильную среду для замораживания (Sperm Freeze, Бельгия), которую используют в практике процедур ВРТ.

Замораживание и размораживание проводили по стандартной схеме. Определение жизнеспособности сперматозоидов осуществляли сразу после размораживания.

Полученные результаты показывают достоверно более высокую выявляемость поврежденных клеток при применении метода проточной цитометрии (см. табл. 1).

С целью изучения влияния оксидативного стресса, создаваемого в клетке активными формами кислорода, включая Н₂О₂, влияющими на жизнеспособность сперматозоидов и оказыващими повреждающее действие на мембрану клетки, были предприняты опыты с добавлением разных концентраций (1,5 и 3%) перекиси водорода в среду со сперматозоидами. Уровень повреждения мембраны сперматозоидов определяли обоими методами после воздействия на них перекиси водорода в разных концентрациях (см. табл. 1).

Поскольку результаты воздействия двух концентраций перекиси водорода на сперматозоиды были сопоставимы, это позволило объединить их в одну группу. Как видно из табл. 1, метод проточной цитометрии выявляет существенно более высокий процент поврежденных клеток. ЭО в этих условиях менее пригоден для определения жизнеспособности сперматозоидов.

Возможной причиной расхождения результатов оценки проницаемости мембраны клеток, окрашенных ПИ или ЭО, могло, по нашему мнению, явиться преобладание разных форм клеточной гибели: в свежевыделенной сперме нежизнеспособные клетки — это в первую очередь сперматозоиды на поздней стадии апоптоза, а криоконсервация и воздействие перекиси водорода приводят к появлению значительного количества сперматозоидов, претерпевающих некротическую форму гибели [6]. В этом случае, по-видимому, флюоресцентный метод является более чувствительным и поэтому предпочтительным.

Учитывая тот факт, что продвижение сперматозоидов к женской яйцеклетке проходит в кислой среде (pH влагалища 6,0) в участках бактериального обсеменения и, возможно, воспаления, мы провели изучение влияния этих факторов на подвижность сперматозоидов. Воздействие кислой среды на сперматозоиды in vitro может служить прогнозом сохранения фертильности сперматозоидов в реальных условиях. В табл. 2

Нативный эякулят после разжижения (1 мл) центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин. Супернатант сливали, к осадку добавляли 1 мл раствора Хенкса, забуференного MES (1 мМ) до pH 5,7. При этом pH нативного эякулята был равен 7,6. После смешивания с раствором pH эякулята снизился до 6,2. Через 24 ч pH исходного эякулята составил 7,5. Показатель pH эякулята с буфером MES снизился до 5,9.

В табл. 2 приведены результаты исследования двух групп образцов эякулята с разной исходной общей подвижностью: ниже нормы и нормальный уровень. В серии опытов с низкой исходной подвижностью через 1 ч инкубации подвижность сперматозоидов снизилась почти в 2 раза и к 3-му часу составила 1/3 от исходного уровня. В серии с нормальным исходным уровнем подвижности изменения были менее существенными. Через 24 ч в обеих сериях опытов не обнаружены образцы эякулята с подвижными сперматозоидами.

После разжижения эякулята отбирали 1 мл пробы и центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин. Супернатант сливали и к осадку добавляли 1 мл раствора Хенкса, забуференного HEPES (1 мМ) до pH 7,2. Нативный эякулят имел pH 7,6 и после внесения буфера pH стал равен 7,3. Через 24 ч инкубации эякулята показатель pH в обоих случаях не изменился.

Полученные результаты в образцах эякулята с разной исходной общей подвижностью по отношению к начальному уровню показали незначительное снижение подвижности в течение 1-го часа инкубации и более заметное снижение через 3 и 24 ч инкубации. Сравнение двух групп образцов эякулята с разной исходной подвижностью не выявило различий в процессе инкубации, но она уступала уровню подвижности в контрольных образцах (см. табл. 2).

В следующей серии экспериментов оценивали подвижность сперматозоидов в зависимости от температуры инкубации эякулята на протяжении 24 ч. Полученную порцию эякулята после разжижения делили на две равные части и одну помещали в термостат при 37 °С, другую оставляли при комнатной температуре (20 °С). Полученные результаты представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, активная подвижность сперматозоидов существенно различается в зависимости от температуры инкубации. При хранении образцов эякулята в термостате активная фракция существенно превышает таковую при 20 °С инкубации. Вместе с тем практическая значимость оценки подвижности сперматозоидов подтверждает приемлемость хранения эякулята при комнатной температуре. Длительная инкубация в условиях термостата чревата возникновением бактериальной обсемененности.

1. Сравнение двух методов определения жизнеспособности сперматозоидов, основанных на проницаемости клеточной мембраны разными красителями, показало, что при исследовании свежеполученной спермы оба метода дают аналогичные результаты и являются взаимозаменяемыми.

2. После определенных воздействий на эякулят in vitro (длительное хранение, криоконсервация, обработка перекисью водорода) цитофлюориметрический метод выявляет достоверно более высокий процент сперматозоидов с поврежденной клеточной оболочкой.

3. ЭО недостаточно адекватно отражает уровень повреждения мембраны сперматозоида при различных воздействиях.

4. В кислой среде (pH 6,2) сперматозоиды теряют подвижность в течение 1-го часа инкубации.

5. Температура среды инкубации эякулята оказывает наибольшее влияние к концу 1-х суток.