Необходимость тестирования на эмбриотоксичность пластиковой посуды, используемой при культивировании эмбрионов, очевидна большинству эмбриологов, и данный вопрос подробно освещен в литературе [1]. Тем не менее номенклатура посуды для культур клеток, прошедшей тест на эмбриотоксичность, весьма ограничена и не покрывает всех потребностей эмбриологов.

Поскольку токсичность пластиковой посуды может определяться присутствием загрязнений различной природы [1—3], методы контроля эмбриотоксичности до сих пор не стандартизованы, и каждый производитель пластиковой посуды проводит тестирование по оригинальной методике. В последнее время активно предлагается проведение теста на эмбриотоксичность на эмбриональных стволовых клетках [4, 5], однако наиболее проверенным и распространенным методом контроля эмбриотоксичности является MEA-тест (тест на мышиных эмбрионах), определяющий пригодность пластика для культивирования эмбрионов по выходу бластоцист через 96 ч культивирования. Однако особенности проведения теста в конкретной лаборатории могут существенно влиять на чувствительность метода и результаты тестирования.

В настоящей работе описан метод тестирования пластиковой посуды на эмбриотоксичность, разработанный и используемый в НПП «ПанЭко» для контроля качества пластика для экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Приведены результаты тестирования пластиковой посуды, поступившей в «ПанЭко» в течение 2009—2010 гг.

Культуральные среды и расходные материалы. Все использованные в работе питательные среды (ПС) и реактивы производились в ООО НПП «ПанЭко» (Москва).

Для тестирования на эмбриотоксичность использовали культуральный пластик трех производителей: NUNC (Дания), «Corning» (США) и «SPL Lifesciences» (Корея). Культивирование проводили в 4-луночных планшетах производства SPL Lifesciences (Корея).

Подготовка образцов. Среда ЭКО ПРО «Дробление» была использована для подготовки смывов с тестируемой пластиковой посуды. Смывы получали инкубированием среды из расчета 0,05—0,1 мл на 1 см² поверхности пластика в течение 2—5 ч в СО₂-инкубаторе. Стандартный протокол подготовки образца включает повторение данной процедуры последовательно на 3 образцах из данной серии продукции.

Получение и культивирование эмбрионов мышей. Получение эмбрионов мышей подробно описано нами ранее [6]. Собранные зиготы от 5—7 самок случайным образом распределяли по 25—30 штук в лунку 4-луночного планшета (групповое культивирование) или культивировали индивидуально. Индивидуальное и групповое культивирование проводили в 100 мкл экспериментальной и контрольной ПС под минеральным маслом (ПанЭко) в атмосфере 6% СО2 при 37 оС.

Через 24 ч после помещения зигот в ПС подсчитывали количество образовавшихся двухклеточных эмбрионов. Подсчет бластоцист осуществляли через 96 ч после помещения зигот в ПС. Процент выхода бластоцист считался по отношению к двухклеточным эмбрионам, образовавшимся через 24 ч после посадки.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента.

Содержание эндотоксинов определяли в тесте с лизатом амебоцитов Limulus Polyphemus по общепринятой методике (МУК 4.1/4.2.588-96, с.33 «Определение содержания бактериальных эндотоксинов»).

Групповой метод культивирования малопригоден для анализа эмбриотоксичности, поскольку его чувствительность значительно ниже, чем при индивидуальном культивировании эмбрионов мыши (табл. 1).

Для повышения чувствительности метода мы использовали последовательное ополаскивание пластиковой посуды из одной партии. Из табл. 2

Одной из причин эмбриотоксичности пластиковой посуды может быть наличие эндотоксинов на поверхности пластика. Поэтому мы контролировали их содержание в среде, используемой в МЕА-тесте. Приведенные в табл. 2 данные показывают, что прямой корреляции между эмбриотоксичностью среды и содержанием в ней эндотоксинов при тестировании пластика не наблюдается. После получения такого результата в нескольких партиях эмбриотоксичного пластика мы прекратили проведение контроля на содержание эндотоксинов.

В результате контроля эмбриотоксичности пластиковой посуды в течение 2 лет (2009—2010) были обнаружены некоторые закономерности. Было протестировано 19 партий пластика, изготовленного из полистирола, и 8 партий — из полипропилена. Эмбриотоксичность изделий из полипропилена (в среднем 54% выхода бластоцист) значительно превосходила таковую для полистирола (79%; p<0,05). В результате принятый критерий эмбриотоксичности — выхода бластоцист 80% не прошли 62% (5 партий) изделий из полипропилена и 21% (4 партии) изделий из полистирола. Партии эмбриотоксичного пластика встречались у всех производителей.

Разработка эффективного протокола тестирования пластиковой посуды представляется актуальной задачей, поскольку на российском рынке предлагается разнообразный пластик, не прошедший надлежащий контроль. При этом метод контроля должен быть не слишком трудоемким, но и не допускающим ложноотрицательных результатов.

Ранее было показано, что для тестирования реактивов требуется культивирование не менее 69 эмбрионов в одной пробе [8]. Поэтому возможность увеличить токсический эффект пластика за счет его последовательного споласкивания ПС является существенным преимуществом данного протокола. В результате в каждом тесте достаточно использовать 25—30 мышиных эмбрионов, что значительно увеличивает пропускную способность данного метода.

Неограниченно увеличивая количество ополаскиваний пластиковой продукции в данном тесте, можно добиться появления ложноположительных результатов, когда эмбриотоксичность пластика будет неоправданно завышенной. Нам представляется, что выбранное нами трехкратное споласкивание пластика достаточно близко к реальным условиям его использования. На это также указывает не слишком высокая доля пластиковой посуды, не прошедшей контроль на эмбриотоксичность.

Эмбриотоксичность пластика может определяться широким спектром загрязнений. Эндотоксины, по нашим данным, не имеют существенного вклада в определение эмбриотоксичности пластиковой посуды. Мы не ставили задачей настоящего исследования выяснение природы токсичности, но существенные различия между токсичностью изделий из полипропилена и полистирола показывают, что токсины, по-видимому, появляются во время штамповки изделий и связаны, вероятно, с различной технологией производства полистироловой и полипропиленовой посуды.

На основе первого опыта тестирования пластиковой посуды могут быть сделаны предварительные выводы. Конечно, для целей ЭКО целесообразно использовать только пластиковую посуду, прошедшую МЕА-тест. Однако перечень сертифицированной на эмбриотоксичность пластиковой посуды ограничен. Поэтому при отсутствии паспорта на эмбриотоксичность с особой осторожностью следует пользоваться изделиями из полипропилена. Два класса изделий производятся только из этого полимера: наконечники для автоматических пипеток и криопробирки. Тестирование этой продукции на эмбриотоксичность особенно важно. В крайнем случае многократное споласкивание пластика перед использованием ПС для ЭКО крайне желательно.