На сегодняшний день более 460 млн людей во всем мире страдают сахарным диабетом; по прогнозам Международной федерации диабета к 2040-му году число больных возрастет до 642 млн [1].
Сахарный диабет сопровождается развитием осложнений, в том числе синдромом диабетической стопы (СДС), одним из ведущих клинических симптомов которого является персистенция язвенного дефекта на коже нижних конечностей [2]. Развиваясь на фоне нейропатии, ишемии и постоянного травмирования, дополненных метаболическими сдвигами, индуцированными гипергликемией, такие язвенные дефекты плохо поддаются лечению, повышают риск ампутаций, инвалидизации и смерти пациентов [3]. Описанная ситуация обусловливает актуальность изучения патогенетических аспектов формирования хронических ран при сахарном диабете и потенциальных способов их лечения.
В настоящее время уделяется особое внимание влиянию нервной системы на ключевые механизмы ранозаживления, особенно на пролиферацию и миграцию кератиноцитов — основных клеток кожного покрова человека [4].
Сложность изучения механизмов ранозаживления при сахарном диабете связана, во-первых, с наличием в коже собственной не-нейрональной катехоламинергической системы [5] и, во-вторых, с тем, что реакция кератиноцитов зависит от внутриклеточной системы посредников [6—9]. В экспериментах на клеточных культурах доказана роль β2-адренорецепторов (β2АР) в регуляции жизненного цикла кератиноцитов. Эти рецепторы представляют собой трансмембранные белки, связанные с G-белками, которые в большом количестве экспрессируются недифференцированными кератиноцитами кожи человека. От того, какая α-субъединица G-белка экспрессируется клеткой (Gαs или Gαi), зависит повышение или снижение внутриклеточного уровня цАМФ. Стимуляция β2АР способствует усилению гальванотаксиса, миграции, пролиферации и дифференцировки кератиноцитов. Наличие и влияние других подтипов адренорецепторов менее изучены. Данные, полученные на клетках, не учитывают регуляторных влияний организма, изменений скорости метаболизма медиаторов, плотности нервных окончаний, выраженности нейропатии при сахарном диабете.
Показано, что у кератиноцитов, выращенных в условиях повышенного содержания глюкозы в среде, нарушены пролиферация и миграция (снижена экспрессия интегрина α3, фактора роста кератиноцитов). Такие клетки формируют неполноценные щелевые контакты, в них усиливается окислительный стресс, повышается уровень апоптоза. В окружающих кератиноциты тканях при сахарном диабете нарушен ангиогенез, избыточно продуцируются матриксные металлопротеиназы, высоки риски инфицирования [10—12]. Все это способствует формированию хронической незаживающей раны. Однако комплексных исследований, посвященных влиянию нейропатии на ранозаживление при сахарном диабете, нами не обнаружено.
Цель исследования — изучение развития нейропатии как возможного механизма нарушения ранозаживления в стрептозотоциновой модели сахарного диабета у крыс.
Материал и методы
Исследование выполняли на 70 самцах белых беспородных крыс массой 350±25 г. Животных содержали в условиях вивария с регулируемым световым режимом (12 ч день, 12 ч ночь) со свободным доступом к воде и пище. Крыс рандомизировали в группы по массе тела и вариабельности ритма сердца.
Сахарный диабет моделировали однократной внутрибрюшинной (в/б) инъекцией стрептозотоцина в дозе 65 мг/кг в холодном 0,1 М цитратном буфере (pH=4,5, t=+4 °С) [3]. На 3-и сутки оценивали уровень глюкозы в крови. Животные с уровнем глюкозы ниже 15 мМ/мл из эксперимента исключались. День верификации сахарного диабета считали первым днем его развития (группа СД). Далее, в течение всего эксперимента, 1 раз в день в первой половине дня животные этой группы получали поддерживающую инъекцию инсулина детемира (препарат Левемир) в дозе 2 Ед/кг в физиологическом растворе подкожно. Дозу инсулина подбирали предварительно таким образом, чтобы в течение 1 сут сохранялась значительная гипергликемия.
В качестве контроля исследовали крыс, получивших однократную в/б инъекцию холодного 0,1 М цитратного буфера (pH=4,5, t=+4 °С) в пропорциональном объеме (группа ЦБ, контроль). Инъекцию стрептозотоцина или цитратного буфера проводили во второй половине дня, в период наименьшей активности животных. Дополнительно исследовали интактных (группа ИК) животных.
Уровень глюкозы в крови крыс оценивали еженедельно (глюкометр iCheck).
Болевую чувствительность (период между моментом погружения кончика хвоста животного на 2 см в воду температурой 55 °C и временем отдергивания хвоста) измеряли еженедельно.
На 42-е сутки наркотизированным хлоралгидратом крысам групп СД и ЦБ ниже левой лопатки наносили круглую рану диаметром 2 см (иссечение ножницами). После нескольких операций из-за вызываемой хлоргидратом смерти животных его заменили на диэтиловый эфир. Оценку площади раневой поверхности проводили сразу после нанесения раны и далее каждые 3-и сутки в программе Universal Desktop Ruler. Забор проб кожи проводили на 8, 16 и 24-е сутки после моделирования раны. Забор ткани кожи у животных группы ИК проводили на 4-м месяце жизни. В каждый срок забор кожи осуществляли у 10 животных каждой группы.
Полученные фрагменты кожи фиксировали, дегидратировали и заливали парафином по стандартной методике. Образцы нарезали таким образом, чтобы в микропрепарат попадали участки раневого дефекта и окружающей его неповрежденной кожи. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Для иммуногистохимического окрашивания на Ki-67, α1-, β1— и β2-АР использовали первичные антитела кролика (Abcam), вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (козел против кролика, Abcam), и систему визуализации DAB. Препараты изучали с помощью светового микроскопа Zeiss Imager A1 Axio («Zeiss», Германия), фотографии получали с помощью программы AxioVision 3,5 («Zeiss», Германия). Относительную плотность окрашивания измеряли в программе ImagePro и сравнивали с отрицательным контролем (образцы, окрашенные без первичных антител).
Условия проведения
Эксперимент проводили на базе кафедры физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины (ФФМ) Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Этическая экспертиза
При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации № 708н от 23.08.10 «Об утверждении правил лабораторной практики». На проведение экспериментов было получено разрешение комиссии ФФМ МГУ им. М.В. Ломоносова по биоэтике.
Статистический анализ
Статистическую обработку данных проводили в пакетах программ Statistica 10.0 и IBM SPSS Statistics 23.0. Для оценки выживаемости применяли модель Кокса, допускающую частичную неполноту данных [2]. Для оценки динамики ранозаживления и изменения болевой чувствительности использовали функцию дисперсионного анализа повторных измерений (repeated measures ANOVA) [2]. Для сравнения плотностей экспрессии различных белков использовали многофакторный дисперсионный анализ с построением смешанной линейной модели (метод наименьшей значимой разницы по Фишеру). Различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты
Общее состояние животных
Однократная инъекция стрептозотоцина приводила к развитию сахарного диабета у крыс на 3-и сутки: уровень глюкозы в крови в 4—7 раз превышал исходный (6,2 мМ) и оставался повышенным на протяжении всего эксперимента. Для увеличения выживаемости животным с диабетом ежедневно вводили инсулин. За весь срок эксперимента погибли 3 крысы из 70. Исходная масса крыс составляла в группе СД 367±55 г, в группе ЦБ 372±73 г, в группе ИК 360±84 г. Потеря массы тела у животных группы СД, несмотря на поддерживающую инсулинотерапию, постепенно увеличивалась и к концу эксперимента составила 25%. Животные группы ЦБ, напротив, к концу опыта прибавили в массе в среднем 20% (р<0,01).
Динамика болевой чувствительности
Для оценки развития нейропатии проводили тест с отдергиванием хвоста. У животных групп ЦБ и ИК время отдергивания хвоста, опущенного в воду температуры 55 °C, было практически одинаковым и составляло в среднем 1,7±0,3 с. После моделирования СД, начиная с 7-х суток, это время постепенно нарастало и к 56-м суткам составило 2,9±0,4 с (р=0,017).
Динамика ранозаживления
cкорость ранозаживления у крыс групп СД и ЦБ практически не различалась (р=0,672). Однако это могло быть связано с большим разбросом размеров раны в группе СД (рис. 1).
Морфологический и иммуногистохимический анализы заживления раны
У интактных крыс в срезах кожи, окрашенных гематоксилином и эозином, визуализирован нормальной толщины эпидермис с четко выраженными базальным, шиповатым и зернистым слоями (рис. 2, а).
На 8-е сутки после нанесения раны большая часть раневой поверхности была закрыта грануляционной тканью, интенсивно инфильтрированной клетками воспаления: нейтрофилами, макрофагами и лимфоцитами (см. рис. 2, б). Грануляционную ткань покрывал слой некротических масс. Регенерирующий край эпидермиса часто был утолщен.
На 16-е сутки наблюдались затухание воспалительного процесса и исчезновение признаков острого повреждения. Большая часть ран была покрыта грануляционной тканью, эпидермис у края раны был значительно утолщен (см. рис. 2, в). Под формирующимся эпидермисом образовались фиброзная ткань, рубец. У некоторых крыс группы ЦБ, но не СД, реэпителизация раны завершилась к 16-м суткам.
На 24-е сутки после моделирования раны формировался грубоволокнистый рубец, покрытый тонким слоем эпидермиса (см. рис. 2, г). У ряда крыс группы СД и в этот срок полной регенерации кожи не происходило.
Иммуногистохимическое окрашивание
Общий вид препаратов, окрашенных методом иммуногистохимии, представлен на рис. 3.
Кератиноциты кожи крыс группы ИК в значительной степени экспрессировали Ki-67, маркер клеточной пролиферации, что соответствует высокой регенеративной активности эпидермиса. Нанесение раны крысам группы ЦБ на ранних сроках незначимо влияло на регенеративную активность. На 24-е сутки заживления, когда у всех крыс в этой группе уже завершилась реэпителизация, экспрессия маркераKi-67 как в крае раны, так и в относительно отдаленных участках кожи значимо уменьшилась по сравнению с предыдущими временными точками у интактных животных и крыс группы СД (рис. 4).
В группе СД как на 8-е, так и на 16-е сутки в обеих локализациях экспрессия Ki-67 значимо не изменилась, но на 24-е сутки в области края раны увеличилась по сравнению с группой ИК (р=0,036), ЦБ (р=0,041) и предыдущей временно́й точкой (р=0,028).
В большинстве временных точек как в группе СД, так и в группе ЦБ экспрессия Ki-67 значимо не различалась в крае раны и на некотором отдалении от него. Лишь на 24-е сутки в группе СД в крае раны окрашивание на Ki-67 оказалось интенсивнее, чем в отдаленном участке эпидермиса (рис. 5).
Таким образом, в группе СД экспрессия маркера пролиферации увеличилась в крае раны на 24-е сутки после ее нанесения (р=0,04), что свидетельствует об усилении регенеративных процессов, в то время как в группе ЦБ экспрессия маркера на 24-е сутки значимо уменьшилась на фоне завершившейся к этому моменту реэпителизации раны (р=0,031).
Ни в одной группе, включая ИК, мы не обнаружили окрашивания эпидермиса на β1— и α1-АР, что может свидетельствовать об отсутствии их экспрессии кератиноцитами крыс. С другой стороны, β2-адренорецепторы в значительной степени экспрессировались кератиноцитами животных всех групп, включая И.К. Следует отметить преимущественно базальное расположение положительно окрашенных клеток в эпидермисе (см. рис. 2, б).
На 8-е и 16-е сутки экспрессия β2-АР не различалась между группами и участками кожи. На 24-е сутки их экспрессия уменьшилась в группе ЦБ в отдаленных участках кожи (р=0,046) (рис. 6).
Обсуждение
Нейропатия является одним из возможных механизмов нарушения ранозаживления в стрептозотоциновой модели сахарного диабета у крыс.
Результаты теста болевой чувствительности показали, что у крыс группы СД на исследуемых сроках ранозаживления развивается периферическая нейропатия, затрагивающая чувствительные нервные окончания [11, 12]. Морфологические изменения кожи животных и иммуногистохимические данные согласуются с развитием нейропатии, что позволяет говорить о взаимосвязи этих изменений.
Хотя скорость заживления раны, нанесенной на 42-е сутки развития гипергликемии, статистически не различалась у животных контрольной (ЦБ) и диабетической (СД) групп, но у всех крыс группы ЦБ с течением времени рана уменьшилась, снижался внутригрупповой разброс, и к 24-м суткам после нанесения раны у всех крыс этой группы имело место полное заживление. В группе СД были выявлены животные с более высокой и более низкой скоростью ранозаживления, но ни у одной крысы этой группы к 24-м суткам рана не закрылась полностью. Это повысило внутригрупповой разброс, что и препятствовало выявлению различий между группами ЦБ и С.Д. Разная скорость ранозаживления у крыс с СД может быть вызвана разным уровнем гипергликемии, которая зависит от чувствительности β-клеток поджелудочной железы к стрептозотоцину.
При исследовании гистологических образцов на светооптическом уровне картина острой раны у крыс постепенно сменялась картиной ранозаживления вторичным натяжением: уменьшалась лейкоцитарная инфильтрация, формировался конус ранозаживления, прорастали новые сосуды, раневой дефект заполнялся соединительной тканью. В группе ЦБ на 24-е сутки после нанесения раны (56-е сутки эксперимента) репарация раны завершилась, в группе СД наблюдалось замедление развития всех этапов заживления; к концу эксперимента у большей части животных этой группы рана не закрылась.
Окрашивание на Ki-67 выявило высокий уровень пролиферативной активности в коже интактных крыс. Формирование раны не изменило уровень пролиферации в группе ЦБ ни в отдаленном от края раны участке кожи, ни в крае раны. На месте раны снизился общий уровень пролиферации при полном ее заживлении. Интересно, что у животных группы СД к 24-м суткам после моделирования раны в краю раны на фоне незажившего дефекта экспрессия Ki-67 возросла. Результат свидетельствует о том, что репарация кожи у здоровых крыс происходит за счет избирательного изменения пролиферативной активности различных подтипов кератиноцитов, когда рана закрывается, под тонким слоем эпидермиса продолжаются процессы восстановления здорового кожного покрова в нижних слоях кожи. На этом фоне снижается экспрессия Ki-67 кератиноцитов. У животных с СД, скорее всего, нарушается процесс активации популяции кератиноцитов, участвующих в ранозаживлении, поэтому базовой пролиферативной активности не хватает для успешного устранения дефекта кожи, и к 24-м суткам после нанесения раны наблюдается увеличение уровня Ki-67.
Мы не выявили какой-либо связи между сахарным диабетом, стадиями ранозаживления и плотностью адренорецепторов в эпидермисе кожи крыс. Плотность окрашивания β2-АР в кератиноцитах значимо не различалась между группами. Снижение экспрессии рецепторов в удаленной от раны коже крыс в группе ЦБ пока не имеет объяснения. В целом можно прийти к заключению, что плотность β2-АР у крыс с сахарным диабетом не меняется в процессе ранозаживления. Тем не менее для формирования определенных выводов о наличии или отсутствии изменений периферической иннервации в процессе ранозаживления у крыс с сахарным диабетом требуется более подробное изучение данного вопроса, включающее оценку состояния других компонентов симпатической и парасимпатической нервной системы в коже.
Заключение
Проведенное исследование позволило получить новую информацию о ранозаживлении в модели стрептозотоцинового диабета у крыс. На фоне поддерживающей инсулинотерапии в предложенном протоколе у крыс развивался сахарный диабет, не обусловливающий смерть животных в течение 56 сут. При этом постепенно снижалась болевая чувствительность, что особенно ярко проявилось к 56-м суткам эксперимента. Результаты морфологического исследования указывают на ухудшение реэпителизации раны у крыс группы СД. В крайней точке исследования у них увеличилась пролиферативная активность кератиноцитов края раны, тогда как в группе ЦБ к этому моменту закончилась эпителизация, и пролиферативная активность, напротив, снизилась. Плотность β2-АР у крыс не меняется ни при сахарном диабете, ни в процессе ранозаживления.
Изучение плотности иннервации в коже края ран, концентрации метаболитов нейромедиаторов, а также расширение спектра исследуемых нейрональных и не-нейрональных систем регуляции ранозаживления позволят сформировать комплексное представление о процессах, протекающих в хронической диабетической ране, найти новые потенциальные мишени для терапии и в конечном счете улучшить качество оказываемой помощи пациентам с СДС.
Дополнительная информация
Источник финансирования. Работа поддержана Российским научным фондом (грант РНФ № 16−15−10365).
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Участие авторов:
Гистологическая обработка образцов ткани, иммуногистохимическое окрашивание, анализ полученных данных, их статистическая обработка, поиск и анализ информации в международных базах данных, написание текста публикации — Иванов Е.В.; подготовка и ведение экспериментов на животных, поиск и анализ информации в международных базах данных, написание текста публикации — Горбачева А.М.; поиск и анализ информации в международных базах данных, написание текста публикации, редактирование текста публикации — Гаврилова С.А..
Подготовка и ведение экспериментов на животных, оценка иммуногистохимического окрашивания образцов на срезах — Морозова М.П.; подготовка и ведение экспериментов на животных — Клочихина Е.М.; поиск и анализ информации в международных базах данных, написание текста публикации, редактирование текста публикации — Ердяков А.К., Артемова Е.В.
Редактирование текста публикации — Галстян Г.Р., Кошелев В.Б.
Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.