СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ — антиген

анти-ТПО — аутоантитела к пероксидазе тиреоцитов

АТ-рТТГ — антитела к рецептору тиреотропного гормона

АФК — активные формы кислорода

НАДФН — никотинамидадениндинуклеотидфосфат, восстановленная форма

Св. Т4 — свободный тироксин

ТТГ — тиреотропный гормон

ЩЖ — щитовидная железа

Tmax — время выхода на максимум

I max — максимальное значение интенсивности

S — площадь под кривой

По современным представлениям, болезнь Грейвса (БГ) представляет собой аутоиммунное заболевание, характеризующееся диффузным гиперпластическим зобом, которое обусловлено активацией рецепторов ТТГ тиреостимулирующими антителами [1]. Результатом нарушения функционального состояния щитовидной железы (ЩЖ) и активности тиреоидспецифического гуморального иммунитета является гибель тиреоидной паренхимы [2—4]. Признание аутоиммунной природы БГ определило поиски наиболее информативных маркеров, участвующих в реакциях гуморального и клеточного иммунитета. Нейтрофильные гранулоциты (НГ) являются ключевыми эффекторными и регуляторными клетками врожденного иммунитета и играют решающую роль в иммунопатогенезе широкого спектра заболеваний. НГ обладают мощным рецепторным потенциалом, обеспечивающим связь с другими клетками иммунной системы [5]. Роль Н.Г. в иммунопатогенезе БГ остается малоизученной. Известно, что НГ способны продуцировать ряд цитокинов, избыток которых усиливает интратиреоидный воспалительный процесс [6]. Вовлечение Н.Г. в процесс деструкции ЩЖ сопровождается усилением потребления клетками кислорода и продукцией его токсичных метаболитов (респираторный взрыв), что в условиях дефекта механизмов антиоксидантной защиты может служить причиной включения летальной программы как иреоидных клеток, так и самих полиморфно-ядерных лейкоцитов [7, 8].

Цель — изучить активность респираторного взрыва НГ крови в дебюте БГ.

В исследование были включены 26 женщин в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 40,7±13,2 года) с впервые верифицированным диагнозом БГ до начала тиреостатической терапии. В качестве контроля обследованы 35 практически здоровых женщин аналогичного возраста без отягощенного семейного анамнеза по заболеваниям ЩЖ и отсутствием структурных изменений ЩЖ при УЗИ. Диагноз Б.Г. основывался на жалобах, клинической картине тиреотоксикоза, сонографических изменениях ЩЖ, а также на повышенном титре антител к рецептору ТТГ (АТ-рТТГ) в сыворотке крови и соответствующих изменениях тиреоидного статуса [9]. Определение гормонов в крови проводилось в гормональной лаборатории эндокринологического центра Красноярской краевой клинической больницы (ККБ). Кровь из кубитальной вены брали между 8 и 9 ч утра после голодания в течение не менее 8 и не более 12 ч. Уровень гормонов определяли иммунорадиометрическим методом c помощью стандартных тест-наборов «Immunotech a.s., Beckman Coulter company» (Чехия) для ТТГ Референсные показатели для ТТГ: 0,17—4,05 мЕд/л, для свободного (св.) Т4 — 11,5—23,0 пмоль/л. Уровень АТ-рТТГ оценивали иммуноферментным (ИФА) методом («Хема-Медика», Россия) с указанным референсным интервалом менее 1,0 МЕ/л. Дополнительно методом ИФА определяли концентрацию аутоантител к пероксидазе тиреоцитов (анти-ТПО) («Хема-Медика», Россия) с указанным референсным интервалом от 0 до 30 мЕд/л. Ультразвуковое исследование (УЗИ) ЩЖ проводили в отделении ультразвуковой диагностики ККБ на аппарате Aloka 3500 (Япония) линейным датчиком 7,5 МГц. Объем Щ.Ж. вычисляли по формуле: V=V_л.д. + V_пр.д, где V_{л. (пр.)доли}=(A×B×C) × 0,479; А — длина доли (см), B — ширина доли (см), С — высота (толщина) доли (см) [10]. Нормальный объем железы у женщин составлял до 18 мл. Критериями исключения из контрольной группы являлись беременность и лактация. В течение 2 мес, предшествующих иммунологическому и гормональному анализу, женщины не болели острыми респираторно-вирусными инфекциями и не получали профилактических прививок.

НГ выделяли из цельной гепаринизированной крови центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-урографина: ρ=1,077 г/см³ — для отделения лимфоцитов, ρ=1,119 г/см³ — для выделения Н.Г. Реакционная смесь для ХЛ реакции состояла из 20 мкл донорской сыворотки AB (IV)Rh (–), 50 мкл люцигенина или люминола («Sigma», США) в концентрации 10^–5 М, 40 мкл опсонизированного зимозана (в случае определения индуцированной ХЛ), 200 мкл взвеси НГ (2 млн/мл) и 240 мкл раствора Хэнкса («ПанЭко», Россия) для определения спонтанной ХЛ или 200 мкл раствора Хенкса для индуцированной [11]. Выбор двух ХЛ-индикаторов определялся необходимостью выделения в общем пуле активных форм кислорода (АФК) (оценивается с помощью люминола) объема синтеза супероксид-радикала (определяется с помощью люцигенина). Спонтанную и зимозан-индуцированную ХЛ оценивали в течение 90 мин на 36-канальном ХЛ-анализаторе CL3606 (СКТБ «Наука», Красноярск). Определяли следующие характеристики ХЛ-кривой: время выхода на максимум (Тmax), характеризующее скорость развития ХЛ-реакции, максимальное значение интенсивности (Imax), отражающее максимальный уровень синтеза АФК, а также площадь под кривой (S), характеризующую суммарный синтез АФК за 90 мин исследования. Усиление Х.Л. под действием зимозана оценивали по отношению площади индуцированной ХЛ к площади спонтанной и определяли как индекс активации.

Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых, в соответствии с этическими нормами Хельсинской Декларации (2001) и соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента Р.Ф. № 2288 от 24.12.93). Протокол исследования одобрен этическим комитетом КГБУЗ «ККБ» (Красноярск, ул. Партизана Железняка 3а, протокол № 124, от 07.04.16).

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 («StatSoftInc.», США). Проверка количественных данных на нормальность распределения проводилась с помощью теста Шапиро—Уилкса. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного интервала между 25-м и 75-м процентилями (Me [С₂₅ —С₇₅]).Значимость различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна—Уитни. Анализ связи признаков проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена ®.

Медиана уровня ТТГ и св. Т4 у больных в дебюте БГ составила соответственно 0,17 (0,01—0,72) мкмЕД/мл и 17,91 (13,12—30,32) пмоль/л, а содержание АТ-рТТГ и анти-ТПО — соответственно 16,81 (10,07—30,34) МЕ/л и 374 (223—817) мЕд/л. По данным УЗИ, медиана объема ЩЖ у больных составила 30,6 (20,41; 62,93) мл; в 24 (92,3%) случаях наблюдалось изменение структуры ЩЖ за счет чередования участков повышенной и пониженной эхогенности.

При исследовании люцигенин-зависимой ХЛ нейтрофилов крови обнаружено, что при БГ снижен Тmax зимозан-индуцированной ХЛ (см. таблицу). Выявлено также увеличение Imax люминол-зависимой спонтанной и зимозан-индуцированной ХЛ нейтрофилов.

Установлено, что у лиц контрольной группы концентрация ТТГ отрицательно коррелировала c Тmax люцигенин-зависимой спонтанной (r=–0,89; р=0,019) и индуцированной (r=–0,94; р=0,005) Х.Л. Концентрация св. Т4 также отрицательно коррелировала с Imax и S спонтанной люцигенин-зависимой ХЛ (r=–0,83; р=0,042, в обоих случаях), с Тmax (r=–0,84; р=0,041) и S (r=–0,94; р=0,004) зимозан-индуцированной люцигенин-зависимой ХЛ. У больных с БГ выявлены только корреляции между уровнем анти-ТПО с Тmax (r=–0,70; р=0,036) и Imax люминол-зависимой индуцированной (r=–0,72; р=0,030) ХЛ.

Люцигенин окисляется и люминесцирует только под влиянием супероксид-радикала, который определяется как первичная АФК и синтезируется в системе НАДФН-оксидазы [11, 12]. Люцигенин не проходит через мембрану клеток и связывается с супероксид-радикалом только во внеклеточном пространстве. Соответственно, исследование люцигенин-зависимой ХЛ нейтрофилов позволяет охарактеризовать состояние активности НАДФН-оксидазы и уровень выделения супероксид-радикала для реализации механизма внешнего киллинга. Единственной особенностью кинетики синтеза супероксид-радикала НГ у больных БГ явилось снижение Тmax индуцированной ХЛ. Тmax характеризует скорость развития респираторного взрыва в случае регуляторного или антигенного (АГ) воздействия на клетку — с периода восприятия сигнала и до уровня максимальной активации НАДФН-оксидазы [13]. Следовательно, у больных БГ в нейтрофилах крови скорость активации НАДФН-оксидазы при АГ стимуляции замедлена. Снижение Тmax в ходе индуцированной ХЛ при БГ и дебюте тиреотоксикоза также отражает нарушение окисления НАДФН [14], связанную с ним медленную активацию каспазного каскада и, как результат, отсроченную реализацию программы апоптотической гибели клетки. Примечательно, что у 18 (69,2%) больных с впервые установленным диагнозом БГ тиреоидный статус соответствовал субклиническому тиреотоксикозу. Однако даже в отсутствии манифестного тиреотоксикоза кинетика зимозан-индуцированного синтеза первичных АФК изменялась.

Цитотоксическая активность НГ определяется уровнем продукции как первичных, так и вторичных АФК (гидроксильный радикал, перекись водорода и др.). В формировании пула вторичных АФК в НГ принимают участие такие ферменты, как супероксиддисмутаза, каталаза, миелопероксидаза и др. [6, 11, 13]. Люминол способен вступать в ХЛ-реакцию и с первичными, и с вторичными АФК, причем как во вне-, так и внутриклеточном пространстве и вступать в реакцию в фаголизосомах. Установлено, что при БГ в НГ повышен максимум уровня синтеза вторичных АФК как в состоянии относительного покоя, так и при антигенной индукции дыхательного взрыва.

Исходя из результатов корреляционного анализа, можно заключить, что при БГ значительно нарушена тиреоидная регуляция дыхательного взрыва в Н.Г. Так, если у лиц контрольной группы с кинетическими показателями синтеза супероксид-радикала коррелируют только ТТГ и св. Т4, то у больных БГ выявляются корреляционные взаимосвязи только между уровнем анти-ТПО и кинетическими параметрами синтеза вторичных АФК. Известно, что гормоны ЩЖ влияют на обменные процессы в клетках, преимущественно стимулируя энергетические процессы и реакции липидного обмена [15—17], что приводит к оттоку субстратов из пентозофосфатного цикла, в котором синтезируется НАДФН. Перераспределение субстратных потоков в обменных процессах НГ под влиянием тиреоидных гормонов отрицательно влияет на активность НАДФН-оксидазы и соответственно показатель люцигенин-зависимой ХЛ. В то же время органо-зависимый аутоиммунный процесс при БГ стимулирует выход активированных клеток иммунной системы из кровеносного русла и их миграцию в ткань Щ.Ж. Поскольку интенсивность респираторного взрыва в НГ возрастает при функциональной активации клеток, можно заключить, что с увеличением уровня анти-ТПО при БГ количество активированных НГ в периферической крови будет снижаться. В целом у больных БГ в НГ крови повышается интенсивность респираторного взрыва за счет синтеза вторичных АФК. Кинетика синтеза первичных АФК меняется незначительно. Однако даже в отсутствии манифестного тиреотоксикоза (у части больных БГ с субклиническим тиреотоксикозом) Тmax синтеза первичных АФК замедляется. В случае дебюта БГ уже при субклиническом тиреотоксикозе и минимальных изменениях тиреоидного статуса взаимосвязи между показателями респираторного взрыва НГ и гормонами ЩЖ теряются, но появляется связь между ХЛ-реакцией и концентрацией анти-ТПО. Можно предположить, что с усилением аутоиммунных процессов снижается реактивность нейтрофилов крови за счет миграции активированных клеток в ткань ЩЖ.

При БГ выявлены изменения механизмов, ответственных за реализацию кислородного метаболизма НГ крови, что может не только влиять на развитие цитопатогенного эффекта нейтрофилов при развитии аутоиммунного процесса, но и определять возможности тиреостатической терапии в дебюте заболевания. Дальнейшее изучение клинико-иммунологических маркеров как потенциальных прогностических факторов, указывающих на вероятность ремиссии и/или рецидива БГ после консервативной терапии, представляется перспективным направлением.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование проведено из личных средств авторов.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — С.А. Догадин, А.А. Савченко; сбор и обработка материала — М.А. Дудина, В.А. Маньковский, Гвоздев И.И.; статистическая обработка данных — А.А. Савченко, М.А. Дудина; написание текста — М.А. Дудина, В.А. Маньковский; редактирование — С.А. Догадин, А.А.Савченко