Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Догадин С.А.

ГБОУ ВПО "Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого" Минздравсоцразвития РФ;
Краевое государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Краевая клиническая больница, Эндокринологический центр", Красноярск

Дудина М.А.

ГБОУ ВПО "Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого" Минздравсоцразвития РФ

Савченко А.А.

ГБОУ ВПО "Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого" МЗ РФ

Маньковский В.А.

КГБУЗ «Краевая клиническая больница», Красноярск, Россия

Гвоздев И.И.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера», Красноярск, Россия

Активность респираторного взрыва нейтрофильных гранулоцитов крови в дебюте болезни Грейвса

Авторы:

Догадин С.А., Дудина М.А., Савченко А.А., Маньковский В.А., Гвоздев И.И.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2017;63(1): 4‑8

Просмотров: 481

Загрузок: 1

Как цитировать:

Догадин С.А., Дудина М.А., Савченко А.А., Маньковский В.А., Гвоздев И.И. Активность респираторного взрыва нейтрофильных гранулоцитов крови в дебюте болезни Грейвса. Проблемы эндокринологии. 2017;63(1):4‑8.
Dogadin SA, Dudina MA, Savchenko AA, Man’kovskii VA, Gvozdev II. Respiratory burst activity in neutrophilic granulocytes in the onset of Graves’ disease. Problemy Endokrinologii. 2017;63(1):4‑8. (In Russ.).
https://doi.org/10.14341/probl20176314-8

?>

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ — антиген

анти-ТПО — аутоантитела к пероксидазе тиреоцитов

АТ-рТТГ — антитела к рецептору тиреотропного гормона

АФК — активные формы кислорода

НАДФН — никотинамидадениндинуклеотидфосфат, восстановленная форма

Св. Т4 — свободный тироксин

ТТГ — тиреотропный гормон

ЩЖ — щитовидная железа

Tmax — время выхода на максимум

I max — максимальное значение интенсивности

S — площадь под кривой

По современным представлениям, болезнь Грейвса (БГ) представляет собой аутоиммунное заболевание, характеризующееся диффузным гиперпластическим зобом, которое обусловлено активацией рецепторов ТТГ тиреостимулирующими антителами [1]. Результатом нарушения функционального состояния щитовидной железы (ЩЖ) и активности тиреоидспецифического гуморального иммунитета является гибель тиреоидной паренхимы [2—4]. Признание аутоиммунной природы БГ определило поиски наиболее информативных маркеров, участвующих в реакциях гуморального и клеточного иммунитета. Нейтрофильные гранулоциты (НГ) являются ключевыми эффекторными и регуляторными клетками врожденного иммунитета и играют решающую роль в иммунопатогенезе широкого спектра заболеваний. НГ обладают мощным рецепторным потенциалом, обеспечивающим связь с другими клетками иммунной системы [5]. Роль Н.Г. в иммунопатогенезе БГ остается малоизученной. Известно, что НГ способны продуцировать ряд цитокинов, избыток которых усиливает интратиреоидный воспалительный процесс [6]. Вовлечение Н.Г. в процесс деструкции ЩЖ сопровождается усилением потребления клетками кислорода и продукцией его токсичных метаболитов (респираторный взрыв), что в условиях дефекта механизмов антиоксидантной защиты может служить причиной включения летальной программы как иреоидных клеток, так и самих полиморфно-ядерных лейкоцитов [7, 8].

Цель — изучить активность респираторного взрыва НГ крови в дебюте БГ.

Материал и методы

В исследование были включены 26 женщин в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 40,7±13,2 года) с впервые верифицированным диагнозом БГ до начала тиреостатической терапии. В качестве контроля обследованы 35 практически здоровых женщин аналогичного возраста без отягощенного семейного анамнеза по заболеваниям ЩЖ и отсутствием структурных изменений ЩЖ при УЗИ. Диагноз Б.Г. основывался на жалобах, клинической картине тиреотоксикоза, сонографических изменениях ЩЖ, а также на повышенном титре антител к рецептору ТТГ (АТ-рТТГ) в сыворотке крови и соответствующих изменениях тиреоидного статуса [9]. Определение гормонов в крови проводилось в гормональной лаборатории эндокринологического центра Красноярской краевой клинической больницы (ККБ). Кровь из кубитальной вены брали между 8 и 9 ч утра после голодания в течение не менее 8 и не более 12 ч. Уровень гормонов определяли иммунорадиометрическим методом c помощью стандартных тест-наборов «Immunotech a.s., Beckman Coulter company» (Чехия) для ТТГ Референсные показатели для ТТГ: 0,17—4,05 мЕд/л, для свободного (св.) Т4 — 11,5—23,0 пмоль/л. Уровень АТ-рТТГ оценивали иммуноферментным (ИФА) методом («Хема-Медика», Россия) с указанным референсным интервалом менее 1,0 МЕ/л. Дополнительно методом ИФА определяли концентрацию аутоантител к пероксидазе тиреоцитов (анти-ТПО) («Хема-Медика», Россия) с указанным референсным интервалом от 0 до 30 мЕд/л. Ультразвуковое исследование (УЗИ) ЩЖ проводили в отделении ультразвуковой диагностики ККБ на аппарате Aloka 3500 (Япония) линейным датчиком 7,5 МГц. Объем Щ.Ж. вычисляли по формуле: V=Vл.д. + Vпр.д, где Vл. (пр.)доли=(A×B×C) × 0,479; А — длина доли (см), B — ширина доли (см), С — высота (толщина) доли (см) [10]. Нормальный объем железы у женщин составлял до 18 мл. Критериями исключения из контрольной группы являлись беременность и лактация. В течение 2 мес, предшествующих иммунологическому и гормональному анализу, женщины не болели острыми респираторно-вирусными инфекциями и не получали профилактических прививок.

НГ выделяли из цельной гепаринизированной крови центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-урографина: ρ=1,077 г/см3 — для отделения лимфоцитов, ρ=1,119 г/см3 — для выделения Н.Г. Реакционная смесь для ХЛ реакции состояла из 20 мкл донорской сыворотки AB (IV)Rh (–), 50 мкл люцигенина или люминола («Sigma», США) в концентрации 10–5 М, 40 мкл опсонизированного зимозана (в случае определения индуцированной ХЛ), 200 мкл взвеси НГ (2 млн/мл) и 240 мкл раствора Хэнкса («ПанЭко», Россия) для определения спонтанной ХЛ или 200 мкл раствора Хенкса для индуцированной [11]. Выбор двух ХЛ-индикаторов определялся необходимостью выделения в общем пуле активных форм кислорода (АФК) (оценивается с помощью люминола) объема синтеза супероксид-радикала (определяется с помощью люцигенина). Спонтанную и зимозан-индуцированную ХЛ оценивали в течение 90 мин на 36-канальном ХЛ-анализаторе CL3606 (СКТБ «Наука», Красноярск). Определяли следующие характеристики ХЛ-кривой: время выхода на максимум (Тmax), характеризующее скорость развития ХЛ-реакции, максимальное значение интенсивности (Imax), отражающее максимальный уровень синтеза АФК, а также площадь под кривой (S), характеризующую суммарный синтез АФК за 90 мин исследования. Усиление Х.Л. под действием зимозана оценивали по отношению площади индуцированной ХЛ к площади спонтанной и определяли как индекс активации.

Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых, в соответствии с этическими нормами Хельсинской Декларации (2001) и соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента Р.Ф. № 2288 от 24.12.93). Протокол исследования одобрен этическим комитетом КГБУЗ «ККБ» (Красноярск, ул. Партизана Железняка 3а, протокол № 124, от 07.04.16).

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 («StatSoftInc.», США). Проверка количественных данных на нормальность распределения проводилась с помощью теста Шапиро—Уилкса. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного интервала между 25-м и 75-м процентилями (Me [С25 —С75]).Значимость различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна—Уитни. Анализ связи признаков проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена ®.

Результаты и обсуждение

Медиана уровня ТТГ и св. Т4 у больных в дебюте БГ составила соответственно 0,17 (0,01—0,72) мкмЕД/мл и 17,91 (13,12—30,32) пмоль/л, а содержание АТ-рТТГ и анти-ТПО — соответственно 16,81 (10,07—30,34) МЕ/л и 374 (223—817) мЕд/л. По данным УЗИ, медиана объема ЩЖ у больных составила 30,6 (20,41; 62,93) мл; в 24 (92,3%) случаях наблюдалось изменение структуры ЩЖ за счет чередования участков повышенной и пониженной эхогенности.

При исследовании люцигенин-зависимой ХЛ нейтрофилов крови обнаружено, что при БГ снижен Тmax зимозан-индуцированной ХЛ (см. таблицу). Выявлено также увеличение Imax люминол-зависимой спонтанной и зимозан-индуцированной ХЛ нейтрофилов.

Хемилюминесцентная активность нейтрофилов у больных БГ (Ме, С25 — С75)

Установлено, что у лиц контрольной группы концентрация ТТГ отрицательно коррелировала c Тmax люцигенин-зависимой спонтанной (r=–0,89; р=0,019) и индуцированной (r=–0,94; р=0,005) Х.Л. Концентрация св. Т4 также отрицательно коррелировала с Imax и S спонтанной люцигенин-зависимой ХЛ (r=–0,83; р=0,042, в обоих случаях), с Тmax (r=–0,84; р=0,041) и S (r=–0,94; р=0,004) зимозан-индуцированной люцигенин-зависимой ХЛ. У больных с БГ выявлены только корреляции между уровнем анти-ТПО с Тmax (r=–0,70; р=0,036) и Imax люминол-зависимой индуцированной (r=–0,72; р=0,030) ХЛ.

Люцигенин окисляется и люминесцирует только под влиянием супероксид-радикала, который определяется как первичная АФК и синтезируется в системе НАДФН-оксидазы [11, 12]. Люцигенин не проходит через мембрану клеток и связывается с супероксид-радикалом только во внеклеточном пространстве. Соответственно, исследование люцигенин-зависимой ХЛ нейтрофилов позволяет охарактеризовать состояние активности НАДФН-оксидазы и уровень выделения супероксид-радикала для реализации механизма внешнего киллинга. Единственной особенностью кинетики синтеза супероксид-радикала НГ у больных БГ явилось снижение Тmax индуцированной ХЛ. Тmax характеризует скорость развития респираторного взрыва в случае регуляторного или антигенного (АГ) воздействия на клетку — с периода восприятия сигнала и до уровня максимальной активации НАДФН-оксидазы [13]. Следовательно, у больных БГ в нейтрофилах крови скорость активации НАДФН-оксидазы при АГ стимуляции замедлена. Снижение Тmax в ходе индуцированной ХЛ при БГ и дебюте тиреотоксикоза также отражает нарушение окисления НАДФН [14], связанную с ним медленную активацию каспазного каскада и, как результат, отсроченную реализацию программы апоптотической гибели клетки. Примечательно, что у 18 (69,2%) больных с впервые установленным диагнозом БГ тиреоидный статус соответствовал субклиническому тиреотоксикозу. Однако даже в отсутствии манифестного тиреотоксикоза кинетика зимозан-индуцированного синтеза первичных АФК изменялась.

Цитотоксическая активность НГ определяется уровнем продукции как первичных, так и вторичных АФК (гидроксильный радикал, перекись водорода и др.). В формировании пула вторичных АФК в НГ принимают участие такие ферменты, как супероксиддисмутаза, каталаза, миелопероксидаза и др. [6, 11, 13]. Люминол способен вступать в ХЛ-реакцию и с первичными, и с вторичными АФК, причем как во вне-, так и внутриклеточном пространстве и вступать в реакцию в фаголизосомах. Установлено, что при БГ в НГ повышен максимум уровня синтеза вторичных АФК как в состоянии относительного покоя, так и при антигенной индукции дыхательного взрыва.

Исходя из результатов корреляционного анализа, можно заключить, что при БГ значительно нарушена тиреоидная регуляция дыхательного взрыва в Н.Г. Так, если у лиц контрольной группы с кинетическими показателями синтеза супероксид-радикала коррелируют только ТТГ и св. Т4, то у больных БГ выявляются корреляционные взаимосвязи только между уровнем анти-ТПО и кинетическими параметрами синтеза вторичных АФК. Известно, что гормоны ЩЖ влияют на обменные процессы в клетках, преимущественно стимулируя энергетические процессы и реакции липидного обмена [15—17], что приводит к оттоку субстратов из пентозофосфатного цикла, в котором синтезируется НАДФН. Перераспределение субстратных потоков в обменных процессах НГ под влиянием тиреоидных гормонов отрицательно влияет на активность НАДФН-оксидазы и соответственно показатель люцигенин-зависимой ХЛ. В то же время органо-зависимый аутоиммунный процесс при БГ стимулирует выход активированных клеток иммунной системы из кровеносного русла и их миграцию в ткань Щ.Ж. Поскольку интенсивность респираторного взрыва в НГ возрастает при функциональной активации клеток, можно заключить, что с увеличением уровня анти-ТПО при БГ количество активированных НГ в периферической крови будет снижаться. В целом у больных БГ в НГ крови повышается интенсивность респираторного взрыва за счет синтеза вторичных АФК. Кинетика синтеза первичных АФК меняется незначительно. Однако даже в отсутствии манифестного тиреотоксикоза (у части больных БГ с субклиническим тиреотоксикозом) Тmax синтеза первичных АФК замедляется. В случае дебюта БГ уже при субклиническом тиреотоксикозе и минимальных изменениях тиреоидного статуса взаимосвязи между показателями респираторного взрыва НГ и гормонами ЩЖ теряются, но появляется связь между ХЛ-реакцией и концентрацией анти-ТПО. Можно предположить, что с усилением аутоиммунных процессов снижается реактивность нейтрофилов крови за счет миграции активированных клеток в ткань ЩЖ.

Заключение

При БГ выявлены изменения механизмов, ответственных за реализацию кислородного метаболизма НГ крови, что может не только влиять на развитие цитопатогенного эффекта нейтрофилов при развитии аутоиммунного процесса, но и определять возможности тиреостатической терапии в дебюте заболевания. Дальнейшее изучение клинико-иммунологических маркеров как потенциальных прогностических факторов, указывающих на вероятность ремиссии и/или рецидива БГ после консервативной терапии, представляется перспективным направлением.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование проведено из личных средств авторов.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — С.А. Догадин, А.А. Савченко; сбор и обработка материала — М.А. Дудина, В.А. Маньковский, Гвоздев И.И.; статистическая обработка данных — А.А. Савченко, М.А. Дудина; написание текста — М.А. Дудина, В.А. Маньковский; редактирование — С.А. Догадин, А.А.Савченко

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail