Список сокращений

СД — сахарный диабет

ПЖ — поджелудочная железа

HbA_1c — гликированный гемоглобин

ОГТТ — пероральный глюкозотолерантный тест

ГСД — гестационный сахарный диабет

ПГГН — пограничная гипергликемия натощак

Средимоногенныхформсахарногодиабета (СД) лидирующееместозанимаеттип MODY (maturity-onset diabetes of the young, «диабетвзрослоготипаумолодых»), восновекотороголежатгенетическиедефектыβ-клетокподжелудочнойжелезы (ПЖ). Впервые термин «maturity-onset diabetes of the young» и аббревиатуру «MODY» предложили R. Tattersall и S. Fajans [1, 2] в 1975 г. для обозначения наследственного непрогрессирующего или малопрогрессирующего инсулиннезависимого СД у молодых лиц. MODY характеризуется аутосомно-доминантным наследованием, манифестацией в молодом возрасте (до 25 лет) на фоне отсутствия специфических аутоантител (маркеров разрушения β-клеток) и выраженной вариабельностью клинических проявлений (от непрогрессирующей гипергликемии натощак до тяжелого диабета с сосудистыми осложнениями). К настоящему времени известно 13 генов-кандидатов MODY (HNF4A, GCK, HNF1A, PDX1, HNF1B, NEUROD1, KLF11, CEL, PAX4, INS, BLK, ABCC8, KCNJ11) и, соответственно, 13 егоподтипов. «Золотым стандартом» диагностики MODY является молекулярно-генетическое исследование. Ограниченный доступ к молекулярно-генетическим исследованиям, обусловленный длительностью, трудоемкостью и высокой стоимостью метода прямого секвенирования, часто является причиной ошибочной диагностики СД 1-го или 2-го типа у пациентов с MODY и приводит к назначению неадекватной терапии. Кроме того, генетическая верификация диагноза крайне важна для медико-генетического консультирования семьи. В последние годы для установления генетической природы моногенных заболеваний активно применяется технология секвенирования нового поколения, которая позволяет проводить одновременный анализ нескольких генов-кандидатов моногенных заболеваний. К настоящему времени в мире проведено несколько исследований структуры MODY с использованием технологии секвенирования нового поколения [3—7]. Важным преимуществом данного метода перед методом прямого секвенирования является возможность активного выявления случаев дигенного и олигогенного наследования. На сегодняшний момент в литературе имеются описания случаев дигенного наследования MODY, однако они единичные. Случаи олигогенного наследования MODY не описаны. Одно из первых сообщений о дигенном наследовании MODY опубликовано в 2007 г. B. Karges и соавт. [8], которые описали семью с сочетанием мутаций в генах HNF1A и HNF1B. В 2009 г. H. Beijers и соавт. [9] описали первый случай сочетания мутаций в генах HNF1A и HNF4A у пробанда и его матери. Аналогичное сочетание мутаций в последующие годы описали G. Forlani и соавт. [10] и R. Shankar и соавт. [11]. В литературе имеется несколько описаний сочетания мутаций и в других генах-кандидатах MODY. Во всех этих исследованиях для молекулярно-генетического исследования применялся метод секвенирования по Сэнгеру, что требовало длительного пошагового секвенирования каждого исследуемого гена. С внедрением технологии секвенирования нового поколения, позволяющей проводить одновременный анализ нескольких генов, диагностика подобных случаев стала более активной. Так, в 2014 г. в Индии среди 56 неродственных пробандов, клинически отнесенных к MODY, дигенный характер наследования обнаружен у 2 пациентов (сочетание мутаций в генах NEUROD1 и PDX1) [3]. В 2015 г. M. Szopa и соавт. [7] среди 54 неродственных пробандов выявили дигенное наследование у 3 пациентов, причем в одном случае мутация в гене-кандидате MODY сочеталась с мутацией в другом гене, ассоциированном с СД (HNF4A/NEUROD1, HNF1B/HNF4A, HNF4A/PTF1A).

В нашей стране к настоящему времени опубликован ряд описаний случаев MODY, подтвержденных методом прямого секвенирования [12—17]. Случаи MODY с дигенным или олигогенным наследованием среди них отсутствуют. Нами впервые в отечественной практике применена технология секвенирования нового поколения для генетической диагностики наследственных нарушений углеводного обмена, что позволило впервые выявить случай редкого наследственного варианта СД, обусловленного дефектом гена NEUROD1 (MODY6) [18]. В данной работе мы приводим описания впервые диагностированных в нашей стране случаев MODY с дигенным и олигогенным наследованием, выявленных с помошью методики высокопроизводительного параллельного секвенирования.

Цель исследования — изучить клинические и молекулярно-генетические характеристики случаев MODY с дигенным и олигогенным наследованием, выявленных по результатам высокопроизводительного параллельного секвенирования.

Молекулярно-генетическое исследование проведено 256 пациентам (149 мальчиков, 107 девочек) в возрасте от 3 мес до 25 лет. Медиана возраста пациентов на момент исследования составила 11,7 года.

Критерии включения: нарушения углеводного обмена различной степени; отрицательный титр аутоантител к ICA, GAD, IA2, IAA; сохранная секреция эндогенного инсулина. Молекулярно-генетическое исследование проведено с использованием метода высокопроизводительного параллельного секвенирования. Методика подробно описана в работе, посвященной первому описанию в России случая MODY6 [18].

По результатам молекулярно-генетического исследования у 10 пациентов (8 пробандов, 1 сибс, 1 родитель) выявлено сочетание патогенных или «возможно патогенных» мутаций в двух генах (у 3 — сочетание мутаций в двух генах-кандидатах MODY, у 7 — в гене-кандидате MODY и другом гене, ассоциированном с СД), в 1 случае выявлено олигогенное наследование (мутации в генах GCK, HNF4A и INSR) (табл. 1). В одном из случаев отмечалось сочетание двух мутаций в гене GCK с мутацией в гене INSR. Все мутации найдены в гетерозиготном положении. Среди мутаций выявлена одна дупликация со сдвигом рамки считывания, одна мутация, затрагивающая 5’-нетранслируемую область, одна патогенная cеймсенс-мутация, остальные — миссенс-мутации. Среди выявленных мутаций восемь — новые, а мутации в генах HNF4A, HNF1B и ABCC8 (характерные для MODY1, MODY5 и MODY12, соответственно) впервые описаны в отечественной литературе. Методом прямого секвенирования аналогичные мутации найдены у 7 родителей.

Клинический случай 1. У пациента 2,9 года отмечено сочетание мутаций в двух генах-кандидатах MODY — GCK (MODY2) и HNF1B (MODY5). Подтип MODY5, обусловленный гетерозиготными мутациями в гене HNF1B, в РФ до настоящего времени описан не был. У нашего пациента гипергликемия натощак (6,7 ммоль/л) зафиксирована в возрасте 2,5 года при случайном обследовании. Уровень гликированного гемоглобина (HbA_1c) составил 6,0% (норма 4—6%). В течение 4 мес на фоне диеты с ограничением легкоусвояемых углеводов гликемия в течение суток колебалась в пределах 5,3—9,0 ммоль/л. В возрасте 2,9 года в ходе стандартного перорального глюкозотолерантного теста (ОГТТ) выявлена нарушенная толерантность к углеводам на фоне нормоинсулинемии (гликемия натощак — 5,6 ммоль/л, через 2 ч — 10 ммоль/л; базальный инсулин — 2,05 мкМЕ/мл, через 2 ч — 19,78 мкМЕ/мл), а уровень HbA_1c составил 6,95%, что позволило подтвердить диагноз С.Д. Учитывая течение заболевания, отягощенную по нарушениям углеводного обмена наследственность (гестационный СД (ГСД) в анамнезе у матери), пробанду было проведено молекулярно-генетическое исследование и выявлена ранее описанная гетерозиготная миссенс-мутация c.767A>G p. E256G в 7-м экзоне гена GCK, а также ранее описанная гетерозиготная миссенс-мутация c.1006C>G р. H336D в 4-м экзоне гена HNF1B [19], ассоциированная с гиподисплазией почек. Необходимо отметить, что ни у пробанда, ни у матери, у которой также обнаружена аналогичная мутация в гене HNF1B (мутация в GCK не обнаружена), почечная патология не выявлена. На момент исследования пациент не нуждался в сахароснижающей терапии; компенсировать углеводный обмен удалось диетой с ограничением легкоусвояемых углеводов. Данная клиническая картина рассматривается нами как проявление MODY2. Однако у пациента имеется также дефект гена HNF1B, при котором возможно развитие инсулинопотребности. Выявленное сочетание мутаций требует проспективного наблюдения за пациентом с учетом возможного последующего влияния дигенного характера наследования на клиническое течение заболевания.

Клинический случай 2. Ранее не описанная дупликация со сдвигом рамки считывания p. G339RfsX80 c.1012dupG в 5-м экзоне гена HNF1A и описанная мутация c. 3919G>A p. E1307K в 22-м экзоне гена INSR обнаружены у пробанда 16 лет с отягощенной наследственностью по СД в 4 поколениях. Гипергликемия (6,8 ммоль/л) выявлена случайно при обследовании по поводу ожирения (SDS ИМТ +2,34). При ОГТТ выявлен СД (13,4 ммоль/л на 120 мин), HbA_1c — 6,3%, однако специфические аутоантитела обнаружены не были. Заподозрен моногенный характер СД и методом прямого секвенирования проведено молекулярно-генетическое исследование гена HNF1A, но мутаций обнаружено не было. Учитывая наличие ожирения и гипергликемии, назначена терапия метформином в дозе 1000 мг/сут с положительным эффектом (HbA_1c на фоне терапии — 5,11%). Через полгода отмечено нарастание уровня HbA1c до 7,2%, гликемия натощак достигала 9,2 ммоль/л, в течение дня — 13,7 ммоль/л, что потребовало увеличения дозы метформина до 2000 мг/сут без видимого эффекта. Пациент повторно направлен на молекулярно-генетическое исследование (панель генов «Сахарный диабет»); использование метода высокопроизводительного параллельного секвенирования позволило установить дигенное наследование СД. Метформин был отменен и с патогенетической целью назначен гликлазид (диабетон МВ 60 мг). На фоне диабетона МВ в дозе 60 мг/сут в течение недели отмечен выраженный положительный эффект (гликемия натощак 4,8—6,6 ммоль/л, в течение дня — до 8,8 ммоль/л). Модификация терапии способствовала не только нормализации гликемии, но и значительному приросту как базального, так и стимулированного уровня инсулина: 5,5—16,5 мкЕ/мл в точках 0 и 120 мин на гликлазиде и 0,9— 4,1 мкЕ/мл в соответствующих точках на фоне метформина.

Клинический случай 3 (семья П.). Уникальный случай сочетания дигенного и олигогенного характера наследования выявлен в семье с большой концентрацией СД (см. рисунок). Поводом для поиска моногенного СД в данной семье послужило выявление нарушений углеводного обмена разной степени у 3 сибсов и отягощенная по СД наследственность по обеим линиям.

У пробанда в течение 6 лет фиксировалась пограничная гипергликемия натощак (ПГГН), а в 14 лет был диагностирован СД (гликемия натощак до 10,2 ммоль/л, HbA_1c до 6,9%), однако в ходе ОГТТ отмечена достаточная секреция инсулина (12,4—33,8 мЕд/л в точках 0 и 120 мин, соответственно). Назначен метформин в дозе 1000 мг/сут, на фоне приема которого в течение последующих 2 лет уровень HbA_1c колебался в пределах 6,2—7,7%. Из-за отсутствия стабильного положительного эффекта (последний год HbA_1c 7,4—7,6%) рассматривался вопрос о назначении инсулинотерапии. Однако учитывая мягкое течение СД и отягощенную наследственность, пациент был направлен на молекулярно-генетическое исследование, которое обнаружило дигенный характер заболевания: выявлены гетерозиготные мутации в генах GCK (c.C571T p. R191W) и INSR (c.A2084G p. Q695R), последняя — новая. У матери, в анамнезе которой имел место ГСД, проведен поиск данных мутаций методом Сэнгера: найдена только аналогичная мутация в гене GCK. Мутация в гене INSR у пробанда могла быть спорадической, однако отягощенная наследственность по отцовской линии послужила поводом для поиска данной мутацииу клинически здорового отца. У него была найдена мутация в гене INSR, что в данном случае свидетельствует о здоровом носительстве. Учитывая полученные данные, был обследован сибс 6 лет, у которого в течение года фиксировалась ПГГН, колебания HbA_1c в пределах 6,2—7%. У него была найдена аналогичная мутация в гене GCK. Также был обследован сибс 8 лет, у которого 2 года назад был диагностирован СД 1-го типа, дебютировавший с классических жалоб, но на фоне отсутствия аутоантител. Течение С.Д. у данного пациента потребовало лечения инсулином по интенсифицированной схеме, на фоне чего отмечалась субкомпенсация заболевания (HbA_1c 8—8,1%). По результатам секвенирования по Сэнгеру у данного сибса были найдены аналогичные мутации в генах GCK и INSR, однако это не объясняло столь тяжелого течения СД. С целью исключения мутаций в других генах-кандидатах MODY пациенту было проведено исследование панели генов «Сахарный диабет», по результатам которого найдена ранее описанная мутация, затрагивающая 5’UTR в гене HNF4A (MODY1). У остальных членов семьи также был проведен поиск данной мутаций методом прямого секвенирования, и мутация обнаружена у матери и у сибса 6 лет. Таким образом, нам удалось установить дигенное наследование СД у 3 членов семьи и олигогенный характер наследования у 1 из сибсов.

Молекулярно-генетическое исследование, выполненное методом высокопроизводительного параллельного секвенирования, установило факт дигенного наследования MODY у 8 пробандов, 1 сибса и 1 родителя, а также факт олигогенного наследования заболевания у 1 сибса. В ряде случаев проведена модификация терапии, а некоторые пациенты были приглашены для повторного обследования с целью рассмотрения вопроса о модификации терапии. Так, у пациента с установленной мутацией в гене HNF1A (MODY3) метформин был заменен патогенетически обоснованным препаратом из группы сульфонилмочевины, что обеспечило выраженный клинический эффект. Кроме того, у одного из родителей с установленной мутацией в гене GCK была отменена инсулинотерапия, сопровождавшаяся гипогликемиями. Пациент с сочетанной мутацией в гене WFS1 направлен на консультацию оториноларинголога в связи с имеющимися жалобами на снижение слуха. Полученные данные позволили провести медико-генетическое консультирование обследованных семей и дать соответствующие рекомендации. Все пациенты находятся под динамическим наблюдением, что в дальнейшем позволит оценить влияние сочетанных мутаций на фенотип.

На примере семьи П., имеющей столь разнообразные генетические и клинические характеристики, показана значимость правильной диагностики для разработки индивидуальной тактики наблюдения и терапии.

Использование методики высокопроизводительного параллельного секвенирования позволило выявить не только случаи MODY с дигенным и олигогенным наследованием, но и редкие подтипы MODY (MODY1, MODY5 и MODY12, обусловленные мутациями в генах HNF4A, HNF1B и AВCC8, соответственно), ранее не описанные в отечественной литературе. Кроме того, у ряда пациентов мутации в генах MODY сочетались с мутациями в генах INSR, GLIS3 и RFX6, мутации в которых также ранее не описаны в отечественной литературе.

Впервые яркий и разнообразный по своей клинической картине подтип MODY5 был описан в 1997 г. Y. Horikawa и соавт. [20]. В настоящее время обнаружено 116 мутаций в гене HNF1B. Ген локализован на длинном плече хромосомы 17 (17q21.3), экспрессируется в ПЖ, печени, почках, кишечнике, желудке, легких, яичниках и влияет на эмбриогенез этих органов [21]. Мутации в гене HNF1B, помимо СД, могут проявляться патологией почек (поликистоз, почечная дисфункция), врожденными аномалиями внутренних гениталий у девочек (аплазия влагалища, рудиментарная или двурогая матка) и патологией других органов, однако эти признаки не облигатны для MODY5. Так, в литературе есть описания пациентов с MODY5 без патологии мочеполовой системы [22]. У нашего пациента, как и у его матери с мутацией в данном гене, отсутствовали нарушения мочеполовой системы и другие аномалии развития. Пациенты с MODY5 нечувствительны к препаратам сульфонилмочевины и обычно нуждаются в инсулинотерапии [23]. Наш пациент и его мать в настоящее время инсулиннезависимы, что требует динамического наблюдения.

Впервые в РФ мы выявили пациента с MODY12. Данный подтип обусловлен инактивирующими гетерозиготными мутациями в гене ABCC8, кодирующим SUR1 субъединицу АТФ-зависимых К-каналов. Активирующие же гомо- или гетерозиготные, а также компаунд-гетерозиготные мутации (в данном случае мутантный ген может содержать как активирующую, так и инактивирующую аллели [24]) являются причиной неонатального С.Д. Клинически MODY12 сопоставим с MODY1 и 3; пациенты чувствительны к препаратам сульфонилмочевины [25]. Наш пациент на момент молекулярно-генетического исследования получал терапию метформином, в связи с чем ему была рекомендована госпитализация для решения вопроса о модификации терапии.

На долю MODY1, обусловленного гетерозиготными мутациями в гене ядерного фактора гепатоцитов HNF4A, приходится менее 10% всех случаев MODY. Впервые данный подтип был описан в 1996 г. K. Yamagata и соавт. [26]. К настоящему времени среди 173 семей описано более 103 мутаций в гене HNF4A [27]. По клинической картине данный подтип сходен с MODY3, однако заболевание протекает без глюкозурии. Интересно отметить, что у новорожденных с мутациями в гене HNF4A возможны транзиторные гипогликемии в сочетании с фетальной макросомией, которые обусловлены внутриутробным увеличением инсулиновой секреции, причины которого до конца неясны [28]. Среди взрослых пациентов с мутациями в данном гене отмечено снижение уровня триглицеридов и некоторых аполипопротеинов [29]. Среди наших пациентов мутация в HNF4A выявлена в семье П., причем в 2 случаях — в рамках дигенного, а в 1 — олигогенного наследования.

У 5 наших пациентов выявлены мутации в гене INSR, ассоциированные с инсулинорезистентностью. К настоящему времени описано 128 мутаций в этом гене. У наших пациентов трудно охарактеризовать влияние таких мутаций на фенотип, так как они сочетались с мутациями в разных генах-кандидатах MODY.

Следует отметить, что у пациента с сочетанием мутаций в генах HNF1A и RFX6 (на ранних стадиях органогенеза кодируемый геном RFX6 транскрипционный фактор RFX6 участвует в регуляции дифференцировки эндодермальных клеток ПЖ в β-клетки) в дебюте заболевания выявлен кетоз, наличие которого считается нехарактерным для MODY. Однако при первом описании MODY3 в России было установлено, что кетоз в анамнезе не исключает моногенный СД при нетипичной клинической картине [13]. Поэтому данный пациент был включен в исследование, что позволило выявить у него дигенный характер наследования. Течение заболевания в этом случае не позволило отменить инсулинотерапию, однако полученные данные были использованы для медико-генетического консультирования семьи.

Описанные нами случаи дигенного и олигогенного наследования MODY требуют дальнейшего наблюдения, что позволит в будущем оценить влияние выявленных генетических дефектов на фенотип.

В последние годы активное внедрение технологии секвенирования нового поколения открыло новые перспективы в диагностике моногенных заболеваний. Методика высокопроизводительного параллельного секвенирования позволяет проводить одновременный анализ нескольких генов-кандидатов MODY без их пошагового исследования методом прямого секвенирования. Важным преимуществом данного метода является возможность активного выявления случаев с дигенным и олигогенным наследованием, что отчетливо продемонстрировано нашим исследованием. Необходимо учитывать, что сочетание мутаций в разных генах может непосредственно отражаться на фенотипе и терапевтической тактике. Кроме того, правильный генетический диагноз служит основой для проведения медико-генетического консультирования семьи. Также необходимо отметить, что данная методика является высокоэффективной в диагностике MODY. Так, у одного из пациентов с подозрением на MODY3 мутации гена HNF1A не были выявлены методом прямого секвенирования. Лишь использование секвенирования нового поколения позволило обнаружить мутацию в этом гене и, кроме того, установить дигенное наследование MODY. Это дало возможность назначить патогенетически обоснованную терапию, что привело к выраженному положительному клиническому эффекту, что крайне важно с учетом возможных сосудистых осложнений при мутациях в гене HNF1A.

Выделяя две стратегии секвенирования генов-кандидатов MODY — последовательное прямое секвенирование генов GCK и HNF1A (как наиболее часто встречающиеся подтипы MODY) и в отсутствие мутаций — панельное секвенирование или первоначальное панельное секвенирование — нужно отметить, что последний метод является экономически оправданным.

Клиническая картина неиммунного диабета зачастую не укладывается в классические критерии MODY, и бывает трудно обозначить ген-кандидат для проведения молекулярно-генетического исследования. Четкая корреляция генотип-фенотип проявляется, пожалуй, только в случае MODY2. Исследования редких подтипов MODY в нашей стране ранее не проводились, а единичные описания в мировой литературе не позволяют в настоящее время установить четкую корреляцию генотип-фенотип для всех подтипов MODY. Методика высокопроизводительного параллельного секвенирования расширяет возможности диагностики редких подтипов MODY и случаев с дигенным и олигогенным наследованием. Приведенное описание случаев MODY с сочетанным наследованием является наиболее крупным среди подобных сообщений и первым в отечественной литературе. Случай же олигогенного наследования MODY описан впервые в мире.

Финансирование исследование. Исследование частично выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16−15−10408) http://xn--m1afn.xn--p1ai/.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования, сбор материала, анализ полученных данных, написание текста: О.А. Гиоева, А.Н. Тюльпаков.

Сбор материала, анализ полученных данных — Н.А. Зубкова, Ю.В. Тихонович, А.В. Кияев, Л.Г. Черных, О.Ю. Полляк, А.Р. Юсупова.

Проведение молекулярно-генетического исследования — В.М. Петров, Е.В. Васильев, А.Н. Тюльпаков.