Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) - группа заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования, в основе которых лежит дефект одного из ферментов или транспортных белков, принимающих участие в биосинтезе кортизола в коре надпочечников. Более чем в 90% случаев среди известных 7 форм ВДКН встречается дефицит 21-гидроксилазы (p450c21), причем как классические формы (простая вирильная и сольтеряющая), так и неклассический вариант заболевания (НК21ОН) [1-3]. Распространенность неклассических форм дефицита 21-гидроксилазы колеблется от 1:27 до 1:1000 новорожденных [4-8]; в российской популяции, по нашим данным, эта величина равна 1:2206 новорожденных [9], что делает НК21ОН едва ли не самым частым моногенным заболеванием с аутосомно-рецессивным типом наследования. Несмотря на высокую распространенность в популяции, заболевание хорошо изучено лишь у пациенток пубертатного возраста и женщин репродуктивного периода, разработаны алгоритмы диагностики, терапевтическая тактика ведения пациентов этой возрастной группы. Благодаря внедрению исследования на ВДКН в программу неонатального скрининга, отдельным зарубежным исследователям удалось диагностировать НК21ОН в период новорожденности [10-14]. Однако полученные данные скудны и не систематизированы. Клинические наблюдения таких пациентов в отечественной литературе отсутствуют.

В настоящем исследовании проведен подробный анализ клинических и лабораторных показателей в группе детей первого года жизни с доказанной молекулярно-генетически НК21ОН, у которых диагноз был заподозрен на основании положительных результатов скрининга на ВДКН.

За период 2011-2013 гг. нами наблюдались 50 детей, направленных в отделение наследственных эндокринопатий на дообследование, в связи с выявленным при неонатальном скрининге повышенным уровнем 17-гидроксипрогестерона (17-ОНП) (при первичном тестировании и/или ретестировании).

У всех детей определяли уровень 17-ОНП методом иммуноферментного анализа (ИФА), исследовали стероидный профиль крови методом тандемной масс-спектрометрии (ТМС) и проводили молекулярно-генетическое исследование гена CYP21A2 на частые мутации. При необходимости анализ гена CYP21A2 на частые мутации дополнялся секвенированием того же гена. У части пациентов определяли также уровни АКТГ и кортизола и активность ренина плазмы (АРП). По результатам обследования были сформированы две группы пациентов: 1-ю (основная) группу (n=20) составили дети с НК21ОН; во 2-й группе (n=30) оказались пациенты с ложноположительными результатами неонатального скрининга. Основным критерием диагноза являлось наличие мутаций в гене CYP21A2. Возраст пациентов колебался от 1 мес до 1 года 2 мес; среди обследуемых было 18 девочек и 32 мальчика.

2.1. Гормональные исследования

17-ОНП определяли методом ИФА с использованием наборов IMMUNOTECH. АРП измеряли радиоиммунологическим методом с помощью наборов той же фирмы. Уровень кортизола исследовали с помощью автоматического анализатора VITROS ECi («Johnson & Johnson», «Ortho-Clinical Diagnostics»), уровень АКТГ - с помощью автоматического анализатора Cobase 411. Содержание кортизола, тестостерона, 21-дезоксикортизола, 17-ОНП, кортикостерона, прогестерона, 11-дезоксикортизола, андростендиона определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) в соответствии с методикой, разработанной в лаборатории отделения наследственных эндокринопатий ФГБУ ЭНЦ (масс-спектрометр ABSCIEX SelexION). Такой анализ получил название мультистероидный профиль крови.

2.2. Молекулярно-генетические исследования

Геномную ДНК выделяли из периферических лейкоцитов с использованием стандартных методов. Детекцию 11 распространенных мутаций в гене CYP21A2 методом аллель-специфической полимеразно-цепной реакции (ПЦР) проводили по методике A. Wedell и Н. Luthman с модификациями. Прямое секвенирование проводилось на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3130 («Applied Biosystems»).

2.3. Статистическая обработка данных

Статистическая обработка материала проводилась методом математической статистики и осуществлялась при помощи пакета прикладных программ Биостат («Практика», 1999) и Statistica 8 Portable. В ходе исследования анализировались выборки, не подчиняющиеся нормальному распределению и характеризующиеся показателем Ме (25-75), где Ме - медиана, 25 и 75% - разброс значений в виде соответствующих перцентилей. При сопоставлении двух независимых выборок пользовались критерием Манна-Уитни (U). Для множественных сравнений применялся показатель Краскела-Уоллиса (Н). Используя принцип решающей матрицы, мы оценивали показатели диагностических тестов: (истинно отрицательные результаты (ИО), истинно положительные результаты (ИП), ложноотрицательные результаты (ЛО), ложноположительные результаты (ЛП) и информативность данных признаков (чувствительность, специфичность, точность, прогностическая ценность положительного результата, прогностическая ценность отрицательного результата).

Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Среди 50 детей, направленных в отделение наследственных эндокринопатий на дообследование в связи с выявленными при неонатальном скрининге повышенными уровнями 17-ОНП, 20 пациентам был поставлен диагноз неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы (НК21ОН). Основным критерием диагностики заболевания являлось наличие мутаций, сочетание которых позволяло поставить диагноз НК21ОН. Эти пациенты составили основную группу наблюдения (1-я группа). У оставшихся пациентов (30 детей) повышение 17-ОНП оказалось ложноположительным (2-я группа). По результатам молекулярно-генетического исследования (аллель-специфическая ПЦР), из 30 пациентов 2-й группы ни у одного ребенка наиболее частых мутаций выявлено не было. Мы считаем, что эти данные позволяют с большой вероятностью исключить дефицит 21-гидроксилазы без проведения дополнительного секвенирования, о чем свидетельствуют и результаты наших предыдущих исследований [9].

В основной группе, по данным молекулярно-генетического анализа, у 14 (т.е. более чем в 60% случаев) детей встречалась мутация V281L, причем у 10 (71%) в гомозиготном состоянии, а в остальных случаях - в сочетании с другими гетерозиготными мутациями, характерными как для классических, так и для неклассических форм заболевания. Среди оставшихся 6 пациентов у 5 нами была выявлена мутация P30L, также характерная для НК21ОН, в гомозиготном положении или в сочетании с другими мутациями; у 1 пациентки «тяжелая» мутация Q318X сочеталась с ранее не описанной мутацией G130D (последняя выявлена путем секвенирования гена CYP21A2).

В основной группе пациентов были 10 мальчиков и 10 девочек; возраст обследуемых колебался от 14 дней до 1 года 2 мес, медиана возраста на момент постановки диагноза составила 120 (60; 150) дней. При этом 15 детей родились доношенными (срок гестации >37 нед и масса тела >2000 г) и 6 детей - на сроке гестации 35-36 нед, маловесных новорожденных среди наших пациентов не было. У 2 из 20 пациентов со слов родителей отмечалась недостаточная прибавка в массе тела, частые срыгивания. Однако к моменту первичного обращения в отделение у всех пациентов общее состояние было расценено как удовлетворительное; ни у одного ребенка основной группы признаков задержки/ускорения темпов физического развития отмечено не было.

Медиана уровней 17-ОНП в 1-й группе пациентов, по результатам тестирования в ходе неонатального скрининга на ВДКН, составила 33,2 (21,0; 37,5) нмоль/л с минимальным показателем 17,5 и максимальным - 105 нмоль/л, а по результатам ретестирования - 42,5 (31,5; 63,8) нмоль/л с разбросом значений от 20,0 до 90,0 нмоль/л. Таким образом, медианы уровней 17-ОНП превышают нормативные значения для используемых наборов (норма до 17 нмоль/л, DELFIA) в 1,5 и 2,5 раза соответственно. Интересно, что медианы уровней 17-ОНП во 2-й группе составили 22,1 (20,2; 30,8) нмоль/л в ходе тестирования с разбросом показателей от 13,0 до 97,0 нмоль/л и 26,0 (19,9; 32,7) нмоль/л по результатам ретестирования с минимальным значением 11,4 нмоль/л и максимальным - 70 нмоль/л. Не у всех пациентов были зафиксированы результаты и тестирования и ретестирования, однако у 12 из 19 пациентов 2-й группы отмечено нарастание уровня 17-ОНП при ретестировании. Для оценки различий показателя 17-ОНП у пациентов 1-й и 2-й группы нами был вычислен критерий Манна-Уитни. Достоверные различия уровней 17-ОНП в группах получены при ретестировании: U=125,5, U0,05=195. При этом более высокие показатели соответствовали группе пациентов с НК21ОН. По результатам тестирования значения 17-ОНП достоверно не различались: U=82, U0,05=73.

При анализе гормональных данных у пациентов 1-й группы к моменту первичного обращения в стационар были получены следующие данные: медиана уровней 17-ОНП, определяемых методом ИФА, составила 134,9 (56,7; 154,0) нмоль/л, минимальный уровень показателя - 23,5, максимальный -

282,3 нмоль/л. Медиана 17-ОНП, измеренного в рамках мультистероидного профиля крови - 58,1 (36,7; 115,3) с разбросом показателя от 15,5 до

622 нмоль/л. При аналогичных измерениях в группе пациентов с ложноположительным подъемом 17-ОНП медиана 17-ОНП, измеренного методом ИФА, оказалась равной 48,0 (33,3; 75,6) нмоль/л, а методом LS/MS-MS - 1,9 (1,4; 4,1) нмоль/л (см. рисунок).

Для сравнения двух методов определения 17-ОНП в сыворотке вычисляли показатели чувствительности, точности, специфичности и прогностической ценности обоих методов (табл. 1).

Четко разработанных критериев нормы для 17-ОНП, измеренного методом ТМС, до настоящего времени нет. Однако отсутствие частых мутаций в гене CYP21A2 и значимых клинико-лабораторных отклонений у пациентов 2-й группы позволило нам использовать полученные методом ТМС значения 17-ОНП в качестве референсных для детей исследуемой возрастной группы. Таким образом, референсные значения 17-ОНП по методу ТМС: 1,5-4,3 нмоль/л (25 и 75 перцентили соответственно).

Учитывая разную степень нарушения функции фермента 21-гидроксилазы у пациентов с мутациями V281L и P30L, а также наличие их в гомозиготном состоянии или в сочетании с более «тяжелыми» мутациями, мы предприняли попытку разделить пациентов 1-й группы на три подгруппы в зависимости от молекулярно-генетического дефекта CYP21A2 для оценки разницы в уровнях 17-ОНП. В 1-ю подгруппу вошли пациенты с мутацией V281L в гомозиготном состоянии (10 человек), во 2-ю подгруппу пациенты, у которых мутация V281L сочеталась с другими мутациями (4); 3-ю подгруппу составили дети с мутацией P30L в гомозиготном положении или в сочетании с другими мутациями (4). Статистически значимых различий между подгруппами получить не удалось (Н=6,39; р=0,36), что может объясняться малыми объемами выборок. Однако как по методу ИФА, так и по методу LS-MS/MS, медиана 17-ОНП имела тенденцию к более высоким значениям в 3-й подгруппе, чем в 1-й и 2-й подгруппах (183,7 по сравнению с 34,7 и 36,6 ммоль/л по методу ИФА, 52,6 по сравнению с 30,9 и 49,8 ммоль/л по методу ТМС).

При наличии дефицита 21-гидроксилазы, наряду с повышением уровня 17-ОНП, наблюдается повышение уровня таких стероидов, как 21-дезоксикортизол и андростендион, чего не должно быть у здоровых пациентов. Возможность одномоментного определения этих стероидов при использовании LC/MS-MS является еще одним важным его преимуществом перед ИФА. В качестве дополнительных критериев оценки мы сравнили уровень 21-дезоксикортизола и коэффициент 17-ОНП+андростендион/кортизол в двух группах наблюдения. Медиана 21-дезоксикортизола в группе здоровых детей составила 0,2 ммоль/л (0,1; 0,84), тогда как у пациентов с НК21ОН - 4,0 ммоль/л (2,2; 5,6). Медиана коэффициента 17-ОНП+андростендион/кортизол у пациентов 1-й группы с НК21ОН оказалась равной

0,3 (0,2; 0,6) нмоль/л и 0,03 (0,0095; 0,07) нмоль/л у пациентов 2-й группы. При вычислении критерия Манна-Уитни для двух исследуемых параметров с учетом критического значения показателя оказалось, что уровни 21-дезоксикортизола и коэффициента 17-ОНП+андростендион/кортизол были достоверно выше у пациентов с НК21ОН, чем у здоровых детей: U=98, U0,05=137 и U=62,5, U0,05=149 соответственно.

Для оценки функционального состояния коры надпочечников нами были оценены уровни кортизола, АКТГ и АРП. Определения кортизола проводились методами ИФА и ТМС. Медиана уровня кортизола, измеренного методом ИФА, в 1-й группе пациентов оказалась равной 337,5 (251,3; 455,8) нмоль/л, а у детей 2-й группы - 256 (134,5; 332,8) нмоль/л. Медиана уровня кортизола, измеренного методом ТМС, у пациентов 1-й группы составляла 171,9 (113,4; 250) нмоль/л, а у пациентов 2-й группы - 281 (154; 393) нмоль/л. По уровням кортизола, определяемого обоими методами (критерий Манна-Уитни) достоверных различий между группами не выявлено. Уровень кортизола (ИФА) ниже рефересных значений был выявлен только у 1 пациента (48,8 нмоль/л). Однако дальнейшее клиническое наблюдение и повторное гормональное исследование (кортизол, АКТГ) позволили нам исключить у ребенка надпочечниковую недостаточность. Медиана уровней АКТГ в плазме у пациентов с НК21ОН составила 40,1 (23,5; 96,8) с разбросом значений от 4,8 до 115 пг/мл (норма 7-60); повышенный уровень АКТГ был выявлен у 6 (33%) из 18 пациентов. Во 2-й группе АКТГ составил 39,7 (19,2; 49,5) пг/мл. Таким образом, сочетание нормального уровня кортизола у всех пациентов и нормального уровня АКТГ в 2/3 случаев при отсутствии жалоб и патогмоничных проявлений НК21ОН позволяет сделать вывод об отсутствии у этих пациентов надпочечниковой недостаточности, несмотря на высокие уровни 17-ОНП (по ИФА) при поступлении, это еще раз доказывает ложноположительный характер повышения уровня 17-ОНП. Однако повышенное содержание АКТГ (хотя и незначительное) у 33% пациентов исследуемой группы требует дальнейшего изучения.

Что касается уровня АРП, то медиана значений показателя у пациентов с НК21ОН была равна 9,0 (2,3; 12,7) нг/мл/ч, а во 2-й группе - 4,2 (1,1; 13,2) нг/мл/ч. Умеренное повышение АРП также без клинических проявлений минералокортикоидного дефицита может быть обусловлено частичной резистентностью к минералокортикоидам, характерной для детей первого года жизни. Значимые различия в АРП между группами отсутствовали.

У 6 (30%) из 20 детей 1-й группы было назначено лечение препаратами глюкокортикоидов. В табл. 2

Первые описания НК21ОН, диагностированной у детей первого года жизни, принадлежат S. Pang и соавт. [10]. До настоящего времени в зарубежной литературе имеется 4 исследования с подробными описаниями НК21ОН у детей раннего возраста, у которых диагноз был установлен на основании неонатального скрининга.

За период 1991-1994 г. в Японии среди 4 500 000 новорожденных, по данным неонатального скрининга на ВДКН, было диагностировано 4 случая НК21ОН [11]. Двое из пациентов являлись родными братьями. По данным гормонального профиля, у всех 4 новорожденных в ходе скрининга было выявлено незначительное повышение базального уровня 17-ОНП (6-19 нг/мл при норме - до 5) с постепенным его нарастанием к первому месяцу жизни (максимально до 40 нг/мл). Определение17-ОНП проводили методом ИФА. У всех пациентов уровни кортизола и тестостерона находились в пределах референсных значений, был повышен уровень АКТГ (260-356 пг/мл при норме 90-140). Ни у одного из пациентов клинических проявлений заболевания отмечено не было. Все 4 случая НК21ОН были подтверждены молекулярно-генетическим исследованием: у 3 новорожденных на одном аллеле гена располагалась мутация P30L, характерная для НК21ОН, на другом аллеле в одном случае выявлена мутация R356W, характерная для сольтеряющей формы заболевания, в другом случае та же мутация сочеталась с I172N, характерной для вирильной формы ВДКН. Интересно, что у одного новорожденного в ходе молекулярно-генетического исследования были обнаружены две компаундные гетерозиготные мутации, ассоциированные практически с полной потерей ферментативной активности 21-гидроксилазы, т.е. с сольтеряющей формой заболевания (генотип R356W/707del8). При этом до 2-летнего возраста клинические проявления заболевания отсутствовали. В ходе скрининга уровень 17-ОНП у этого ребенка был сравним с таковым у остальных 3 пациентов, однако на фоне стимуляции аналогами АКТГ уровень 17-ОНП соответствовал сольтеряющей форме заболевания. При проведении стимуляционных проб с аналогами АКТГ у остальных новорожденных уровень 17-ОНП достигал промежуточных значений между принятыми критериями для диагностики классических и неклассических форм ВДКН [16]. При сочетании мутации, характерной для НК21ОН (во всех случаях P30L) с I172N, характерной для вирильной формы ВДКН, уровень 17-ОНП на фоне стимуляции был ниже, чем в случае сочетания той же мутации с R356W, характерной для сольтеряющей формы.

По данным другого исследования той же группы [4], из 7 случаев НК21ОН у 4 пациентов заболевание выявлено в ходе неонатального скрининга.

У всех пациентов рост и масса тела при рождении соответствовали критериям доношенности, ни у одного из них не было клинических проявлений надпочечниковой недостаточности и/или синдрома гиперандрогении. По данным скрининга на ВДКН, уровень 17-ОНП (ИФА) был незначительно повышен (6,2-19 нг/мл) с постепенным нарастанием (у 3 пациентов к первому месяцу жизни уровень 17-ОНП колебался от 45 до 67 нг/мл, у 1 пациента к 3,5 годам он оказался равным 107 нг/мл). В ходе стимуляционной пробы с аналогами АКТГ уровень 17-ОНП достигал промежуточных значений между принятыми критериями для диагностики классических и неклассических форм ВДКН. При молекулярно-генетическом исследовании во всех 4 случаях на одном аллеле была выявлена характерная для НК21ОН мутация P30L, на втором аллеле - сочетание нескольких мутаций, встречающихся при классических формах заболевания: сплайсинговая мутация втрого интрона, I172N, R356W. Указания на проводимое этим детям лечение отсутствовали.

В 2007 г. в Японии был описан еще один случай неклассической формы ВДКН, выявленной в ходе неонатального скрининга. Заболевание было обусловлено гомозиготной мутацией V281L в гене СYP21 [13]. У девочки, рожденной от неблизкородственного брака, родителей бразильского происхождения, в ходе неонатального скрининга было выявлено повышение уровня 17-ОНП до 8,8 нг/мл; при ретестировании отмечено нарастание показателя до 15 нг/мл. При обследовании в возрасте 2 мес признаки вирилизации и/или надпочечниковой недостаточности у пациентки отсутствовали; в крови нормокалиемия, нормонатриемия, уровень АКТГ в пределах нормы (22,6 пг/мл), уровень 17-ОНП слегка повышен (9,2 нг/мл). В возрасте 3 мес сохранялся незначительно повышенный уровень 17-ОНП

(7,9 нг/мл), в ходе стимуляции аналогами АКТГ уровни кортизола и альдостерона до и после стимуляции соответствовали нормам для здоровых детей, а уровень 17-ОНП после стимуляции позволил диагностировать НК21ОН (т.е. соответствовал номограммам, приведенным M. New и соавт. [17]). Лечение пациентке не назначалось.

В последней из публикаций, датированной 2008 г., группа авторов из Японии приводит описание еще 3 пациентов с НК21ОН, заподозренной при скрининге [14]. Уровни 17-ОНП были незначительно повышены - до 25,1, 58,7 и 23 нмоль/л и нарастали при повторном исследовании. Ни у одного из пациентов не было клинико-гормональных признаков надпочечниковой недостаточности, биохимических признаков нарушений водно-электролитного баланса. У первого пациента (мальчик, возраст обследования 32 дня) базальный уровень 17-ОНП составил 22,6 нмоль/л, в ходе АКТГ-стимуляционной пробы - 289,9 нмоль/л; при молекулярно-генетическом анализе выявлена мутация P30L/I2spl. У второй пациентки (девочка, возраст обследования 67 дней), несмотря на нормальный базальный уровень 17-ОНП, в ходе стимуляции отмечено его повышение до 260 нмоль/л, что в совокупности с отсутствием клинических проявлений позволило диагностировать НК21ОН. По данным молекулярно-генетического анализа, в гене CYP21A2 были обнаружены мутации I236N, V237E, M239K. Двое пациентов приходились друг другу родными братом и сестрой. У девочки, обследованной в возрасте 15 дней, базальный уровень 17-ОНП составлял 58,2 нмоль/л. Несмотря на умеренно повышенный уровень 17-ОНП в ходе АКТГ-стимуляционного теста (91,3 нмоль/л), максимальный уровень 17-ОНП, зафиксированный в течение суток, составил 736,2 нмоль/л. Эти данные в совокупности со значительно повышенным базальным уровнем 21-дезоксикортизола (до 308,8 нмоль/л) позволили заподозрить дефицит 21-гидроксилазы. Диагноз был подтвержден молекулярно-генетически: одна мутация была унаследована от отца (P30L), две другие (I172N и R356W) от матери. Из-за плохой прибавки в массе тела девочке был назначен гидрокортизон в дозе 12 мг/сут; лечение продолжалось до 11-месячного возраста.

Таким образом, полученные нами результаты и данные литературы позволяют сделать вывод о возможности диагностики НК21ОН у новорожденных. Причиной обращения таких пациентов к эндокринологам служит незначительное повышение уровня 17-ОНП в отсутствие клинико-гормональных признаков надпочечниковой недостаточности. Дальнейшее тщательное обследование таких пациентов (гормональный профиль, молекулярно-генетический анализ) позволяет подтвердить или исключить заболевание.

1. Уровень 17-ОНП, зарегистрированный при скрининге, позволяет заподозрить НК21ОН, однако, учитывая высокий процент ложноположительных результатов, не может служить критерием диагностики заболевания у новорожденных.

2. Метод LC/MS-MS является более специфичным, точным и прогностически более ценным при определении уровня 17-ОНП для диагностики НК21ОН у детей.

3. Несмотря на отсутствие нормативов уровня 17-ОНП, определяемого методом ТМС, значения показателя в группе «здоровых» детей (от 1,5 до 4,3 нмоль/л) могут быть приняты в качестве референсного интервала.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - А.Н. Тюльпаков, Т.А. Ионова

Сбор и обработка материала - Т.А. Ионова

Написание текста - Т.А. Ионова

Редактирование - А.Н. Тюльпаков

Конфликт интересов отсутствует.