Сахарный диабет (СД) является одним из самых распространенных заболеваний у человека. По оценкам ВОЗ, в мире насчитывается не менее 347 млн больных СД [1], и к 2030 г. данное заболевание будет входить в число 7 наиболее частых причин летальности [2]. Хотя у большинства пациентов диагностируется СД 1-го или 2-го типа, 5-10% всех случаев заболевания имеют моногенную природу. К данной группе относятся доминантнонаследуемые варианты заболевания, обусловленные дефектами одного из генов, регулирующих функцию β-клетки. Этот подтип СД, впервые описанный в 1975 г., принято именовать MODY (Maturity-Onset Diabetes of the Young, СД зрелого типа у молодых).
На сегодняшний день известны мутации в 11 генах, приводящие к развитию разных типов MODY, которые отличаются между собой частотой встречаемости, клинической картиной и терапевтической тактикой ведения пациентов. Несмотря на существенную вариабельность частоты MODY в различных популяциях, превалируют мутации в генах HNF1A и GCK [3]. Так, исследования английской, французской, немецкой, итальянской и испанской групп пациентов с MODY-фенотипом показали, что в 10-60% случаев встречается MODY2 (особенно среди французских и итальянских семей) [4] и в 20-65% случаев - MODY3 (в основном в английских семьях) [3, 6]. В отечественной литературе [5] присутствуют единичные описания подтвержденных случаев типа МODY3, в связи с чем мы приводим собственные наблюдения трех семей с подтвержденными мутациями в гене HNF1A.
Материал и методы
Гормональные исследования. Определение уровней иммунореактивного инсулина (ИРИ) и С-пептида проводилось с использованием коммерческих наборов.
Молекулярно-генетические исследования. Геномную ДНК выделяли из периферических лейкоцитов с использованием стандартных методов. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировали фрагменты геномной ДНК, охватывающие кодирующую последовательность гена HNF1A с примыкающими участками интронов. После электрофореза в 1% агарозном геле продукты ПЦР очищали с использованием набора PCR Purification Kit («Promega», США), а затем секвенировали на автоматическом секвенаторе ABI Genetic Analyzer 3130 («Applied Biosystems», США). При проведении ПЦР и последующем секвенировании соответствующих экзонов и примыкающих участков интронов использовали следующие олигонуклеотиды:
1F, 5’-GTGCAAGGAGTTTGGTTTGTG-3’;
1R, 5’-GAAGGTCATGGGGACTCAAC-3’;
2F, 5’-CTGGGCTCCATAACTGCTTTC-3’;
2R, 5’-CCATCTACCTGTCTGTGTAATG-3’;
3F, 5’-CTGTAAGCTCCTCTGGTTCAG-3’;
4R, 5’-GGAACCAAACTGAAGTGCAAAG-3’;
5F, 5’-GCAAACCAATGGAGTTTGAAGTG-3’;
7R, 5’-GAGACACATGCAGACTGCAATG-3’;
8F, 5’-CAAGCGCAGCTGAGCAGTTC-3’;
10R, 5’-CCTCCTACATCTGCCATGAAC-3’.
В качестве референсной последовательности гена HNF1A использовалась ссылка Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) NM_000545.5. Обозначение мутаций проводили в соответствии с рекомендациями Den Dunnen и Antonarakis [7].
Описания клинических случаев
Семья I
Я.Н., 66 лет (I.1) (мать пробанда). В возрасте 37 лет в послеоперационном периоде по поводу желчекаменной болезни отмечалась гипергликемия, которая была расценена как результат длительного введения растворов глюкозы. В 41 год во время беременности выявлена глюкозурия. Диету не соблюдала, инсулинотерапию не получала, гликемию не контролировала. Ребенок родился с нормальной массой тела. На основании проведенного в 66 лет обследования установлен СД 2-го типа, рекомендована диетотерапия.
Дочь Я.Ю., 24 года (I.2.1) (пробанд). С раннего детства на фоне интеркуррентных заболеваний или избыточного потребления сладкого неоднократно определялась глюкозурия без гипергликемии. Диагноз «сахарный диабет» установлен в возрасте 15 лет на основании глюкозурии и повышения уровня гликемии натощак до 8 ммоль/л. При этом характерных для СД 1-го типа классических клинических признаков (полиурия, полидипсия, похудание) не отмечалось. Длительное время получала по 2-4 Ед инсулина короткого действия перед едой. При применении пролонгированного инсулина отмечались гипогликемии. В возрасте 22 лет больше года не соблюдала диету и не делала инъекции инсулина (см. таблицу).
Е.А., 42 года (I.2.2), (единоутробный брат пробанда). В возрасте 38 лет при обследовании выявлена некетотическая гипергликемия до 16 ммоль/л.
В анамнезе длительная глюкозурия, по поводу которой никогда не обследовался. Перенес два инфаркта. Диагностирован СД 1-го типа, осложненный полинейропатией, ангиопатией сетчатки, нефропатией, назначена инсулинотерапия. Уровень HbА
У бабушки по линии матери (старшей из 7 сестер) периодически фиксировалось повышение гликемии натощак. Известно, что ее третья, пятая и седьмая сестры заболели СД в возрасте 25 лет, имели многочисленные сосудистые осложнения. Четвертая сестра страдала ожирением, СД выявлен после 60 лет. У двоих двоюродных дядей (сыновья четвертой и пятой сестер бабушки) СД выявлен до 40 лет, один из них умер от инфаркта. У двоюродной тети (дочь седьмой сестры бабушки) СД также диагностирован до 40 лет; получает инсулинотерапию. У ее дочери периодически выявляется гипергликемия натощак.
У всех перечисленных членов семьи аутоиммунные маркеры СД (АТ к GAD, АТ к инсулину, АТ к островковым клеткам) - отрицательные (см. рисунок).
Семья II
В.С., 60 лет (II.1) (дед пробанда): СД был выявлен в возрасте 40 лет. Лечения инсулином и сахароснижающими препаратами не получал, диету соблюдал не постоянно.
А.В., 38 лет (II.2) (отец пробанда): СД диагностирован в возрасте 20 лет. Терапию не получал. На момент обследования ребенка гликемия натощак достигала 13,0 ммоль/л.
Дочь В.А., 14 лет (II.3) (пробанд). Впервые гипергликемия натощак 10,0 ммоль/л выявлена случайно при прохождении обследования для оформления санаторно-курортной карты. Тщательный сбор анамнеза помог установить, что девочку в течение года эпизодически беспокоила жажда и учащенное мочеиспускание. При обследовании выявлена гипергликемия натощак в пределах 9,0-13,5 ммоль/л и до 18,9 ммоль/л после еды, кетонурия ++. Базальные уровни инсулина - 0,5 мкМЕ/мл. На фоне внутривенного теста с глюкозой уровень инсулина оставался низкими (на 5-й минуте 0,4 мкМЕ/мл). Уровень HbA1c 8,3%. Аутоиммунные маркеры СД - отрицательны. Назначена инсулинотерапия (0,43 Ед/кг/сут) (новорапид+лантус), на фоне которой гликемия нормализовалась. После молекулярно-генетической верификации MODY3 больная переведена на пероральные сахароснижающие препараты (глибенкламид 7 мг/сут, метформин 1000 мг/сут), на фоне приема которых гликемия натощак максимально до 6,2 ммоль/л, постпрандиально - до 8,1 ммоль/л, уровень HbA1c снизился до 6,2%.
При анализе гена HNF1A у пациентов данной семьи была выявлена гетерозиготная мутация в экзоне 4: вставка цитозина в положении 865, что приводило к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона в позиции 316 (c.865insCp.R292fsX316).
Семья III
Р.А., 60 лет (III.1) (бабушка пробанда): в анамнезе - гестационный диабет (25 лет). С 60 лет получает инсулинотерапию (лантус) в сочетании с пероральными сахароснижающими средствами (гликлазид, метформин). Осложнения: полинейропатия, ангиопатия нижних конечностей.
Ш.Н., 34 лет (III.2) (мать пробанда). В возрасте 10 лет при проведении ОГТТ выявлено нарушение толерантности к углеводам и глюкозурия. Принимала гликлазид и глибенкламид с положительным эффектом. С-пептид, инсулин и HbA1c в дебюте заболевания не исследовались. Во время беременности (19 лет) получала инсулинотерапию. После беременности никакой терапии не получала. При обследовании в 27 лет гликемия натощак до 6,0 ммоль/л, после еды - до 10 ммоль/л, рекомендована диетотерапия. В 2005 г. (30 лет) при планировании беременности выявлены гликемия 22 ммоль/л, HbA1c 11,4%, нейропатия, ретинопатия. Назначена инсулинотерапия.
Ш.М., 13 лет (III.3) (пробанд). В связи с отягощенной наследственностью девочке постоянно проводился самоконтроль гликемии. В январе 2009 г. появились жалобы на утомляемость, боли в ногах.
В мае 2009 г. впервые зафиксирована гипергликемия натощак 6,3-11,1 ммоль/л и глюкозурия. При обследовании: HbА
При молекулярно-генетическом исследовании у пациентов данной семьи была выявлена гетерозиготная мутация в экзоне 4 гена HNF1A: делеция гуанина в положении 862, что приводило к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона в позиции 341 (c.862delG p.Q291fsX341).
Обсуждение
Роль мутаций в гене HNF1A в развитии MODY3 впервые была доказана в 1996 г. [8]. Как и другие факторы транскрипции (HNF1B и HNF4A), HNF1A впервые был открыт при изучении белков, ответственных за тканеспецифичную регуляцию генов экспрессии в печени. HNF1A, HNF1B и HNF4A принадлежат к семье факторов транскрипции, совместно управляющих экспрессией генов в период эмбрионального развития и в течение всей жизни. Факторы транскрипции (белки) контролируют процесс синтеза мРНК на матрице ДНК (транскрипцию) путем связывания со специфичными участками ДНК [9]. Они обеспечивают снижение (репрессоры) или повышение (активаторы) константы связывания РНК-полимеразы с регуляторными последовательностями регулируемого гена [10, 11]. Ген HNF1A картирован на длинном плече хромосомы 12, имеет 10 кодирующих экзонов и кодирующую последовательность из 1893 пар нуклеотидов. Состоящий из 631 аминокислотного остатка регуляторный белок выступает в качестве гомеодоменсодержащего фактора транскрипции, экспрессирующегося в панкреатических β-клетках, печени, кишечнике, почках. В β-клетках поджелудочной железы этот фактор играет важную роль в транскрипции генов, участвующих в секреции инсулина, транспорте и метаболизме глюкозы (GLUT2), транспорте аминокислот, а также синтезе нескольких митохондриальных ферментов, так или иначе связанных с синтезом инсулина [12]. В почках HNF1A экспрессируется в клетках канальцев, что клинически ассоциировано с глюкозурией [13]. В печени эти белки регулируют биосинтез липопротеинов [14]. В случае развития MODY3, мутации гена HNF1A приводят к нарушению секреции инсулина и/или снижению количества β-клеток, а также снижению почечного порога для глюкозы.
Определяющей чертой факторов транскрипции является наличие в их составе одного или более доменов, которые взаимодействуют с характерными участками ДНК, расположенными в регуляторных областях генов. Ген HNF1A состоит из трех функциональных областей: N-терминального домена димеризации (остатки 1-32), С-концевого домена трансактивации (остатки 281-628) и ДНК-связывающего домена (остатки 98-280). Мутации в HNF1A наиболее часто локализованы в ДНК-связывающем домене, в 3 раза реже в трансактивационном домене и крайне редко в промоторе [15]. Экспериментальные данные показали, что мутации в гене HNF1A, локализованные в трансактивационном домене, могут оказывать доминантный негативный эффект, влияя на трансактивационный потенциал димеров [16]. Следует отметить, что ядерный фактор транскрипции HNF1A относится к активируемым факторам.
Глюкоза, аминокислоты, жирные кислоты и кетоновые тела стимулируют секрецию инсулина, поступая в клетку и активируя фактор транскрипции, который затем связывается с ДНК, вызывая активацию транскрипции. Точный механизм, посредством которого мутации в генах факторов транскрипции приводят к развитию СД, до настоящего времени неизвестен. Появляется все больше доказательств, что ядерные факторы гепатоцитов играют ключевую роль в развитии, регулировании пролиферации и метаболизме β-клеток. Сочетание этих факторов, вероятно, приводит со временем к прогрессированию дисфункции β-клеток [3].
Более 300 различных мутация, приводящих к развитию MODY3, были обнаружены как в кодирующей последовательности, так и в промоторе гена HNF1A (http://www.hgmd.cf.ac.uk/). Масштабное исследование [15], проведенное в Англии в 2006 г. среди 413 семей с фенотипом MODY, выявило 193 различные мутации в гене HNF1A в 373 семьях. Дефекты HNF1A включали миссенс- (52,6%) и нонсенс-мутации (8,3%), инсерции и дупликации (5,6%), делеции (18,6%), инверции/делеции (1,5%), мутации зоны промотора (6,7%) сайтов сплайсинга (6,7%), а также 4 мутации по типу сдвига рамки считывания [15]. Наиболее частой локализацией мутаций были экзоны 2 и 4 (ДНК-связывающий домен), реже экзоны 5 и 10 (трансактивационный домен).
В результате наиболее часто выявляемой мутации по типу «сдвига рамки считывания» в экзоне 4 (Pro291fsinsA или Pro291fsinsС) синтезируется укороченный белок длиной в 315 аминокислот [17]. Эта мутация довольно широко распространена в Японии, Великобритании, Германии и Финляндии: поэтому исследователи предположили, что кодон 291 является «горячей точкой» мутагенеза и занимает особое положение в структуре белковой молекулы фактора [8, 18-20]. Так и мы выявили ранее известные мутации c.865insCp.R292fsX316 [14] и c.862delGp.Q291fsX341 [18], затрагивающие данную область гена. Достоверных корреляционных зависимостей между возрастом начала диабета, клиническими проявлениями, способом лечения, локализацией мутаций и ее типами не обнаружено [18].
Диагностика всех вариантов MODY базируется, прежде всего, на доминантном типе наследования, раннем начале и отсутствии или низкой потребности в инсулине. Однако в зависимости от экспрессии того или иного гена, фенотип заболевания в каждом случае будет иметь отличительные черты. Для MODY3 характерно относительно позднее начало (вторая и третья декады жизни), но быстрое прогрессирование заболевания от нарушенной толерантности к глюкозе до СД [3, 21, 22]. До подросткового возраста нарушения углеводного обмена у большинства пациентов с мутациями в гене HNF1A возникают крайне редко. MODY3 диагностируется, как правило, между 10 и 40 годами [23] Манифестация заболевания обычно провоцируется факторами, вызывающими снижение чувствительности к инсулину. Так, в семьях с доказанной моногенной природой нарушений углеводного обмена их манифестация приходится на период полового созревания и высоких темпов роста, что отчетливо видно на примере наших пациентов. Рядом исследований [24, 25] доказано достоверное снижение тощаковой и стимулированной инсулиновой секреции, в том числе проинсулина и С-пептида. Сниженная секреция инсулина в ответ на введение глюкозы иногда может предшествовать нарушениям гликемии, выявляемым в ходе ОГТТ [26]. Следует отметить, что по сравнению с MODY2 гликемия через 2 ч после углеводной нагрузки при дефекте HNF1A значительно выше [13]. Часто выявляется диабетический тип кривой. Таким образом, клиническая картина MODY3 характеризуется несколькими вариантами течения. Чаще всего заболевание протекает как СД 1-го типа. Нетипичным является отсутствие кетоза при манифестации заболевания и благоприятное течение: характерна удовлетворительная компенсация заболевания (содержание HbA
Вид терапии данного типа MODY в настоящее время не вызывает сомнений. Хотя пациенты с мутациями в гене HNF1A по сравнению с другими типами MODY наиболее чувствительны к гипогликемическому эффекту препаратов сульфонилмочевины [27], по мере снижения инсулиновой секреции не исключено назначение инсулинотерапии.
Заключение
Описанные случаи MODY3 расширяют наши представления об одном из наиболее частых типов MODY и создают предпосылки для усовершенствования диагностики данного заболевания, генетического консультирования и разработки патогенетических подходов к лечению.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования - Н.А. Зубкова, Н.Ю. Арбатская, Е.Е. Петряйкина, О.А. Малиевский А.Н. Тюльпаков
Сбор и обработка материала - Н.А. Зубкова, Н.Ю. Арбатская, Е.Е. Петряйкина, О.А. Малиевский
Написание текста - Н.А. Зубкова
Редактирование - О.А. Малиевский, А.Н. Тюльпаков