Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) — группа заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования, при которых нарушен один из этапов биосинтеза кортизола вследствие генетически обусловленного дефекта ферментных систем или транспортных белков. Дефицит фермента 21-гидроксилазы является самой распространенной формой заболевания и встречается более чем в 90% всех случаев ВДКН [1—5]. Средняя распространенность классических форм заболевания, вычисленная по данным неонатального скрининга, составляет в среднем 1 на 10 000—15 000 новорожденных [6—14]. В российской популяции, по последним данным, эта величина достигает 1:8000. Частота встречаемости неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы (НК21ОН) обычно превышает таковую классических вариантов заболевания, но значительно варьирует в различных популяциях, колеблясь от 1:27 до 1:10 000 новорожденных [15—19]. Для российской популяции эти данные отсутствуют. В отличие от классических форм дефицита 21-гидроксилазы, характеризующихся наличием специфических клинико-лабораторных критериев, выявляющихся уже в период новорожденности, клинические и гормональные проявления НК21ОН отсрочены и неспецифичны, что затрудняет возможность оценки ее распространенности по обращаемости и данным неонатального скрининга. Нами была оценена частота встречаемости НК21OH на основании распространенности двух наиболее частых мутаций, характерных для данного заболевания.

Объект исследования — случайно отобранные образцы пятен крови, полученные при проведении неонатального скрининга у детей, родившихся в течение одного календарного года на территории Московской области. Критериями включения являлись доношенность новорожденного и отсутствие тяжелых врожденных заболеваний. Уровень 17-гидроксипрогестерона (17-ОНП) при отборе образцов не учитывался.

Для определения необходимого объема наблюдений использовалась статистическая формула (относительные величины):

где n — необходимый объем наблюдений, t — доверительный коэффициент, р — показатель, взятый из предыдущих исследований, а если аналогичные исследования не проводились, то берется максимальная величина pq, равная 50%, Δ — ошибка.

Молекулярно-генетическое исследование. ДНК выделяли с использованием наборов Diatom Pre DHA 100. Для выявления мутации V281L при ПЦР использовали следующие олигонуклеотиды: F1, CGGACCTGTCCTTGGGAGACTAC (прямой праймер, специфичный для экзона 3 гена CYP21A2), 1688T, GGTCCACTGCAGCCATGTGCAA (обратный праймер, специфичный для мутации V281L), и R1, CCTCTCCCAGACCGTCTCATC (обратный праймер, внутренний контроль). При наличии мутации V281L ожидалась амплификация 2 ПЦР-продуктов: F1-1688T (993 п.о.) и F1-R1 (1635 п.о.), при отсутствии мутации — 1 ПЦР-продукт F1-R1 (1635 п.о.). Наличие мутации подтверждалось затем при секвенировании.

Для выявления мутации P30L при ПЦР использовали следующие олигонуклеотиды: F2, GCGATTCAGGAAGGCCTATTAGG (прямой праймер, внутренний контроль), 92T, CTCCG GAGCCTCCACCTCCT (прямой праймер, специфичный для мутации P30L), и R2, TCCAGAG CAGGGAGTAGTCTC (обратный праймер, специфичный для экзона 3 гена CYP21A2). При наличии мутации P30L ожидалась амплификация 2 ПЦР-продуктов: F2-R2 (1146 п.о.) и F2-92T (640 п.о.), при отсутствии мутации — 1 ПЦР-продукт F2-R2 (1146 п.о.). Наличие мутации подтверждалось затем при секвенировании.

Вычисление частоты заболевания проводилось по формуле Харди—Вайнберга:

p² + 2pq + q² = 1,

где p² — доля гомозигот по одному из аллелей; p — частота этого аллеля; q² — доля гомозигот по альтернативному аллелю; q — частота соответствующего аллеля; 2pq — доля гетерозигот.

Статистическую обработку материала проводили с помощью пакета прикладных программ StatPlus 2008. В ходе исследования анализировались выборки, подчиняющиеся нормальному распределению и характеризующиеся показателем µ±σ, где µ — среднее, σ — стандартное отклонение. Количественные данные представлены в виде Ме (25—75), где Ме — медиана; 25 и 75 — разброс значений в виде соответствующих процентилей. При сопоставлении двух независимых выборок пользовались критерием Стьюдента (t).

Объем наблюдений (при t=2, т.е. с вероятностью безошибочного прогноза Р=95%) оказался равным 938. В результате аллель-специфической ПЦР среди 938 исследуемых образцов в 41 была обнаружена мутация V281L. Наличие мутации было проверено секвенированием соответствующего участка гена в каждом из образцов: в 2 образцах мутации выявлено не было, т.е. число носителей оказалось равным 39. Интересно, что в некоторых образцах при секвенировании были выявлены дополнительные мутации в гетерозиготном состоянии (cм. таблицу).

Нами также был проанализирован уровень 17-ОНП у группы носителей (n=39) и в образцах, где мутаций выявлено не было (n=899), и получены следующие результаты: среднее значение 17-ОНП в первой группе составило 5,8±3,1 нмоль/л, минимальное значение 17-ОНП — 2 нмоль/л, максимальное — 15,4 нмоль/л; во 2-й группе образцов средний уровень значений 17-ОНП оказался равным 5,9±3,0 нмоль/л, при этом минимальный уровень показателя — 0,3 нмоль/л, максимальный — 25,9 нмоль/л (см. рисунок).

ВДКН представляет собой группу наследственных заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования, в основе которых лежит дефект одного из ферментов или транспортных белков, принимающих участие в биосинтезе кортизола. Наиболее часто (более чем в 90% случаев) среди известных 7 форм ВДКН встречается дефицит 21-гидроксилазы. Клинически принято различать три основные формы дефицита 21-гидроксилазы: две классические (простая вирильная и сольтеряющая форма) и неклассическая форма заболевания (НК21ОН) [1—3, 5]. Средняя распространенность классических форм дефицита 21-гидроксилазы высока и составляет в среднем 1 на 10 000—15 000 новорожденных [6—14] с наибольшей частотой встречаемости среди таких популяций, как юпик-эскимосы (1:282) [20] и жители региона Реюньон во Франции (1:2100) [6] и наименьшей — в популяции Китая (1:28 000) [21].

В российской популяции, по последним данным, эта величина равна 1:8847 новорожденных. Приведенные данные получены в основном при неонатальном скрининге на ВДКН по уровню 17-ОНП — специфического маркера дефицита 21-гидроксилазы. Исключение составляет исследование популяции Китая, где распространенность была вычислена по закону Харди—Вайнберга из частоты носителей гетерозиготных мутаций при исследовании 1000 случайных образцов [21].

Что касается НК21ОН, то данные литературы о распространенности этой формы заболевания скудны и также весьма вариабельны, что объясняется, во-первых, влиянием национальных и этнических факторов, а во-вторых, — неодинаковыми подходами для вычисления данного показателя в разных популяциях. При этом было ярко продемонстрировано, что частота встречаемости НК21ОН значительно превышает таковую классических вариантов и что НК21ОН является едва ли не самым распространенным моногенным заболеванием с аутосомно-рецессивным типом наследования [15]. Исследование B. Therrell и соавт. [8], проведенное в 1998 г., показало, что неонатальный скрининг на ВДКН позволяет идентифицировать классические формы дефицита 21-гидроксилазы в 86%, а неклассические — лишь в 13%. Так, распространенность НК21ОН среди жителей Техаса, по данным неонатального скрининга, составила 1:35 870, что в десятки раз ниже таковой в среднем в популяции (1:1000). Важно отметить, что клинические проявления НК21ОН очень вариабельны и отсрочены, а от 20 до 50% пациентов с верифицированной НК21ОН вообще не имеют клинических проявлений заболевания [22, 23]. Таким образом, оценить истинную распространенность НК21ОН, используя гормональные маркеры (неонатальный скрининг) или данные обращаемости за медицинской помощью (т.е. по совокупности клинических симптомов), невозможно. В 1985 г. P. Speiser и соавт. [15], обследуя семьи детей с классическими и неклассическими формами дефицита 21-гидроксилазы среди различных этнических групп, предприняли попытку вычислить распространенность НК21ОН по частоте гена, опираясь на гормональные критерии. Так, наибольшая частота НК21ОН, вычисленная с помощью закона Харди—Вайнберга по частоте гена в популяции, была выявлена у евреев ашкенази — 1 (3,7%) из 27; несколько меньшая частота НК21ОН была выявлена у испаноговорящих народов и славян (1/53 и 1/63 соответственно), реже всего заболевание встречалось у итальянцев (1/333) и «остальных» европейцев (1:1000). Таким образом, средняя частота заболевания среди всех представленных популяций составила 1:111 [15]. S. Sherman и соавт. [16], используя ту же выборку пациентов, что и P. Speiser [15], применили более совершенную методику вычисления частоты заболевания с учетом расщепления и сцепления генов, клинико-гормональных данных и HLA-типирования. Вычисленные частоты гена в популяции были сравнимы с таковыми в исследовании P. Speiser [15].

В 1999 г. опубликована статья группы исследователей из Новой Зеландии, США и Швейцарии, которые провели молекулярно-генетическое исследование (аллель-специфическая ПЦР с анализом 9 наиболее частых мутаций, включая характерные для НК21ОН V281L и Р30L) 603 образцов пятен крови, полученных в ходе неонатального скрининга в одном из центров Новой Зеландии. В 2% (12 образцов из 603) были выявлены мутации, характерные для НК21ОН, причем в 100% случаев обнаружена мутация V281L. Таким образом, распространенность заболевания в Новой Зеландии, исходя из частоты носителей, составила 1:10 000 [18]. Вторым крупным исследованием по изучению распространенности НК21ОН среди населения средней Европы явилась работа ученых из Австрии [17]: методом аллель-специфической ПЦР образцов крови 200 человек разных этнических групп носительство гетерозиготных мутаций, характерных для НК21ОН, было выявлено у 4% обследуемых. Таким образом, частота гетерозигот составила 1:25, а вычисленная распространенность заболевания — 1:2500. Среди выявленных носителей в 87,5% обнаружена характерная мутация V281L, в остальных случаях — P30L. В 2008 г. изучение распространенности НК21ОН продолжила группа авторов из Испании, которые провели молекулярно-генетическое исследование (секвенирование) образцов крови 144 добровольцев (95 женщин, 49 мужчин), в ходе которого мутации, характерные для НК21ОН, были выявлены в 17 из 144 образцов; частота носительства составила 12% или 1:8, а распространенность заболевания, вычисленная по закону Харди—Вайнберга, — 1:255. Важно отметить, что в 16 (94%) из 17 образцов была выявлена мутация V281L [19].

В настоящем исследовании распространенность НК21ОН, рассчитанная по частоте носительства двух искомых мутаций (V281L и P30L) на примере популяции Московской области, оказалась равной 1:2206, что совпадает с данными S. Baumgartner-Parzer и соавт. [17]. Ни в одном из 938 образцов носительства мутации P30L обнаружено не было, что, в соответствии с данными трех зарубежных исследований, описанных выше, доказывает, что частота встречаемости мутации V281L значительно превышает частоту встречаемости мутации P30L [17—19].

При сравнении уровней 17-ОНП в группе носителей и группе, где мутаций выявлено не было, достоверной разницы выявлено не было. Подобный анализ в зарубежных работах не проводился.

Для сравнения нами также был рассчитан показатель распространенности НК21ОН по данным скрининга. В нашем центре за период 2007—2011 гг. были диагностированы 7 случаев НК21ОН, заподозренных на основании повышенного уровня 17-ОНП при неонатальном скрининге. За указанный период неонатальным скринингом на ВДКН были охвачены все дети, родившиеся на территории Московской области. Учитывая количество детей, родившихся в Московской области в период 2007—2011 гг. (279 607, по данным федеральной службы государственной статистики), частота заболевания получается равной 1:39 944, что более чем в 18 раз ниже истинной частоты НК21ОН, рассчитанной по закону Харди—Вайнберга. Естественно, следует учесть тот факт, что не все дети, у которых при скрининге выявлялись повышенные значения 17-ОНП, проходили обследование в нашем центре.

1. В популяции Московской области минимальный показатель распространенности НК21ОН равен 1:2206.

2. Уровень 17-ОНП, полученный в ходе скрининга, не позволяет выявлять носителей.

3. Неонатальный скрининг в большинстве случаев не позволяет диагностировать НК21ОН.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Н. Тюльпаков, Т.А. Ионова

Сбор и обработка материала — Т.А. Ионова, С.Г. Калиненкова

Статистическая обработка данных — Т.А. Ионова

Написание текста — Т.А. Ионова, А.Н. Тюльпаков

Редактирование — А.Н. Тюльпаков, С.Г. Калиненкова

Конфликт интересов и финансовая заинтересованность авторов отсутствуют.