Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Чагай Н.Б.

Центр планирования семьи и репродукции Краевого клинического диагностического центра, Ставрополь

Фадеев В.В.

Эндокринологический научный центр, Москва

Прокофьев С.А.

ФГУ Эндокринологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации, Москва

Иванова О.Н.

ФГБУ "Эндокринологический научный центр" Минздрава РФ, Москва

Смирнова Н.Б.

ФГБУ "Эндокринологический научный центр" Минздрава РФ, Москва

Атаманова Т.М.

ФГБУ "Эндокринологический научный центр" Минздрава РФ, Москва

Тишина Ю.В.

ФГБУ "Эндокринологический научный центр" Минздрава РФ, Москва

Применение теста с 5 мкг АКТГ в диагностике неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников (итоги исследования)

Авторы:

Чагай Н.Б., Фадеев В.В., Прокофьев С.А., Иванова О.Н., Смирнова Н.Б., Атаманова Т.М., Тишина Ю.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2013;59(2): 34‑39

Просмотров: 386

Загрузок: 3

Как цитировать:

Чагай Н.Б., Фадеев В.В., Прокофьев С.А., Иванова О.Н., Смирнова Н.Б., Атаманова Т.М., Тишина Ю.В. Применение теста с 5 мкг АКТГ в диагностике неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников (итоги исследования). Проблемы эндокринологии. 2013;59(2):34‑39.
Chagaĭ NB, Fadeev VV, Prokof'ev SA, Ivanova ON, Smirnova NB, Atamanova TM, Tishina IuV. The application of the ACTH (5 mcg) test for diagnostics of the non-classical form of congenital adrenal hyperplasia (results of a study). Problemy Endokrinologii. 2013;59(2):34‑39. (In Russ.).

?>

«Золотым стандартом» в диагностике неклассической формы (НФ) ВДКН является короткий тест с 250 мкг синактена — соединения, состоящего из первых 24 аминокислот, 39-аминокислотной цепи эндогенного АКТГ [1]. Введение синактена в указанной дозе сопровождается повышением его концентрации в сыворотке до 2000 пг/мл. Результаты этого теста у здоровых людей противоречивы [2, 3]. В настоящей работе подведены итоги многолетнего исследования, посвященного верификации неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы с помощью теста с 5 мкг АКТГ. Предварительные результаты изложены ранее [4].

Материал и методы

Обследовали 435 пациенток в возрасте 16—35 лет. Критериями включения в исследование служили: наличие дерматологических или биохимических признаков гиперандрогении (ГА) у больных как с нормогонадотропным ановуляторным, так и овуляторным менструальным циклом и нормогонадотропного ановуляторного бесплодия у больных без признаков ГА.

1-ю группу составили 234 пациентки с подтвержденной (клинической и/или биохимической) неопухолевой ГА, 2-ю группу — 201 пациентка без признаков ГА. Ановуляторное состояние имело место у 176 (75,2%) из 234 больных с ГА и у 172 (85,6%) из 201 больного без ГА. Включались также больные с привычной потерей беременности (12 — в подгруппе с ГА, 29 — без ГА). Об ановуляторном состоянии судили по наличию олигоменореи (<8 менструаций в год) и уровню прогестерона в сыворотке в середине II фазы менструального цикла <15 нг/мл.

Определение гормонов в сыворотке проводилось в лаборатории КДЦ (Ставрополь) методом твердофазного хемилюминесцентного иммуноанализа (IMMULITE I-DPC, «Beckman Coulter DxI»). Определение биологически активного тестостерона (биоТСТ) с учетом уровня глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ), при концентрации альбумина 4,3 г/дл осуществлялось с помощью калькулятора на сайте ISSAM [5]. Уровни андрогенов сравнивали с таковыми у здоровых женщин, сопоставимых по возрасту: тестостерон — 50,8 (38; 60,9) нг/дл; биоТСТ — 13,2 (9,5; 19,6) нг/дл; ДГЭА-С — 228 (180; 310) мг/дл. Референсные значения исследуемых стероидных гормонов: тестостерон 20,5—88,9 нг/дл; 17-ОНР — 0,07—3,3 нг/мл; кортизол — 190—750 нмоль/л (утро); ДГЭА-С — 35—430 мг/дл.

Для дифференциальной диагностики НФ ВДКН (дефицит 21-гидроксилазы) был применен низкодозовый тест с 5 мкг синактена (synacthen 250 мкг, «NOVARTIS», Швейцария). Непосредственно перед проведением теста 1 мл раствора синактена (250 мкг) разводили в 49 мл 0,9% раствора NaCl (в 1 мл полученной смеси содержалось 5 мкг синактена). При внутривенном введении к 1 мл полученного раствора добавляли 4 мл 0,9% раствора NaCl. Для уточнения диагноза в 20 наблюдениях был использован стандартный тест с 250 мкг 1-24-АКТГ. Тесты включали определение базальных уровней 17-ОНР и кортизола и их уровней через 30 и 60 мин после внутривенного введения препаратов.

Молекулярно-генетическое исследование (МГИ) химерного гена CYP21P/CYP21 [6] и наиболее частых мутаций в гене CYP21 проводили методом аллель-специфической ПЦР [7] в лаборатории генетики и клинической иммунологии ФГУ ЭНЦ Минздрава. Детекцию химерного гена CYP21P/CYP21 осуществляли модифицированным методом H. Lee и соавт. [6]. В первом раунде амплифицировали ген CYP21 и химерный ген CYP21P/CYP21, во втором — проводили дифференциацию этих генов с помощью специфических праймеров [6].

Оценка чувствительности и специфичности низкодозового теста с АКТГ базировалась на сравнении его результатов с данными стандартного (250 мкг) теста и МГИ гена CYP21.

Статистический анализ результатов был выполнен с помощью программ STATISTICA 6.0, MedCalc версия 7.4.2.0. Проверяли нормальность распределения методом Шапиро—Уилка; сравнение пар зависимых или независимых переменных оценивали с помощью соответствующего t-теста. Количественные признаки характеризовали медианой (Me) с квартилями [25; 75], диапазоном (Min—Max) и M±SD. При сравнении двух или более независимых выборок по выраженности количественных признаков применяли критерии Манна—Уитни (U). При сравнении двух или более связанных выборок применяли критерии Уилкоксона (W). Для статистического анализа различия между двумя группами по качественным признакам использовали критерий хи-квадрат (χ2). Зависимость между количественными признаками оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена (r) и Тау—Кендалла. Чувствительность, специфичность и точность теста с 5 мкг 1-24-АКТГ рассчитывали по стандартным формулам. Статистическая значимость различий принималась при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В 1-й группе состояние ГА подтверждено данными клиники (гирсутизм не менее 8 баллов по шкале Ферримана—Галлвея — у 146 (62,4%), акне — у 69 (29,5%) из 234 наблюдений и гормонального обследования (табл. 1).

Согласно имеющимся данным [8, 9], неклассическую форму дефицита 21-гидроксилазы следует предполагать при повышении уровня 17-ОНР (базального или АКТГ-стимулированного) >10 нг/мл. В нашем исследовании диапазон колебаний стимулированного 17-ОНР через 30 мин варьировал от 0,96 до 323,7 нг/мл [3,29 (2,33; 4,79) нг/мл], через 60 мин — от 0,99 до 113,23 нг/мл [3,62 (2,59; 5,86) нг/мл]. У 356 (81,8%) из 435 больных максимальный ответ на стимуляцию АКТГ был отмечен на 60-й минуте; разница между показателями через 30 и 60 мин после стимуляции статистически значимо (р=0,000). Различие динамики 17-ОНР отражает четкую зависимость от стимула (коэфф. конкордации Кендалла=0,77524; среднее ранговых корреляций r=0,77460). Неодинаковая чувствительность к АКТГ у разных больных может обусловить ложноотрицательный результат теста, если оценивать уровень гормона только на 60-й минуте.

В нашей работе базальный уровень 17-ОНР >10 нг/мл был зарегистрирован только у 2 (0,95%) больных с симптомами ГА (после стимуляции он превысил 17 нг/мл). У 25 больных (23 — с ГА, 2 — без ГА) с базальным уровнем 17-ОНР 2,58—7 нг/мл после введения 5 мкг синактена уровень гормона возрастал в 4 раза и более и превысил 10 нг/мл. Уровень 17-ОНР после стимуляции >14 нг/мл имел место у 18 пациенток; >10, но <14 нг/мл — у 7. Полученные результаты позволили предположить НФ-ВДКН на данном этапе у 27 больных (табл. 2).

На II этапе оценивали значимость не абсолютных значений, а степень повышения 17-ОНР для диагностики дефицита 21-гидроксилазы, сравнивали кратность повышения уровней 17-ОНР и кортизола. Такой подход продиктован необходимостью исключить недооценку максимального уровня 17-ОНР<10—14 нг/мл из-за применения «малой дозы» АКТГ.

В ответ на введение 5 мкг синактена у большинства пациенток кратность повышения кортизола уступала таковой для 17-ОНР (p<0,00000). Выявлена корреляция между базальным уровнем гормонов (кортизола или 17-ОНР) и степенью его повышения после введения 5 мкг синактена (r=0,265034; р=0,000001 — для кортизола; r=0,477788; р=0,0000 — для 17-ОНР). У 334 пациенток кратность повышения 17-ОНР не превысила 2,5; максимальный уровень оказался не более 6,2 нг/мл. У 32 (9,5%) из 334 пациенток максимальный уровень 17-ОНР колебался от 4 до 6,2 нг/мл, у остальных — был ниже 4 нг/мл. Мы полагаем, что у 334 (76,8%) больных с повышением уровня 17-ОНР не более чем в 2,5 раза и максимальным его уровнем <6,2 нг/мл диагноз НФ ВДКН, если не исключен, то маловероятен.

МГИ гена CYP21 проведено 14 больным с гирсутизмом и наиболее высокими показателями стимулированного 17-ОНР. Мутаций выявлено не было (см. ниже).

Диагностика дефицита 21-гидроксилазы была продолжена у 74 пациенток с базальным уровнем 17-ОНР >1,7 нг/мл [9], у которых зарегистрировано повышение этого уровня в 3 раза и более, или более чем в 4 раза при любом базальном уровне этого гормона.

По ответу на стимуляцию 1-24-АКТГ были выделены 2 типа реакции коры надпочечников (табл. 3):

нормергический [64% (49/74)] — кратность повышения уровня кортизола < 3 и гиперергический [35,9% (25/74)] — кратность повышения уровня кортизола ≥3. Кратность повышения уровня кортизола, равная 3, выбрана эмпирически [10, 11].

У 22 (46,3%) из 49 больных с нормергическим ответом на стимуляцию АКТГ зарегистрировано повышение 17-ОНР в 4 раза и более. У остальных смещения стероидогенеза в пользу 17-ОНР не зарегистрировано.

По максимальному уровню 17-ОНР после введения низкой и стандартной доз 1-24-АКТГ выделены типы ответа коры надпочечников (табл. 4):

дозонезависимый 42 (87,5%) из 48 — различие пиковых уровней 17-ОНР при обоих тестах незначимо; и дозозависимый 6 (12,5%) из 48: пиковые уровни 17-ОНР 6,7—7,3 нг/мл после применения низкой дозы, и >10 нг/мл после введения стандартной дозы.

Существование дозозависимой реакции на АКТГ у 6 (12,5%) из 48 пациенток свидетельствует о необходимости выделения групп пациенток, подлежащих дальнейшему тестированию на предмет НФ ВДКН. У всех 6 пациенток после стимуляции 5 мкг синактена максимальные уровни 17-ОНР составляли ≥6,7 нг/мл. У всех них имелись дерматологические признаки ГА (гирсутизм).

Из 27 больных с базальным или стимулированным уровнем 17-ОНР >10 нг/мл у 17 проведено МГИ гена CYP21. У пациенток с максимальным уровнем 17-ОНР >10 нг/мл, но <14 нг/мл выявлено исключительно гетерозиготное носительство наиболее частых мутаций гена CYP21. У больных с максимальным уровнем 17-ОНР≥14 нг/мл определены гомозиготные мутации или сочетание гетерозиготных мутаций.

Из 14 больных гирсутизмом и наивысшими максимальными уровнями 17-ОНР (4—6,2 нг/мл), у которых диагноз НФ ВДКН был маловероятным, у 10 методом аллель-специфической ПЦР и у 4 путем прямого секвенирования гена CYP21 диагноз дефицита 21-гидроксилазы был исключен.

Учитывая отсутствие значимого повышения 17-ОНР и результатов МГИ у 14 (43,8%) из 32 больных с наивысшими значениями стимулированного уровня 17-ОНР, 334 пациентки были исключены из дальнейшего исследования.

У 25 пациенток с гиперергическим ответом коры надпочечников на 1-24-АКТГ, несмотря на 3—4-кратное повышение уровня 17-ОНР, диагноз НФ ВДКН был исключен, так как не было зарегистрировано явного преимущества в секреции 17-ОНР и стимулированный уровень этого гормона не превысил 10 нг/мл. Стандартный тест с синактеном и молекулярно-генетическое исследование гена CYP21 проведены у 4 больных — мутации не выявлены.

У 21 пациентки с нормергическим и дозонезависимым ответом коры надпочечников на 5 мкг синактена наиболее частых мутаций гена CYP21 не было выявлено. Среди них были 13 больных с максимальным уровнем 17-ОНР >6,7 нг/мл. Но диагноз НФ ВДКН в этих случаях ни в процессе проведения стандартного теста, ни путем МГИ гена CYP21 методом аллель-специфической ПЦР подтвержден не был.

Гомозиготные мутации гена CYP21 выявлены только у 3 из 6 пациенток с нормергическим дозозависимым ответом на 5 и 250 мкг синактена. Диагноз НФ ВДКН подтвержден только у больных с максимальным уровнем 17-ОНР ≥6,7 нг/мл после стимуляции 5 мкг синактена и выше 14 нг/мл после стимуляции 250 мкг синактена. Из этих 3 больных у 1 была обнаружена гомозиготная мутация V281L [12], еще у 1 — V237E/V237E.

У 1 из 3 больных с максимальным уровнем 17-ОНР>14 нг/мл часто встречающихся мутаций гена не было обнаружено. При типировании химерного гена с праймерами [6] не был детектирован нормальный ген, а определялся только химерный ген (см. рисунок).

Рисунок 1. Схема образования химерного гена CYP21P/CYP21 при делеции 30 т.п.н.
Обычно место соединения псевдогена и функционирующего гена (5`CYP21P/3`CYP21) находится после третьего экзона, и пациенты с гомозиготным химерным геном имеют классическую форму ВДКН. В 2000 г. D. L’Allemand и соавт. [13] описали случай НФ ВДКН у пациента с гомозиготным химерным геном. Было показано, что один из аллелей химерного гена имел место соединения псевдогена и функционирующего гена в интроне 2, содержал P30L (NC) мутацию в первом экзоне и CYP21P промотор (NC), активность которого была в 5 раз ниже активности промотора CYP21.

Возможно, пациентка является носителем химерного гена с местом соединения псевдогена и функционирующего гена в начале экзона 1, и таким образом лишь промотор этого химерного гена соответствует псевдогену. Второй возможный вариант — наличие редкого полиморфизма в месте отжига праймера специфичного для CYP21, что приводит к детекции только химерного гена у гетерозиготных носителей. При этом нормальный ген пациентки не имеет частых мутаций, а в основе патологии стероидогенеза лежит более редкая мутация.

У 3 пациенток с максимальным уровнем 17-ОНР после стимуляции 5 мкг синактена не выше 6,0 нг/мл, а 250 мкг синактена — не выше 10 нг/мл диагностировано гетерозиготное носительство мутаций V281L (табл. 5).

Для выявления пациенток, подлежащих обследованию на дефицит 21-гидроксилазы, произведен расчет чувствительности и специфичности основных симптомов ГА (гирсутизма, ановуляции) в диагностике НФ ВДКН (табл. 6).

Основной жалобой пациенток с НФ ВДКН является гирсутизм. Наличие регулярного овуляторного менструального цикла не исключает диагноз НФ ВДКН.

В нашем исследовании оценка чувствительности и специфичности низкодозового теста с 5 мкг 1-24-АКТГ базировалась на данных обследования 36 пациенток, которым для диагностики дефицита 21-гидроксилазы были проведены оба теста с синактеном, а также МГИ гена CYP21. Учитывались данные пациентов, имеющих повышение уровня 17-ОНР >14 нг/мл и гомозиготные, либо сочетание гетерозиготных мутаций CYP21. Данные пациенток с гетерозиготными мутациями и уровнем 17-ОНР >10 нг/мл, но <14 нг/мл в расчет не принимались. Таким образом, из 48 больных исключены 10 с гетерозиготными мутациями и 2 с дозонезависимой реакцией и max 17-ОНР>17 нг/мл, у которых не выявлено мутаций гена CYP21 методом ПЦР (секвенирование не проводилось).

Чувствительность теста с 5 мкг синактена составила 72,7%, специфичность — 100%. Прогностическая значимость положительного результата исследования (+PV) составила 100%, прогностическая значимость отрицательного результата (–PV) — 89,3%.

Результаты стимуляционного теста с 5 мкг синактена позволяют считать, что для диагностики дефицита 21-гидроксилазы следует руководствоваться в большей мере абсолютными уровнями 17-ОНР, нежели кратностью их повышения в ответ на нагрузку АКТГ. У 12,5% больных ответ на синактен может иметь дозозависимый характер, у них регистрируется значительно больший пиковый уровень 17-ОНР на нагрузку 250 мкг синактена. Возможно, недостаток стимуляции малой дозой 1-24-АКТГ объясняется адаптацией ткани гиперплазированного надпочечника к стимулу со стороны гипофиза.

Диагноз НФ ВДКН (дефицит 21-гидроксилазы) был установлен всего у 23 (5,3%) из 435 больных, обратившихся к специалистам в связи с наличием гирсутизма и/или ановуляторной дисфункции яичников. При этом дефицит 21-гидроксилазы верифицирован у 20 (8,5%) из 234 больных, имеющих симптомы и/или гормональные признаки ГА, и у 3 (1,5%) из 201 — без ГА.

Заключение

Низкодозовый тест с 5 мкг синактена позволяет верифицировать дефицит 21-гидроксилазы у больных с максимальным уровнем 17-ОНР >14 нг/мл. Проведение стандартного теста с 250 мкг синактена и МГИ гена CYP21 показано больным, имеющим дерматологические признаки ГА и максимальный уровень 17-ОНР≥6,7 нг/мл после стимуляции 5 мкг синактена. Клиническое значение мягкой неклассической формы ВДКН, которая не выявляется в тесте с 5 мкг синактена, но выявляется в стандартном тесте с 250 мкг, остается не вполне понятной. При этом под «мягкой формой» неклассической ВДКН подразумевается наличие у пациенток невыраженного гирсутизма (не более 8 баллов) при сохраненном овуляторном менструальном цикле, т.е. присутствие симптомов, которые пациентки вряд ли склонны корректировать длительным применением глюкокортикоидов. Как известно, у существенной части женщин с гетерозиготным носительством мутаций в гене CYP21 также отсутствуют какие-либо клинические проявления и не снижена фертильность. В связи с этим перспективным представляется изучение клинического значения ситуаций с различающимися результатами тестов с разными дозами синтактена.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.Б. Чагай, В.В. Фадеев

Сбор и обработка материала — Н.Б. Чагай, С.А. Прокофьев, О.Н. Иванова, Н.Б. Смирнова, Т.М. Атаманова, Ю.В. Тишина

Статистическая обработка данных — Н.Б. Чагай

Написание текста — Н.Б. Чагай

Редактирование — В.В. Фадеев, С.А. Прокофьев, О.Н. Иванова

Конфликт интересов и финансовая заинтересованность авторов отсутствуют.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail