Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) — группа заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования, в основе которых лежит дефект одного из ферментов или транспортных белков, принимающих участие в биосинтезе кортизола в коре надпочечников. В настоящее время выделяют 6 форм заболевания: наиболее частой является дефицит 21-гидроксилазы, составляющий более 90% всех случаев ВДКН. Средняя распространенность дефицита 21-гидроксилазы (p450c21) составляет 1 на 10 000—15 000 новорожденных [1, 2]; в российской популяции эта величина равна 1:8000 новорожденных. Дефицит p450c21 приводит к нарушению трансформации 17-гидроксипрогестерона (17-ОНП) и прогестерона и, соответственно, к недостаточности продукции глюкокортикоидов и минералокортикоидов с накоплением продуктов биосинтеза стероидов, образующихся проксимальнее места блока. Дефицит минералокортикоидов приводит к жизнеугрожающему состоянию — сольтеряющему кризу, клиническими проявлениями которого являются гипотония, рвота, дегидратация, гиперкалиемия и гипонатриемия. Дефицит кортизола является причиной гипогликемий, а также (через активацию секреции АКТГ) приводит к гиперплазии коры надпочечников и, таким образом, избыточной продукции андрогенов, являющейся причиной внутриутробной и постнатальной вирилизации у девочек и преждевременного полового развития у мальчиков. Поздняя диагностика, несвоевременная и некорректная терапия заболевания могут приводить к тяжелым последствиям: гибели ребенка от сольтеряющего криза, ошибке при выборе принадлежности к женскому/мужскому полу.

Маркером дефицита 21-гидроксилазы является повышение уровня 17-ОНП в сыворотке крови. Высокая распространенность дефицита р450с21 и необходимость ранней и точной диагностики ВДКН у новорожденных, с одной стороны, и разработка простого метода определения 17-ОНП из пятна крови на фильтровальной бумаге — с другой, позволили внедрить диагностику дефицита 21-гидроксилазы в программу неонатального скрининга [1, 3]. С июня 2006 г. скрининг на ВДКН повсеместно внедрен и в России. Однако основной проблемой неонатального скрининга на ВДКН во всем мире является высокая частота ложноположительных результатов, особенно у недоношенных детей. Среди основных причин ложного повышения 17-ОНП выделяют физиологические особенности обменных процессов в организме новорожденного и технические особенности используемых методов иммуноанализа [4—10]. В связи с этим продолжается поиск новых методов определения 17-ОНП, позволяющих снизить число ложноположительных результатов. Одним из таких современных методов является метод тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Данные зарубежной литературы [6, 11—17] доказывают преимущества этого метода по сравнению с традиционно используемыми методами определения стероидов в сыворотке крови. В отечественной литературе такие данные отсутствуют.

В настоящей работе при обследовании новорожденных с положительными результатами скрининга на дефицит р450с21 нами сопоставлены результаты определения 17-ОНП иммуноферментным методом и методом тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Группа новорожденных была направлена на дообследование в связи с обнаружением повышенного уровня 17-ОНП при первичном тестировании и/или ретестировании в ходе скрининга на ВДКН.

Общая характеристика клинических наблюдений

Настоящее ретроспективное исследование основано на анализе результатов измерения 17-ОНП иммуноферментным анализом (ИФА) и методом тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS) у 50 детей, у которых в ходе скрининга на ВДКН (при первичном тестировании и ретестировании) были выявлены повышенные значения 17-ОНП. У 9 детей из обследуемой группы, наряду с повышенными значениями 17-ОНП, имелись клинические признаки дефицита 21-гидроксилазы и/или мутации в гене CYP21A2, что позволило нам диагностировать ВДКН. У 41 ребенка с повышенным уровнем 17-ОНП отсутствовали клинические проявления ВДКН и мутации в гене CYP21A2, и они составили основную группу наблюдения. В этой группе возраст обследуемых колебался от 7 дней до 1,5 мес.

В нее входили: 21 доношенный ребенок (срок гестации >37 нед и масса тела > 2000 г) и 20 недоношенных новорожденных [срок гестации <37 нед и масса тела >2000 г (18); срок гестации <37 нед и масса тела <2000 г (2)]. Среди доношенных новорожденных были 12 девочек и 9 мальчиков, среди недоношенных — 7 девочек и 13 мальчиков.

Количественное определение 17-гидроксипрогестерона лабораторными методами

У всех пациентов 17-ОНП определяли методом ИФА (с использованием наборов IMMUNOTECH) и методом тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Нами разработана оригинальная технология определения стероидных гормонов в сыворотке с использованием тандемного масс-спектрометра Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS, с помощью которого имелась возможность определять в одной пробе 11 стероидных гормонов одновременно (11-ДОК, ДГЭА, 11-дезоксикортизол, 21-дезоксикортизол, 17-ОН-прегненолон, 17-ОН-прогестерон, андростендион, кортизол, кортикостерон, прогестерон, тестостерон). Система ЖХ-МС состояла из градиентного насоса Agilent 1200 с дегазатором, изократического насоса Agilent 1200 и тандемного масс-спектрометра Agilent 6410, сопряженного с APPI (источником фотоионизации при атмосферном давлении). В качестве внутреннего стандарта использовался 17-гидроксипрогестерон-2,2,4,6,6,21,21,21-d8. Уровень 17-ОНП оценивался с учетом нормативных значений для каждого метода.

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка материала осуществлялась с помощью пакета прикладных программ Биостат («Практика», 1999) и Statistica_8_Portable.

Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Среди «клинически здоровых» новорожденных (41 человек — основная группа) медиана значений 17-ОНП, измеренных методом ИФА, составила 82 нмоль/л (16,7—356 нмоль/л), что более чем в 10 раз превышает референсные значения используемых наборов; при этом медиана значений 17-ОНП, по данным мультистероидного анализа, составила 3,1 нмоль/л (0,2—16,22 нмоль/л), что укладывается в референсный интервал для 17-ОНП, измеряемого этим методом. Учитывая отсутствие клинических признаков заболевания, несмотря на значительное повышение 17-ОНП, все пациенты оставались под динамическим наблюдением без терапии. Контрольное обследование через 3—6 мес выявило нормализацию уровня 17-ОНП у всех пациентов, что позволило нам исключить ВДКН и расценить подъем 17-ОНП при первичном скрининге и/или ретестировании как ложноположительные результаты. По данным, полученным методом LC-MS/MS, уровень 17-ОНП выше нормы наблюдался у 6 (14,6%) новорожденных мальчиков, причем такие же результаты были и при проведении ИФА. Медиана значений 17-ОНП, превышающих норму, по методу LC-MS/MS составила 13,195 нмоль/л (9,71—16,22 нмоль/л), что лишь в 1,5 раза выше нормы и меньше относительно значений, полученных методом ИФА. Дальнейшее наблюдение и повторное исследование 17-ОНП у этих пациентов также подтвердило отсутствие у них ВДКН. Таким образом, такое незначительное превышение уровня 17-ОНП, определяемого методом LC-MS/MS, является диагностически незначимым и, возможно, свидетельствует о необходимости пересмотра нормативных значений для данной возрастной группы в сторону их повышения.

Сравнительный анализ уровней 17-ОНП, исследованных методом ИФА и LC-MS/MS у 9 детей с подтвержденной ВДКН и в группе «клинически здоровых» новорожденных, показал, что диагностически значимым повышением 17-ОНП для классических форм ВДКН является превышение нормативных значений более чем в 10—20 раз как по методу ИФА, так и по методу LC-MS/MS. Так, у 9 пациентов с клинически и генетически подтвержденным диагнозом дефицита 21-гидроксилазы медиана значений 17-ОНП по данным ИФА составила 517 нмоль/л (230—1203,1 нмоль/л), а по данным LC-MS/MS — 559,93 нмоль/л (286,47—1423,7 нмоль/л). Отсутствие значимых различий в повышении уровня 17-ОНП, определяемого методом ИФА у «больных» и «здоровых» детей, еще раз подтверждает высокую частоту ложноположительных результатов при использовании ИФА.

При наличии дефицита 21-гидроксилазы, наряду с повышением уровня 17-ОНП, наблюдается повышение и других маркеров заболевания: 21-ДОК и андростендиона, что отсутствует у здоровых детей с умеренно повышенным 17-ОНП. Возможность одномоментного исследования этих показателей при использовании LC-MS/MS является еще одним его важным преимуществом перед ИФА. Так, медиана показателя 21-ДОК в группе здоровых детей составила 0,87 ммоль/л (0,1—23,7 ммоль/л), тогда как у детей с доказанной ВДКН этот показатель оказался равным 103,3 (1—167,47) (р=0,001). При расчете коэффициента 17-ОНП+андростендион/кортизол получены следующие результаты: в группе здоровых детей медиана коэффициента составила 0,08 (0,0015—1,1), тогда как в группе больных детей (с доказанной ВДКН) этот показатель был равен 82 (16,7—352), что достоверно выше, чем у детей без данного заболевания (р=0,001). Таким образом, при выявлении незначительно повышенных значений 17-ОНП по данным LC-MS/MS в сочетании с отсутствием повышения 21-ДОК и/или андростендиона и низком коэффициенте 17-ОНП+андростендион/кортизол позволяет исключить диагноз ВДКН, что невозможно при стандартном исследовании 17-ОНП путем ИФА.

С целью выявления связи между уровнями 17-ОНП, измеренными методами ИФА и LC-MS/MS, мы использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r_s): полученное значение показателя, равное 0,291, говорит о слабой корреляции уровней 17-ОНП, измеряемых двумя методами (р=0,053) (см. рисунок).

Для сравнения двух методов определения 17-ОНП в сыворотке вычислялись показатели чувствительности, точности, специфичности и прогностической ценности обоих методов (см. таблицу).

При выборе пороговых значений 17-ОНП играет роль гестационный возраст, а в ряде стран, включая Россию, и массу тела новорожденного. При выборе порога повышения 17-ОНП при проведении скрининга для доношенных и недоношенных детей в России были приняты следующие критерии: доношенным новорожденным считать ребенка с гестационным возрастом >37 нед и массой тела >2000 г, а недоношенным — ребенка со сроком гестации <37 нед и массой тела <2000 г. В нашем исследовании при сравнении уровней 17-ОНП по критерию Манна—Уитни (T) в группе доношенных (21 человек) и недоношенных детей (20 человек, из которых пациентов со сроком гестации <37 нед и массой тела <2000 г — 2, сроком гестации <37 нед и массой тела >2000 г — 18) оказалось, что по методу LC—MS/MS значения 17-ОНП достоверно выше у недоношенных новорожденных по сравнению с доношенными [6 нмоль/л (0,96—16,22 нмоль/л) против 2,44 нмоль/л (0,2—15 нмоль/л); р=0,05]. При сравнении показателей 17-ОНП в 3 группах новорожденных с различными сроками гестации (32—35 нед, 36—37 нед и 38 нед и более) с использованием критерия Крускалла—Уоллиса (H) отмечалась та же зависимость: по данным метода LC-MS/MS, уровень 17-ОНП тем больше, чем меньше гестационный возраст (Н=6,496; р=0,039).

Как уже отмечалось, другим критерием определения референсного значения 17-ОНП в России является масса тела новорожденного. Так, при массе тела >2000 г, независимо от срока гестации, уровень 17-ОНП определяется как для доношенного ребенка. Однако в ряде зарубежных работ показано отсутствие прямой зависимости между массой тела ребенка и степенью его зрелости при рождении. Поэтому с целью уточнения информативности и диагностической значимости массы тела новорожденного для определения верхнего порога 17-ОНП нами была проанализирована зависимость значений 17-ОНП от массы тела у новорожденных со сроком гестации <37 нед. Нами были обследованы 2 недоношенных ребенка со сроком гестации <37 нед и массой тела <2000 г и 18 детей со сроком гестации <37 нед и массой тела >2000 г. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r_s) показал, что уровень 17-ОНП не коррелирует с массой тела новорожденного как по данным мультистероидного анализа (r_s= 0,069, р=0,767), так и по данным ИФА (r_s=0,128, р=0,586). При сравнении показателя 17-ОНП в двух группах недоношенных детей (с массой тела от 1500 до 2500 г и > 2500 г) уровень 17-ОНП статистически значимо не различался как по данным ИФА, так и по данным LC-MS/MS (р=0,169 и р=0,374 соответственно). Таким образом, использование массы тела новорожденного при выборе референсных значений 17-ОНП может увеличивать число ложноположительных результатов.

Учитывая разную активность стероидогенеза у мальчиков и девочек в период новорожденности, мы сравнили уровни 17-ОНП у доношенных (12 девочек и 9 мальчиков) и недоношенных новорожденных (7 девочек и 13 мальчиков) в зависимости от пола с использованием критерия Манна—Уитни (T). У доношенных новорожденных, по данным LC-MS/MS, уровень 17-ОНП был значимо выше у мальчиков [5,2 нмоль/л (0,98—15], чем у девочек [1,44 нмоль/л (0,2—4,85)] (Т=135,0; р=0,012). При сравнении уровней 17-ОНП, определяемых методом ИФА, имелась тенденция к более высоким показателям у девочек по сравнению с мальчиками [63 нмоль/л (21—356 нмоль/л против 56 нмоль/л (16,7—152 нмоль/л)], однако эта разница оказалась статистически незначимой (Т=95,0; р=0,803). У недоношенных новорожденных статистически значимые различия в уровне 17-ОНП, по данным обоих методов, в зависимости от половой принадлежности отсутствовали: Т=66,0; р=0,605 по данным LC-MS/MS и Т-61; р=0,360 по данным ИФА. Интересно, что все 6 пациентов, у которых выявлен повышенный уровень 17-ОНП, измеренный методом LС-MS/MS, оказались мальчиками, что, возможно, свидетельствует о необходимости проведения дополнительных исследований с целью пересмотра нормативных значений для метода LC-MS/MS у новорожденных в зависимости от пола.

Методы определения стероидов в сыворотке играют значимую роль в диагностике различных эндокринных заболеваний [18, 19]. Увеличение числа нозологических форм последних и возрастающая потребность в их ранней и точной диагностике диктуют необходимость совершенствования методов определения стероидов в крови. Клинически значимые эндогенные стероиды, в том числе 17-ОНП — маркер дефицита 21-гидроксилазы — могут определяться рядом методов, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию с УФ-детекцией, газожидкостную хроматографию и различные варианты иммуноанализа [1, 16, 20]. До сих пор для определения стероидов чаще всего используются методы иммуноанализа. Преимуществами этих методов считается их простота, высокая скорость и чувствительность. Однако было показано, что точность и надежность результатов недостаточна для диагностики заболеваний у новорожденных и грудных детей [20]. Низкая специфичность обусловлена необходимостью стандартизации, использованием средних и больших объемов образцов для экстракции стероидов [21], а также влиянием других эндогенных стероидов, липидов, перекрестных реакций антител, эффектами матрикса и т.д., что приводит к возрастанию числа ложноположительных результатов и, таким образом, гипердиагностике заболевания [2, 4—7, 9]. При исследовании 17-OHП методом ИФА перекрестно определяется 17-гидроксипрегненолон, который часто повышен у новорожденных из-за сниженной активности 3β-гидроксистероиддегидрогеназы. Перекрестная реакция 17-гидроксипрегненолона (17-OHPr) и 17-OHП составляет около 8% в зависимости от метода исследования и используемых антител [22, 23]. Выявление ложноповышенного уровня 17-OHП может быть обусловлено и физиологическим снижением активности 11β-гидроксилазы у недоношенных или незрелых детей [11]. Другими факторами, обусловливающими ложное повышение 17-ОНП, могут быть сопутствующие заболевания, стресс, тяжелые роды, затяжная желтуха и др. [8]. Попытки повышения порогового значения по гестационному возрасту, массе тела новорожденного, а также предварительная экстракция 17-OHП не привели к значимому снижению числа ложноположительных результатов [4, 8]. Несмотря на доказанную актуальность ранней диагностики ВДКН с помощью ИФА и внедрение с этой целью массового неонатального скрининга, большое число ложноположительных результатов заставляет искать пути оптимизации диагностики ВДКН, в том числе и новых методов, обладающих большей специфичностью и дающих возможность использовать их в масштабах неонатального скрининга. Одним из таких новых методов, позволяющих избежать недостатков традиционного определения 17-ОНП методом ИФА, является метод тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Этот метод стал использоваться для скрининга наследственных патологий у новорожденных, начиная с 1993 г. [11, 24], и интенсивно развивается в последние 5—8 лет, приобретая все большую значимость в качестве мощного аналитического инструмента в клинических лабораториях. Метод LC-MS/MS имеет ряд преимуществ: он является самым надежным методом определения молекул с невысокой молекулярной массой [17], обладает способностью количественно оценивать содержание ряда разнородных соединений в ходе одного анализа и с использованием единого внутреннего стандарта, применяемого одновременно для нескольких определяемых стероидов [12, 25]. В отличие, например, от метода газожидкостной хроматографии, LС-MS/MS не требует больших временных затрат для подготовки образцов. Наконец, по специфичности этот метод не уступает другим методам определения стероидов, но позволяет использовать малые объемы, что является большим преимуществом для диагностики заболеваний у новорожденных и детей грудного возраста [16]. Благодаря вышеперечисленным характеристикам применение метода LC-MS/MS существенно снижает число ложноположительных результатов, получаемых при скрининге ВДКН, что позволяет использовать его как приоритетный для диагностики этого заболевания, особенно в сомнительных случаях [6, 11, 12, 14—17, 24, 26, 28—30].

Проведенное исследование показало, что у 73% клинически здоровых детей определяется повышенный уровень 17-ОНП, тогда как методом LS-MS/MS — у 14,6%, причем средний уровень 17-ОНП по данным ИФА значительно выше, чем по данным метода LС-MS/MS. Это совпадает с результатами исследования N. Janzen и соавт. [13]. У 41 ребенка основной группы с возрастом уровень 17-ОНП нормализовался, что совпадает с данными, полученными J. Lee и соавт. [31] (нормализация уровня 17-ОНП у 73,6% детей через 1—5 мес). Авторы объясняют это более поздним созреванием ферментных систем у таких детей. Рассчитанный нами коэффициент корреляции Спирмена продемонстрировал наличие слабой корреляции между уровнями 17-ОНП, измеренными методами ИФА и LС-MS/MS. Такие же данные приводятся группой авторов из Германии [6]. Большой процент ложноположительных результатов при использовании метода ИФА подчеркивает необходимость разработки нормативных значений для 17-ОНП, особенно для новорожденных и грудных детей. До настоящего момента уровни 17-ОНП для этой группы детей варьируют в больших пределах.

Анализ уровней 17-ОНП в зависимости от гестационного возраста новорожденных показал, что уровень 17-ОНП тем выше, чем меньше срок гестации, причем статистически значимая связь выявлена при использовании метода LС-MS/MS. Такие же данные были получены E. Schwarz и соавт. [29]. Как показало наше исследование, данная тенденция сохраняется даже при использовании различных критериев деления новорожденных на группы в зависимости от гестационного возраста.

Проанализировав зависимость уровня 17-ОНП у детей с разной массой тела при рождении, мы нашли, что масса тела новорожденного при выборе референсных значений для 17-ОНП значимой роли не играет. Результаты, полученные в 2008 г. J. Lee и соавт. [31], также говорят об отсутствии зависимости уровней 17-ОНП у новорожденных массой 1,5—2,5 и 1,0—1,49 кг. Однако у новорожденных массой <1 кг уровень 17-ОНП был статистически значимо выше, чем у других групп. В то же время данные E. Schwarz и соавт. [29] свидетельствуют о наличии такой зависимости, что диктует необходимость дальнейшего изучения параметра массы тела как одного из критериев определения верхней границы нормы 17-ОНП. По нашим данным, именно гестационный возраст ребенка является определяющим при выборе верхнего порога уровня 17-ОНП при скрининге, а масса тела не является диагностически значимой, что совпадает с данными, полученными зарубежными авторами [31—33].

Хотя анализ зависимости уровней 17-ОНП от пола ребенка показал, что у доношенных новорожденных, по данным мультистероидного анализа, уровень 17-ОНП достоверно выше у мальчиков. Результаты других работ говорят об отсутствии различий уровней 17-ОНП у детей разного пола [28, 31, 34].

Таким образом, впервые в отечественной литературе нами проведен сравнительный анализ методов ИФА и LC-MS/MS, применяемых для диагностики дефицита 21-гидроксилазы. Полученные данные показывают, что приоритетным методом для диагностики ВДКН у новорожденных и детей грудного возраста является метод LC-MS/MS, позволяющий свести к минимуму число ложноположительных результатов при скрининге на ВДКН.

1. При дообследовании новорожденных детей, особенно с сомнительными результатами ретестирования, не позволяющими исключить ВДКН, методом выбора является метод LC-MS/MS, что делает возможным применение этого метода для скрининга новорожденных на ВДКН, сводя к минимуму число ложноположительных результатов.

2. Отсутствие клинических проявлений дефицита 21-гидроксилазы, даже при наличии высокого уровня 17-ОНП по данным ИФА, но при нормальных или незначительно повышенных уровнях 17-ОНП по данным LC-MS/MS в сочетании с отсутствием повышения 21-ДОК и низким коэффициентом 17-ОНП+андростендион/кортизол позволяет исключить диагноз ВДКН.

3. Гестационный возраст ребенка является определяющим при выборе верхнего порога уровня 17-ОНП при скрининге.

4. Использование критерия массы тела ребенка в качестве показателя доношенности может приводить к увеличению числа ложноположительных результатов, т.е. к гипердиагностике ВДКН.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.Ю. Калинченко, А.Н. Тюльпаков, А.Н. Нижник

Сбор и обработка материала — Т.А. Ионова, Н.Ю. Калинченко

Статистическая обработка данных — Т.А. Ионова

Написание текста — Т.А. Ионова, Н.Ю. Калинченко

Редактирование — Н.Ю. Калинченко, А.Н. Тюльпаков, А.Н. Нижник