Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Ионова Т.А.

ФГБУ "Эндокринологический научный центр" МЗ РФ, Москва

Калинченко Н.Ю.

Эндокринологический научный центр, Москва

Тюльпаков А.Н.

Эндокринологический научный центр, Москва

Нижник А.Н.

ФГУ ЭНЦ

Сравнительный анализ эффективности методов иммуноанализа и тандемной масс-спектрометрии при ретестировании детей с подозрением на врожденную дисфункцию коры надпочечников

Авторы:

Ионова Т.А., Калинченко Н.Ю., Тюльпаков А.Н., Нижник А.Н.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2013;59(2): 12‑18

Просмотров : 336

Загрузок: 6

Как цитировать:

Ионова Т.А., Калинченко Н.Ю., Тюльпаков А.Н., Нижник А.Н. Сравнительный анализ эффективности методов иммуноанализа и тандемной масс-спектрометрии при ретестировании детей с подозрением на врожденную дисфункцию коры надпочечников. Проблемы эндокринологии. 2013;59(2):12‑18.
Ionova TA, Kalinchenko NIu, Tiul'pakov AN, Nizhnik AN. The comparative assessment of the effectiveness of immunoanalysis and tandem mass spectrometry applied for re-testing the children with suspected congenital adrenal cortical hyperplasia. Problemy Endokrinologii. 2013;59(2):12‑18. (In Russ.).

Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) — группа заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования, в основе которых лежит дефект одного из ферментов или транспортных белков, принимающих участие в биосинтезе кортизола в коре надпочечников. В настоящее время выделяют 6 форм заболевания: наиболее частой является дефицит 21-гидроксилазы, составляющий более 90% всех случаев ВДКН. Средняя распространенность дефицита 21-гидроксилазы (p450c21) составляет 1 на 10 000—15 000 новорожденных [1, 2]; в российской популяции эта величина равна 1:8000 новорожденных. Дефицит p450c21 приводит к нарушению трансформации 17-гидроксипрогестерона (17-ОНП) и прогестерона и, соответственно, к недостаточности продукции глюкокортикоидов и минералокортикоидов с накоплением продуктов биосинтеза стероидов, образующихся проксимальнее места блока. Дефицит минералокортикоидов приводит к жизнеугрожающему состоянию — сольтеряющему кризу, клиническими проявлениями которого являются гипотония, рвота, дегидратация, гиперкалиемия и гипонатриемия. Дефицит кортизола является причиной гипогликемий, а также (через активацию секреции АКТГ) приводит к гиперплазии коры надпочечников и, таким образом, избыточной продукции андрогенов, являющейся причиной внутриутробной и постнатальной вирилизации у девочек и преждевременного полового развития у мальчиков. Поздняя диагностика, несвоевременная и некорректная терапия заболевания могут приводить к тяжелым последствиям: гибели ребенка от сольтеряющего криза, ошибке при выборе принадлежности к женскому/мужскому полу.

Маркером дефицита 21-гидроксилазы является повышение уровня 17-ОНП в сыворотке крови. Высокая распространенность дефицита р450с21 и необходимость ранней и точной диагностики ВДКН у новорожденных, с одной стороны, и разработка простого метода определения 17-ОНП из пятна крови на фильтровальной бумаге — с другой, позволили внедрить диагностику дефицита 21-гидроксилазы в программу неонатального скрининга [1, 3]. С июня 2006 г. скрининг на ВДКН повсеместно внедрен и в России. Однако основной проблемой неонатального скрининга на ВДКН во всем мире является высокая частота ложноположительных результатов, особенно у недоношенных детей. Среди основных причин ложного повышения 17-ОНП выделяют физиологические особенности обменных процессов в организме новорожденного и технические особенности используемых методов иммуноанализа [4—10]. В связи с этим продолжается поиск новых методов определения 17-ОНП, позволяющих снизить число ложноположительных результатов. Одним из таких современных методов является метод тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Данные зарубежной литературы [6, 11—17] доказывают преимущества этого метода по сравнению с традиционно используемыми методами определения стероидов в сыворотке крови. В отечественной литературе такие данные отсутствуют.

В настоящей работе при обследовании новорожденных с положительными результатами скрининга на дефицит р450с21 нами сопоставлены результаты определения 17-ОНП иммуноферментным методом и методом тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Группа новорожденных была направлена на дообследование в связи с обнаружением повышенного уровня 17-ОНП при первичном тестировании и/или ретестировании в ходе скрининга на ВДКН.

Материал и методы

Общая характеристика клинических наблюдений

Настоящее ретроспективное исследование основано на анализе результатов измерения 17-ОНП иммуноферментным анализом (ИФА) и методом тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS) у 50 детей, у которых в ходе скрининга на ВДКН (при первичном тестировании и ретестировании) были выявлены повышенные значения 17-ОНП. У 9 детей из обследуемой группы, наряду с повышенными значениями 17-ОНП, имелись клинические признаки дефицита 21-гидроксилазы и/или мутации в гене CYP21A2, что позволило нам диагностировать ВДКН. У 41 ребенка с повышенным уровнем 17-ОНП отсутствовали клинические проявления ВДКН и мутации в гене CYP21A2, и они составили основную группу наблюдения. В этой группе возраст обследуемых колебался от 7 дней до 1,5 мес.

В нее входили: 21 доношенный ребенок (срок гестации >37 нед и масса тела > 2000 г) и 20 недоношенных новорожденных [срок гестации <37 нед и масса тела >2000 г (18); срок гестации <37 нед и масса тела <2000 г (2)]. Среди доношенных новорожденных были 12 девочек и 9 мальчиков, среди недоношенных — 7 девочек и 13 мальчиков.

Количественное определение 17-гидроксипрогестерона лабораторными методами

У всех пациентов 17-ОНП определяли методом ИФА (с использованием наборов IMMUNOTECH) и методом тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Нами разработана оригинальная технология определения стероидных гормонов в сыворотке с использованием тандемного масс-спектрометра Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS, с помощью которого имелась возможность определять в одной пробе 11 стероидных гормонов одновременно (11-ДОК, ДГЭА, 11-дезоксикортизол, 21-дезоксикортизол, 17-ОН-прегненолон, 17-ОН-прогестерон, андростендион, кортизол, кортикостерон, прогестерон, тестостерон). Система ЖХ-МС состояла из градиентного насоса Agilent 1200 с дегазатором, изократического насоса Agilent 1200 и тандемного масс-спектрометра Agilent 6410, сопряженного с APPI (источником фотоионизации при атмосферном давлении). В качестве внутреннего стандарта использовался 17-гидроксипрогестерон-2,2,4,6,6,21,21,21-d8. Уровень 17-ОНП оценивался с учетом нормативных значений для каждого метода.

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка материала осуществлялась с помощью пакета прикладных программ Биостат («Практика», 1999) и Statistica_8_Portable.

Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Среди «клинически здоровых» новорожденных (41 человек — основная группа) медиана значений 17-ОНП, измеренных методом ИФА, составила 82 нмоль/л (16,7—356 нмоль/л), что более чем в 10 раз превышает референсные значения используемых наборов; при этом медиана значений 17-ОНП, по данным мультистероидного анализа, составила 3,1 нмоль/л (0,2—16,22 нмоль/л), что укладывается в референсный интервал для 17-ОНП, измеряемого этим методом. Учитывая отсутствие клинических признаков заболевания, несмотря на значительное повышение 17-ОНП, все пациенты оставались под динамическим наблюдением без терапии. Контрольное обследование через 3—6 мес выявило нормализацию уровня 17-ОНП у всех пациентов, что позволило нам исключить ВДКН и расценить подъем 17-ОНП при первичном скрининге и/или ретестировании как ложноположительные результаты. По данным, полученным методом LC-MS/MS, уровень 17-ОНП выше нормы наблюдался у 6 (14,6%) новорожденных мальчиков, причем такие же результаты были и при проведении ИФА. Медиана значений 17-ОНП, превышающих норму, по методу LC-MS/MS составила 13,195 нмоль/л (9,71—16,22 нмоль/л), что лишь в 1,5 раза выше нормы и меньше относительно значений, полученных методом ИФА. Дальнейшее наблюдение и повторное исследование 17-ОНП у этих пациентов также подтвердило отсутствие у них ВДКН. Таким образом, такое незначительное превышение уровня 17-ОНП, определяемого методом LC-MS/MS, является диагностически незначимым и, возможно, свидетельствует о необходимости пересмотра нормативных значений для данной возрастной группы в сторону их повышения.

Сравнительный анализ уровней 17-ОНП, исследованных методом ИФА и LC-MS/MS у 9 детей с подтвержденной ВДКН и в группе «клинически здоровых» новорожденных, показал, что диагностически значимым повышением 17-ОНП для классических форм ВДКН является превышение нормативных значений более чем в 10—20 раз как по методу ИФА, так и по методу LC-MS/MS. Так, у 9 пациентов с клинически и генетически подтвержденным диагнозом дефицита 21-гидроксилазы медиана значений 17-ОНП по данным ИФА составила 517 нмоль/л (230—1203,1 нмоль/л), а по данным LC-MS/MS — 559,93 нмоль/л (286,47—1423,7 нмоль/л). Отсутствие значимых различий в повышении уровня 17-ОНП, определяемого методом ИФА у «больных» и «здоровых» детей, еще раз подтверждает высокую частоту ложноположительных результатов при использовании ИФА.

При наличии дефицита 21-гидроксилазы, наряду с повышением уровня 17-ОНП, наблюдается повышение и других маркеров заболевания: 21-ДОК и андростендиона, что отсутствует у здоровых детей с умеренно повышенным 17-ОНП. Возможность одномоментного исследования этих показателей при использовании LC-MS/MS является еще одним его важным преимуществом перед ИФА. Так, медиана показателя 21-ДОК в группе здоровых детей составила 0,87 ммоль/л (0,1—23,7 ммоль/л), тогда как у детей с доказанной ВДКН этот показатель оказался равным 103,3 (1—167,47) (р=0,001). При расчете коэффициента 17-ОНП+андростендион/кортизол получены следующие результаты: в группе здоровых детей медиана коэффициента составила 0,08 (0,0015—1,1), тогда как в группе больных детей (с доказанной ВДКН) этот показатель был равен 82 (16,7—352), что достоверно выше, чем у детей без данного заболевания (р=0,001). Таким образом, при выявлении незначительно повышенных значений 17-ОНП по данным LC-MS/MS в сочетании с отсутствием повышения 21-ДОК и/или андростендиона и низком коэффициенте 17-ОНП+андростендион/кортизол позволяет исключить диагноз ВДКН, что невозможно при стандартном исследовании 17-ОНП путем ИФА.

С целью выявления связи между уровнями 17-ОНП, измеренными методами ИФА и LC-MS/MS, мы использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs): полученное значение показателя, равное 0,291, говорит о слабой корреляции уровней 17-ОНП, измеряемых двумя методами (р=0,053) (см. рисунок).

Рисунок 1. Сравнение двух методов определения 17-ОНП (ИФА и LС-MS/MS) с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r=0,291; p=0,05).

Для сравнения двух методов определения 17-ОНП в сыворотке вычислялись показатели чувствительности, точности, специфичности и прогностической ценности обоих методов (см. таблицу).

Метод LC-MS/MS оказался более специфичным (87% против 26%), точным (89,6% против 37,5%) и прогностически более ценным при определении 17-ОНП для диагностики ВДКН у детей.

При выборе пороговых значений 17-ОНП играет роль гестационный возраст, а в ряде стран, включая Россию, и массу тела новорожденного. При выборе порога повышения 17-ОНП при проведении скрининга для доношенных и недоношенных детей в России были приняты следующие критерии: доношенным новорожденным считать ребенка с гестационным возрастом >37 нед и массой тела >2000 г, а недоношенным — ребенка со сроком гестации <37 нед и массой тела <2000 г. В нашем исследовании при сравнении уровней 17-ОНП по критерию Манна—Уитни (T) в группе доношенных (21 человек) и недоношенных детей (20 человек, из которых пациентов со сроком гестации <37 нед и массой тела <2000 г — 2, сроком гестации <37 нед и массой тела >2000 г — 18) оказалось, что по методу LC—MS/MS значения 17-ОНП достоверно выше у недоношенных новорожденных по сравнению с доношенными [6 нмоль/л (0,96—16,22 нмоль/л) против 2,44 нмоль/л (0,2—15 нмоль/л); р=0,05]. При сравнении показателей 17-ОНП в 3 группах новорожденных с различными сроками гестации (32—35 нед, 36—37 нед и 38 нед и более) с использованием критерия Крускалла—Уоллиса (H) отмечалась та же зависимость: по данным метода LC-MS/MS, уровень 17-ОНП тем больше, чем меньше гестационный возраст (Н=6,496; р=0,039).

Как уже отмечалось, другим критерием определения референсного значения 17-ОНП в России является масса тела новорожденного. Так, при массе тела >2000 г, независимо от срока гестации, уровень 17-ОНП определяется как для доношенного ребенка. Однако в ряде зарубежных работ показано отсутствие прямой зависимости между массой тела ребенка и степенью его зрелости при рождении. Поэтому с целью уточнения информативности и диагностической значимости массы тела новорожденного для определения верхнего порога 17-ОНП нами была проанализирована зависимость значений 17-ОНП от массы тела у новорожденных со сроком гестации <37 нед. Нами были обследованы 2 недоношенных ребенка со сроком гестации <37 нед и массой тела <2000 г и 18 детей со сроком гестации <37 нед и массой тела >2000 г. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs) показал, что уровень 17-ОНП не коррелирует с массой тела новорожденного как по данным мультистероидного анализа (rs= 0,069, р=0,767), так и по данным ИФА (rs=0,128, р=0,586). При сравнении показателя 17-ОНП в двух группах недоношенных детей (с массой тела от 1500 до 2500 г и > 2500 г) уровень 17-ОНП статистически значимо не различался как по данным ИФА, так и по данным LC-MS/MS (р=0,169 и р=0,374 соответственно). Таким образом, использование массы тела новорожденного при выборе референсных значений 17-ОНП может увеличивать число ложноположительных результатов.

Учитывая разную активность стероидогенеза у мальчиков и девочек в период новорожденности, мы сравнили уровни 17-ОНП у доношенных (12 девочек и 9 мальчиков) и недоношенных новорожденных (7 девочек и 13 мальчиков) в зависимости от пола с использованием критерия Манна—Уитни (T). У доношенных новорожденных, по данным LC-MS/MS, уровень 17-ОНП был значимо выше у мальчиков [5,2 нмоль/л (0,98—15], чем у девочек [1,44 нмоль/л (0,2—4,85)] (Т=135,0; р=0,012). При сравнении уровней 17-ОНП, определяемых методом ИФА, имелась тенденция к более высоким показателям у девочек по сравнению с мальчиками [63 нмоль/л (21—356 нмоль/л против 56 нмоль/л (16,7—152 нмоль/л)], однако эта разница оказалась статистически незначимой (Т=95,0; р=0,803). У недоношенных новорожденных статистически значимые различия в уровне 17-ОНП, по данным обоих методов, в зависимости от половой принадлежности отсутствовали: Т=66,0; р=0,605 по данным LC-MS/MS и Т-61; р=0,360 по данным ИФА. Интересно, что все 6 пациентов, у которых выявлен повышенный уровень 17-ОНП, измеренный методом LС-MS/MS, оказались мальчиками, что, возможно, свидетельствует о необходимости проведения дополнительных исследований с целью пересмотра нормативных значений для метода LC-MS/MS у новорожденных в зависимости от пола.

Методы определения стероидов в сыворотке играют значимую роль в диагностике различных эндокринных заболеваний [18, 19]. Увеличение числа нозологических форм последних и возрастающая потребность в их ранней и точной диагностике диктуют необходимость совершенствования методов определения стероидов в крови. Клинически значимые эндогенные стероиды, в том числе 17-ОНП — маркер дефицита 21-гидроксилазы — могут определяться рядом методов, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию с УФ-детекцией, газожидкостную хроматографию и различные варианты иммуноанализа [1, 16, 20]. До сих пор для определения стероидов чаще всего используются методы иммуноанализа. Преимуществами этих методов считается их простота, высокая скорость и чувствительность. Однако было показано, что точность и надежность результатов недостаточна для диагностики заболеваний у новорожденных и грудных детей [20]. Низкая специфичность обусловлена необходимостью стандартизации, использованием средних и больших объемов образцов для экстракции стероидов [21], а также влиянием других эндогенных стероидов, липидов, перекрестных реакций антител, эффектами матрикса и т.д., что приводит к возрастанию числа ложноположительных результатов и, таким образом, гипердиагностике заболевания [2, 4—7, 9]. При исследовании 17-OHП методом ИФА перекрестно определяется 17-гидроксипрегненолон, который часто повышен у новорожденных из-за сниженной активности 3β-гидроксистероиддегидрогеназы. Перекрестная реакция 17-гидроксипрегненолона (17-OHPr) и 17-OHП составляет около 8% в зависимости от метода исследования и используемых антител [22, 23]. Выявление ложноповышенного уровня 17-OHП может быть обусловлено и физиологическим снижением активности 11β-гидроксилазы у недоношенных или незрелых детей [11]. Другими факторами, обусловливающими ложное повышение 17-ОНП, могут быть сопутствующие заболевания, стресс, тяжелые роды, затяжная желтуха и др. [8]. Попытки повышения порогового значения по гестационному возрасту, массе тела новорожденного, а также предварительная экстракция 17-OHП не привели к значимому снижению числа ложноположительных результатов [4, 8]. Несмотря на доказанную актуальность ранней диагностики ВДКН с помощью ИФА и внедрение с этой целью массового неонатального скрининга, большое число ложноположительных результатов заставляет искать пути оптимизации диагностики ВДКН, в том числе и новых методов, обладающих большей специфичностью и дающих возможность использовать их в масштабах неонатального скрининга. Одним из таких новых методов, позволяющих избежать недостатков традиционного определения 17-ОНП методом ИФА, является метод тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Этот метод стал использоваться для скрининга наследственных патологий у новорожденных, начиная с 1993 г. [11, 24], и интенсивно развивается в последние 5—8 лет, приобретая все большую значимость в качестве мощного аналитического инструмента в клинических лабораториях. Метод LC-MS/MS имеет ряд преимуществ: он является самым надежным методом определения молекул с невысокой молекулярной массой [17], обладает способностью количественно оценивать содержание ряда разнородных соединений в ходе одного анализа и с использованием единого внутреннего стандарта, применяемого одновременно для нескольких определяемых стероидов [12, 25]. В отличие, например, от метода газожидкостной хроматографии, LС-MS/MS не требует больших временных затрат для подготовки образцов. Наконец, по специфичности этот метод не уступает другим методам определения стероидов, но позволяет использовать малые объемы, что является большим преимуществом для диагностики заболеваний у новорожденных и детей грудного возраста [16]. Благодаря вышеперечисленным характеристикам применение метода LC-MS/MS существенно снижает число ложноположительных результатов, получаемых при скрининге ВДКН, что позволяет использовать его как приоритетный для диагностики этого заболевания, особенно в сомнительных случаях [6, 11, 12, 14—17, 24, 26, 28—30].

Проведенное исследование показало, что у 73% клинически здоровых детей определяется повышенный уровень 17-ОНП, тогда как методом LS-MS/MS — у 14,6%, причем средний уровень 17-ОНП по данным ИФА значительно выше, чем по данным метода LС-MS/MS. Это совпадает с результатами исследования N. Janzen и соавт. [13]. У 41 ребенка основной группы с возрастом уровень 17-ОНП нормализовался, что совпадает с данными, полученными J. Lee и соавт. [31] (нормализация уровня 17-ОНП у 73,6% детей через 1—5 мес). Авторы объясняют это более поздним созреванием ферментных систем у таких детей. Рассчитанный нами коэффициент корреляции Спирмена продемонстрировал наличие слабой корреляции между уровнями 17-ОНП, измеренными методами ИФА и LС-MS/MS. Такие же данные приводятся группой авторов из Германии [6]. Большой процент ложноположительных результатов при использовании метода ИФА подчеркивает необходимость разработки нормативных значений для 17-ОНП, особенно для новорожденных и грудных детей. До настоящего момента уровни 17-ОНП для этой группы детей варьируют в больших пределах.

Анализ уровней 17-ОНП в зависимости от гестационного возраста новорожденных показал, что уровень 17-ОНП тем выше, чем меньше срок гестации, причем статистически значимая связь выявлена при использовании метода LС-MS/MS. Такие же данные были получены E. Schwarz и соавт. [29]. Как показало наше исследование, данная тенденция сохраняется даже при использовании различных критериев деления новорожденных на группы в зависимости от гестационного возраста.

Проанализировав зависимость уровня 17-ОНП у детей с разной массой тела при рождении, мы нашли, что масса тела новорожденного при выборе референсных значений для 17-ОНП значимой роли не играет. Результаты, полученные в 2008 г. J. Lee и соавт. [31], также говорят об отсутствии зависимости уровней 17-ОНП у новорожденных массой 1,5—2,5 и 1,0—1,49 кг. Однако у новорожденных массой <1 кг уровень 17-ОНП был статистически значимо выше, чем у других групп. В то же время данные E. Schwarz и соавт. [29] свидетельствуют о наличии такой зависимости, что диктует необходимость дальнейшего изучения параметра массы тела как одного из критериев определения верхней границы нормы 17-ОНП. По нашим данным, именно гестационный возраст ребенка является определяющим при выборе верхнего порога уровня 17-ОНП при скрининге, а масса тела не является диагностически значимой, что совпадает с данными, полученными зарубежными авторами [31—33].

Хотя анализ зависимости уровней 17-ОНП от пола ребенка показал, что у доношенных новорожденных, по данным мультистероидного анализа, уровень 17-ОНП достоверно выше у мальчиков. Результаты других работ говорят об отсутствии различий уровней 17-ОНП у детей разного пола [28, 31, 34].

Таким образом, впервые в отечественной литературе нами проведен сравнительный анализ методов ИФА и LC-MS/MS, применяемых для диагностики дефицита 21-гидроксилазы. Полученные данные показывают, что приоритетным методом для диагностики ВДКН у новорожденных и детей грудного возраста является метод LC-MS/MS, позволяющий свести к минимуму число ложноположительных результатов при скрининге на ВДКН.

Выводы

1. При дообследовании новорожденных детей, особенно с сомнительными результатами ретестирования, не позволяющими исключить ВДКН, методом выбора является метод LC-MS/MS, что делает возможным применение этого метода для скрининга новорожденных на ВДКН, сводя к минимуму число ложноположительных результатов.

2. Отсутствие клинических проявлений дефицита 21-гидроксилазы, даже при наличии высокого уровня 17-ОНП по данным ИФА, но при нормальных или незначительно повышенных уровнях 17-ОНП по данным LC-MS/MS в сочетании с отсутствием повышения 21-ДОК и низким коэффициентом 17-ОНП+андростендион/кортизол позволяет исключить диагноз ВДКН.

3. Гестационный возраст ребенка является определяющим при выборе верхнего порога уровня 17-ОНП при скрининге.

4. Использование критерия массы тела ребенка в качестве показателя доношенности может приводить к увеличению числа ложноположительных результатов, т.е. к гипердиагностике ВДКН.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.Ю. Калинченко, А.Н. Тюльпаков, А.Н. Нижник

Сбор и обработка материала — Т.А. Ионова, Н.Ю. Калинченко

Статистическая обработка данных — Т.А. Ионова

Написание текста — Т.А. Ионова, Н.Ю. Калинченко

Редактирование — Н.Ю. Калинченко, А.Н. Тюльпаков, А.Н. Нижник

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail