Наиболее частой причиной персистирующих гипогликемий у детей первого года жизни является врожденный гиперинсулинизм (ВГИ) [1]. Биохимически ВГИ характеризуется избыточной продукцией инсулина бета-клетками поджелудочной железы. Гиперсекреция инсулина усиливает утилизацию глюкозы клетками инсулинзависимых тканей и в то же время подавляет продукцию глюкозы, свободных жирных кислот и кетоновых тел. Подобные эффекты обусловливают лишение пациентов с ВГИ глюкозы и альтернативных источников энергии для головного мозга, увеличивая риск развития неврологических расстройств [2]. ВГИ — наследственное заболевание, гетерогенное в отношении как клинических проявлений и гистологических форм, так и молекулярно-генетических дефектов, лежащих в основе данной патологии. Частота встречаемости ВГИ составляет 1:30 000—1:50 000 в общей популяции и 1:2500 в «закрытых» популяциях с высоким процентом близкородственных браков [3].

Выраженность гипогликемического синдрома при ВГИ крайне вариабельна. Гипогликемии могут быть бессимптомными, иметь мягкое течение, хорошо поддающееся консервативной терапии диазоксидом и/или аналогами соматостатина. Однако в 40—50% случаев синдром протекает тяжело и его не удается купировать терапевтически, что требует незамедлительного оперативного лечения [4]. Как правило, ВГИ манифестирует в первые дни или недели жизни, однако возможен и более поздний дебют [5].

Выделяют три основные морфологические формы заболевания [6]:

— диффузную, когда поражен весь островковый аппарат поджелудочной железы (50—60% всех случаев ВГИ) [3];

— фокальную, при которой поражен отдельный участок ткани диаметром не более 15 мм (40—50% случаев). Формирование фокуса происходит при наследовании отцовской мутации генов KCNJ11 и ABCC8 и соматической потери гомозиготности [7]. Визуализировать фокус можно с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ с 18-F-Дофа) [8];

— атипичную (<5% случаев) — сочетание диффузной и фокальной форм [9].

При фармакорезистентности ВГИ рекомендуется субтотальная панкреатэктомия (при диффузных формах) или частичная резекция (при фокальных формах). Субтотальная панкреатэктомия часто приводит к развитию инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД), тогда как резекция фокуса заканчивается полным выздоровлением пациентов с сохранением нормальной активности инсулинового аппарата поджелудочной железы.

К настоящему времени описаны 9 генов, участвующих в развитии ВГИ. Большинство случаев (40—60%) связано с дефектами генов KCNJ11 и ABCC8 [10], кодирующих белки, участвующие в работе АТФ-зависимых калиевых каналов бета-клеток. Около 15—20% связано с активирующими мутациями в генах GCK и GLUD1, участвующих в регуляции внутриклеточного метаболизма глюкозы [11, 12]. В литературе также имеются единичные описания случаев ВГИ, связанных с дефектами генов HADH, HNF4α, INSR, UCP2, SLC16A1 [13—16]. В 30—40% случаев ВГИ не удается верифицировать его молекулярно-генетическую причину [17]. Существуют определенные ассоциации генотип—фенотип. Так, например, случаи ВГИ, связанные с мутациями в генах KCNJ11 и ABCC8, чаще протекают тяжело и плохо поддаются терапевтическому лечению [17]. Выявление у пациента отцовской гетерозиготной мутации в этих генах в отсутствие клинических проявлений ВГИ у отца свидетельствует о фокальной форме, что определяет тактику обследования пациентов и объем оперативного вмешательства в случае резистентности к терапии [7]. Пациенты с активирующими мутациями в гене GCK, как правило, чувствительны к консервативной терапии, однако у них повышен риск развития СД в зрелом возрасте [11]. При мутациях в гене GLUD1 гипогликемический синдром купируется посредством присоединения к основной терапии низкопротеиновой диеты; в таких случаях необходимо детальное неврологическое обследование из-за возможности развития эпилепсии [12]. Выяснение характера наследования мутации дает возможность полноценного генетического консультирования родственников пациента.

В статье представлены результаты клинического, гормонального, молекулярно-генетического и гистологического обследования 42 детей с ВГИ. На основании полученных результатов представлены взаимосвязи генотип—фенотип.

Набор пациентов проводился на базах нескольких детских клиник Москвы: Морозовской ДГКБ, Тушинской ДГКБ, Российской детской клинической больницы, Института детской эндокринологии ФГБУ ЭНЦ. Критерием включения в исследование было наличие персистирующих или рецидивирующих гиперинсулинемических гипогликемий у детей от 0 до 18 лет. Диагноз ВГИ устанавливали при уровне инсулина в плазме >2,0 Ед/л в отсутствие кетонурии на фоне гипогликемии (<2,2 ммоль/л); наличии повышенного или нормального уровня С-пептида в момент гипогликемии; отсутствии изменений данных тандемной масс-спектрометрии крови с оценкой уровня аминокислот и ацилкарнитинов, а также при отсутствии признаков опухоли поджелудочной железы по данным УЗИ и/или МСКТ брюшной полости.

В результате обследования были выявлены 42 ребенка с ВГИ, из которых 32 обследовались впервые (возраст 11 дней — 2,5 г), а у 10 диагноз был установлен ранее (возраст 4—13 лет).

Поэтапно подбирали консервативную терапию с оценкой ее эффективности (аналоги соматостатина, диазоксид). В случае фармакорезистентных форм проводили оперативное лечение (частичная резекция поджелудочной железы, субтотальная панкреатэктомия) с последующим гистологическим исследованием удаленной ткани.

У всех пациентов с ВГИ проводили исследование генов KCNJ11, ABCC8, GCK, GLUD1.

Общеклиническое обследование по стандартной методике проводилось по месту госпитализации ребенка; гормональные исследования выполнялись по месту госпитализации ребенка и дублировались в лаборатории ФГБУ ЭНЦ; молекулярно-генетические исследования проводили в генетической лаборатории университетского госпиталя г. Оденс (Дания). Методом ПЦР и прямого секвенирования исследовали все экзоны и прилегающие участки интронов вышеуказанных генов с использованием набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Calif) на анализаторе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems). Анализ результатов секвенирования выполнен с помощью SeqMan v. 7.2 из программного пакета DNASTAR («DNASTAR, Inc.», США). Анализ на крупные делеции и инсерции гена ABCC8 проводился методом мультиплексной амплификации (SALSA MLPA kit P117 ABCC8, MRC Голландия).

Морфологические исследования проводились на базе патоморфологической лаборатории МОНИКИ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Европейской ассоциации педиатров-эндокринологов (ESPE Research Unit Grant 2009—2011).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием прикладных программ Statistica («StatSoft Inc.», США, версия 8.0). Для показателей с нормальным распределением указывалось среднее значение ±SD. При отсутствии нормального распределения данные представлены в виде Me [Х1/4; Х3/4]. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью t-теста для данных с приближенно-нормальным распределением и использованием непараметрических критериев при ненормальном распределении признака. Для сравнения двух независимых выборок по количественным признакам использовался критерий Манна—Уитни. Сравнение частот встречаемости признаков проводилось методом χ². Критический уровень значимости различий принимался равным 0,05.

Основные клинические и гормональные характеристики 42 пациентов представлены в табл. 1.

Ответили на консервативную терапию 26 (62%) пациентов, 16 (38%) получили оперативное лечение.

Гистологическое исследование ткани удаленной поджелудочной железы проводилось во всех оперированных случаях. В результате было выявлено 8 (50%) диффузных, 7 (43,7%) фокальных форм ВГИ и 1(6,3%) атипичная . Из-за невозможности инструментальной визуализации фокуса лишь 2 пациентам с фокальными формами была проведена органосохраняющая операция. В 1 случае пациентка оперирована в клинике в Дании, где предварительно была проведена ПЭТ с 18-F-L-Дофа. Во втором случае фокус был визуализирован интраоперационно.

Результаты молекулярно-генетических исследований

В первую очередь исследовались гены, кодирующие АТФ-зависимые К⁺-каналы бета-клеток (KCNJ11, ABCC8). Мутации в этих генах были выявлены у 11 (26%) человек: у 4 из группы, ответившей на консервативное лечение, и у 7 резистентных к терапии. Таким образом, среди пациентов с фармакорезистентными формами ВГИ мутации KCNJ11 и ABCC8 были выявлены в 50% случаев, тогда как у детей с фармакочувствительными формами они отмечены лишь у 15%. Мутации в гене GCK обнаружены у 2 (5,1%) детей, один из которых отвечал на терапию диазоксидом, а второму потребовалось оперативное лечение. Только у 1 ребенка обнаружена мутация в GLUD1 (см. рисунок).

Всего в генах KCNJ11 и ABCC8 нами было выявлено 12 различных мутаций у 11 человек. Большинство дефектов в этих генах (66,6%) представлены миссенс-мутациями, в 3 (25%) случаях обнаружены нонсенс-мутации, в 1 — делеция. Оба выявленных дефекта гена GCK и дефект гена GLUD1 были представлены миссенс-мутациями. Распределение мутаций по экзонам хаотичное. Пять выявленных нами мутаций ранее не были описаны: Y344X, delF1387, V357I в ABCC8, A96T и R136FsX5 в KCNJ11. Потенциальная патогенность миссенс-мутаций оценивалась методом множественного выравнивания последовательностей с учетом независимых наблюдений в каждой позиции (PSIC). Данный показатель для впервые выявленной A96T мутации составил 0,96, что свидетельствует о ее высокой потенциальной патогенности. Мутация V357I имеет низкий PSIC и рассматривается нами как вариант полиморфизма (табл. 2).

Клинические данные пациентов с установленной генетической причиной ВГИ представлены в табл. 3.

Мутации в генах, кодирующих АТФ-зависимые К⁺-каналы бета-клеток поджелудочной железы (KCNJ11 и ABCC8), были выявлены у 11 (26%) пациентов (8 мальчиков и 3 девочки). Манифестация гипогликемического синдрома у всех пациентов данной группы отмечалась в течение первых 3 дней жизни; 4 (40%) ребенка родились с массой тела ≥2 SD. Степень тяжести гипогликемического синдрома была определена как тяжелая в 8 случаях, средняя — в 2 и легкая — в 1 случае. 7 (63,6%) пациентов оказались резистентными к консервативному лечению, из них у 4 выявлены фокальные формы ВГИ.

В одном случае отмечалась гомозиготная мутация (пациент 1), в 2 случаях выявлены компаундные гетерозиготные мутации (пациенты 3 и 11), у остальных детей мутации гетерозиготные. Клинических данных за наличие ВГИ у родственников выявлено не было.

Молекулярно-генетическое обследование родителей выявило 1 случай гетерозиготного носительства у обоих родителей (ребенок от близкородственного брака), приведшего к аутосомно-рецессивной форме ВГИ. Несмотря на это, у пациента отмечалось умеренно тяжелое течение заболевания с хорошей компенсацией на фоне консервативной терапии. В 3 случаях у отцов пробандов выявлены гетерозиготные мутации в отсутствие у них клинических проявлений ВГИ, что свидетельствует об унипарентальном наследовании, характерном для фокальных форм. 2 детей имели тяжелое фармакорезистентное течение заболевания и были оперированы в первые месяцы жизни (фокальные формы подтверждены гистологически); 1 ребенок с мягким вариантом гипогликемического синдрома ответил на терапию препаратами диазоксида.

В одной семье (пациент 11) у матери выявлена идентичная пробанду гетерозиготная мутация, однако, учитывая отсутствие у нее клинических признаков ВГИ, низкую патогенность указанной мутации, а также наличие у ребенка другой патогенной мутации, этот генетический дефект (V357I) рассматривается нами как вариант полиморфизма.

В оставшихся 6 семьях исследование материнской аллели мутаций не выявило, а обследование отцовской аллели не представлялось возможным, что в 3 случаях установленных диффузных форм свидетельствует о спорадическом аутосомно-доминантном варианте ВГИ, проявившемся тяжелой гипогликемией с ранним дебютом.

У всех пациентов с мутациями в KCNJ11 и ABCC8, вошедших в группу отдаленного наблюдения (n=7), отмечена грубая задержка психомоторного развития. В 3 случаях фокальных форм у детей были отмечены сопутствующие врожденные пороки развития, не явившиеся следствием гипогликемии: атрофия зрительных нервов, нейросенсорная тугоухость, микроцефалия, аномалия развития сосудов головного мозга. Мы предполагаем, что это может быть результатом соматической потери материнской аллели хромосомы 11р15 в клетках головного мозга.

Отдельного внимания заслуживают пациенты с мутациями в гене GCK. Оба случая спорадические, с ранним дебютом гипогликемического синдрома. В обоих случаях мутации ранее описаны. Несмотря на то что подавляющее большинство случаев ВГИ, связанного с мутациями в гене GCK, хорошо поддается терапии диазоксидом, один из наших пациентов оказался резистентен ко всем видам консервативного лечения и сохраняет эпизоды гипогликемии даже после субтотальной панкреатэктомии. Подобные случаи описаны в литературе. Один из них связан именно с мутацией Y214C, обнаруженной у нашего пациента. Функциональные исследования мутантной (Y214C) глюкокиназы продемонстрировали снижение порогового показателя глюкозы, при котором происходит активация фермента, до 0,8 ммоль/л (норма — 5 ммоль/л) и увеличение индекса активности до 130 (норма — 1,5) [26].

Пациентка с лейцинчувствительной гипогликемией (мутация в гене GLUD1) имела все характерные для данной формы ВГИ особенности: поздний дебют заболевания, высокий уровень аммония крови (120 мкмоль/л при норме до 85 мкмоль/л), нормальная масса при рождении, относительно невысокая потребность во в/в введении глюкозы (4 мг/кг/мин) и хороший ответ на консервативную терапию (соматостатин). Однако учитывая низкую комплаентность в приеме препаратов, а также неудовлетворительный контроль гликемии, девочка была прооперирована. У пациентки также имеется характерная для данной формы ВГИ тяжелая эпилепсия (см. табл. 3).

Мы сравнили клинические характеристики в группе пациентов с выявленными мутациями генов KCNJ11 и ABCC8 (группа А, n=11) и в группе пациентов, где не было выявлено мутаций в исследованных генах (группа В, n=28) (табл. 4).

Выявлена ассоциация мутаций в генах KCNJ11 и ABCC8 с ранним дебютом и тяжелым течением ВГИ, что совпадает с данными литературы [1—4, 17]. Мы не обнаружили разницы в уровне инсулина и показателях веса при рождении у пациентов сравниваемых групп. Было отмечено, что распространенность тяжелых форм задержки ПМР выше среди пациентов с мутантными генами, что может являться результатом тяжелого течения гипогликемии у этих детей.

1. Выявлена высокая распространенность мутаций в генах KCNJ11 и ABCC8 у пациентов с ВГИ и ассоциация их с более тяжелым течением, ранним дебютом, риском фармакорезистентного течения и задержкой ПМР.

2. Выявлена высокая распространенность фокальных форм среди фармакорезистентных случаев ВГИ (43,7%).

3. Не выявлено мутаций в исследованных генах среди пациентов со спонтанной ремиссией гипогликемического синдрома.

4. Мутации в гене GCK в редких случаях могут приводить к развитию фармакорезистентного ВГИ.

5. Рекомендуется включение молекулярно-генетического исследования генов KCNJ11 и ABCC8 в протокол обследования пациентов с ВГИ, так как результаты этих исследований могут помочь в выборе тактики ведения больных и во многом определяют прогноз заболевания.