Одной из причин, приводящих к нарушению формирования пола у мальчиков (НФП 46XY), является дефект периферического действия андрогенов. К этой группе заболеваний, характеризующейся НФП при сохранной продукции тестостерона яичками, принято относить две нозологические формы — синдром резистентности к андрогенам (СРА) и дефицит 5α-редуктазы второго типа (5-АРII). Несмотря на то что эти два состояния могут иметь аналогичные клинические проявления (и при том, и при другом заболевании отсутствуют производные мюллеровых протоков и может отмечаться различная степень маскулинизации наружных гениталий, варьирующая от феминного строения до микропениса), в их основе лежат различные патогенетические механизмы.

СРА — заболевание, имеющее Х-сцепленный рецессивный характер наследования, — представляет собой полную или частичную нечувствительность тканей к мужским половым гормонам. Дефицит 5-АРII (аутосомно-рецессивная форма НФП 46XY) связана с дефектом периферической конверсии тестостерона (Т) в дигидротестостерон (ДГТ) — более активный андроген, обладающий большим сродством к андрогеновому рецептору и играющий основную роль в формировании наружных гениталий у плода мужского пола.

Патогенез СРА обусловливает выбор женского пола воспитания ввиду неэффективности терапии андрогенами во взрослом возрасте, тогда как при дефиците 5-АРII вероятное влияние тестостерона на дифференцировку головного мозга во внутриутробном периоде и выраженная маскулинизация в пубертате, а также выраженный маскулинизирующий эффект от терапии, проведенной в раннем возрасте, делают предпочтительным выбор мужского пола воспитания [1].

Вклад этих заболеваний в структуру НФП 46XY в российской популяции изучен недостаточно. В литературе [2] имеются данные исследования гена AR лишь у небольшого числа пациентов с НФП 46XY, которые были получены без учета секвенирования экзона 1. Что касается дефицита 5-АРII, то молекулярно-генетическая верификация данного заболевания ранее не проводилась. В двух исследованиях при клинико-гормональном обследовании больных с НФП 46XY была отмечена высокая встречаемость дефицита 5-АРII, составившая 46% [3] и 61% [4] соответственно.

В настоящем исследовании среди российских пациентов с НФП 46XY нами была оценена встречаемость дефектов генов AR и SRD5A2 в структуре нарушения периферического действия андрогенов. Выявление молекулярных дефектов указанных генов проводилось по результатам полного секвенирования их кодирующей последовательности и примыкающих фрагментов интронов.

Из первоначальной когорты 124 пациентов с НФП 46XY были отобраны 77 больных с нарушением периферического действия андрогенов, критериями которого являлось отсутствие дериватов мюллеровых протоков, а также сохранность биосинтеза Т, оцениваемого по данным исследования базального профиля стероидов и/или после стимуляции чХГ. Медиана возраста пациентов на момент обследования составила 6 лет (от 5 мес до 50 лет), средний возраст обращения к эндокринологу — 6 лет. Семейный анамнез был отягощен у 12 пациентов. В зависимости от степени нарушения стороения наружных гениталий больные были распределены по группам:

1-я группа: 16 (20,8%) пациентов с правильным женским строением наружных гениталий. Все они были зарегистрированы в женском поле; 7 пациенток из этой группы были допубертатного возраста, и поводом для обращения послужило обнаружение яичек в содержимом паховых грыж или опухолевидных образований в области паховых каналов. Девять других больных обратились в период полового созревания с жалобами на отсутствие менструаций. Средний возраст первичного обращения — 11,6±6 лет.

2-я группа: 21 (27,3%) пациент, у которых отмечалась незначительная вирилизация наружных гениталий (1—2 по шкале Прадера). В данной группе отмечался самый ранний возраст обращения к эндокринологам — 5,6±5 лет. Девять человек были зарегистрированы в женском поле (42,9%), из них только у 3 в роддоме был установлен диагноз НФП; и другие 6 обратились для обследования позже, когда родители самостоятельно обнаружили объемные образования в губомошоночных складках. У 12 (57,1%) пациентов из 2-й группы был установлен мужской пол при рождении.

3-я группа: 40 (51,9%) больных с выраженной вирилизацией (3—5 по шкале Прадера). Средний возраст первичного обращения — 8±6,1 года.

Пациентам проводили гормональное обследование, которое для детей допубертатного возраста включало определение базального и стимулированного чХГ уровня Т и ДГТ. У пациентов, достигших половой зрелости, определяли уровни ЛГ, ФСГ, Т. Всем пациентам было выполнено молекулярно-генетическое исследование гена AR. Пациентам, у которых не были выявлены мутации в гене AR, исследовался ген SRD5A2.

Определение Т, ЛГ, ФСГ проводилось в гормональной лаборатории ЭНЦ на автоматическом анализаторе Vitros ECI («Johnson & Johnson, «Orttho-Clinical Diagnostics»); андростендион и ДГТ определяли иммуноферментными методами с использованием коммерческих наборов (ООО «Научный центр ЭфиС»). Дополнительно исследование стероидного профиля сыворотки крови (мультистероидный анализ) проводили методом тандемной хроматомасс-спектрометрии на приборе Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS с использованием источника ионизации ESI (лаборатория наследственных эндокринопатий ЭНЦ).

При исследовании стероидных гормонов определяли их базальные уровни, а также показатели через 72 ч после 3-дневной стимуляции чХГ (2000 Ед м²/сут).

Рассчитывали соотношение Т/ДГТ; оба показателя выражались в нмоль/л.

Геномную ДНК выделяли из периферических лейкоцитов с использованием стандартных методов. С помощью ПЦР амплифицировали фрагменты геномной ДНК, охватывающие кодирующую последовательность гена AR и гена SRD5A2 с примыкающими участками интронов. После электрофореза в 1% агарозном геле продукты ПЦР выделяли и очищали с использованием набора Wizard PCR Preps DNA Purificaion System и затем секвенировали на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer Model 3130 («Applied Biosystems»).

Для ПЦР и секвенирования гена AR использовались следующие олигонуклеотиды:

AR_E1F: 5’-CGC ATC ATC ACA GCC TGT TGA-3’, AR_E1R: 5’-CGC AGG TAG GAG CCG CTA GA-3’, AR_E1F2: 5’-CCT GGA TGA GGA ACA GCA ACC T-3’, AR_E1F3: 5’-GCT GTG CGT CCC ACT CCT TGT-3’, ARE1R2: 5’-CTG GCC TCG CTC AGG ATG TC-3’, AR_E2F: 5’-CCT GAG ACT TCA CTT GCC TAT TTC TG-3’, AR_E2R: 5’-GCC TTG CCA ATG ACT CTA TTT CTG A-3’, AR_E3F: 5’-GTG GAG ATA TCA TCA GGA TCT GAA TTG-3’, AR_E3R: 5’-GGG TCA GCC TGT GTC TAG AGC AT-3’, AR_E4F: 5’-GAG TCT GTG ACC AGG GAG AAT GGT-3’, AR_E4R: 5’-GCA TGA CTG CTG TGC ATC AAT G-3’, AR_E5F: 5’-GCC CGA ATA CCA GAG CAT CTC T-3’, AR_E5R: 5’-GCG ACA ACT GCA GAT CAA ATG AG-3’, AR_E7F: 5’-GCC CCA AGC ACA CAG ACT TCA-3’, AR_E6F: 5’-CGA GGG ATG GCA ATC AGA GAC ATT C-3’, AR_E8R: 5’-CCC AAG GCA CTG CAG AGG AGT AGT G-3’, а для ПЦР и секвенирования гена SRD5A2 использовались следующие олигонуклеотиды: SRD_E1F:5’-CACGGCGCGATGCAGGTTCAG-3’, SRD5_E1R: 5’-CGTTCCTCGGT GCGCGCTCTAC-3’, SRD_E2F: 5’-CTGGTGTGAGCTTAAGAAAGAG-3’, SRD_E3R: 5’-CACTGTCCCCTCTCCATCTG-3’, SRD_E4F: 5’-GAGGGAGCCTCCAGCCCCAC AT-3’, SRD_E4R: 5’-CTGCTACTCTCATCCAGCTAACTTC-3’, SRD_5F: 5’-GGC-TGTGGGAAGGAGAAATAAG-3’, SRD_5R: 5’-CCCAGGCCAGCTGGCAGAAC-3’

В качестве референсных последовательностей кДНК для AR и SRD5A2 использовались ссылки Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) под номерами BC132975.1 и M74047 соответственно. Обозначение мутаций проводили в соответствии с рекомендациями [5].

У всех 77 пациентов при гормональном обследовании определялся нормальный или высокий уровень Т (базальный или после стимуляции чХГ). Уровень ДГТ у всех пациентов был в пределах нормальных значений (табл. 1 и 2).

Всем 77 пациентам было проведено молекулярно-генетическое исследование гена AR, выявлено 25 мутаций у 29 пациентов (рис. 1),

Мутации были выявлены по всей длине последовательности гена AR: в экзоне 1, кодируещем трансактивационный домен гена, обнаружено 20,7% мутаций, в экзонах 2 и 3, кодирующих ДНК-связывающую область, выявлено 13,8% и в экзонах 4,5,6,7 и 8, кодирующих лиганд-связывающий домен, выявлено 65,5% мутаций. Следует отметить, что в базе данных мутаций гена AR (http://www.mcgill.ca/androgendb/) дефекты в первом экзоне встречаются существенно реже, чем в остальных экзонах гена. Однако в двух недавно проведенных исследованиях также отмечена высокая частота мутаций в экзоне 1 (около 20%) [1, 6]. Эта ситуация, по-видимому, связана с тем, что экзон 1 кодирует более половины белка андрогенного рецептора, и в более ранних исследованиях не представлялось возможным исследовать этот участок гена [6]. Все мутации, выявленные в экзоне 1, ранее описаны не были.

Из 25 выявленных нами мутаций в гене AR 12 (48%) были ранее описаны, а 13 (52%) — выявлены впервые. Среди них мутации Q114X, E522X и c.491delT p.L164fsX172 приводили к преждевременному прерыванию трансляции белка AR и ожидаемому полному нарушению его функции. В пользу патологической значимости других впервые выявленных мутаций могут свидетельствовать консервативность заменяемых аминокислотных остатков, а также их местоположение. Так, мутации G324S, G258R и c.163_171ins CTGCTG p.L55_Q58insLL расположены в трансактивационном домене гена AR. Можно предположить, что они приводят к нарушению трансактивации и нарушению концевого взаимодействия молекул рецептора, что в свою очередь резко снижает его функции. Мутация T575I наиболее вероятно приводит к нарушению ДНК-связывающей способности рецептора, тогда как мутации F697L, А748V, T751I, S778P и Y781С, располагаясь в лиганд-связывающем регионе белка AR, предположительно нарушают связывание рецептора с гормоном.

Нонсенс-мутации, делеции и сплайсинг-мутации определялись у пациентов 1-й группы (полная форма СРА). Миссенс-мутации выявлялись у пациентов со всеми формами заболевания (55,2% — 1-я группа, 44,8% — 2-я и 3-я группы). Значимой корреляции между формами заболевания и местоположением мутации не обнаружено (r=–0,034, р=0,87). В нашей когорте пациентов мутации в гене AR выявлены в 37,66% случаев. В аналогичных исследованиях выявляемость мутаций в этом гене составила 44,4% и 40,4% [6, 7].

Мутации в 1-й группе были доказаны в 93,75%, что существенно выше, чем во 2-й и 3-й группах (27,45%). Эти данные согласуются с данными аналогичных исследований, где доказанные мутации у пациентов с полной формой СРА составляли 83 и 85%, а при неполной форме СРА 24,8 и 16% [6, 7].

У 42 пациентов с невыявленными мутациями в гене AR исследовали ген SRD5A2. Исключение составили 8 пациентов, у которых очевидно прослеживался Х-сцепленный вариант наследования, и пациенты с выраженной гинекомастией.

У 3 из 42 больных выявлены составные гетерозиготные мутации в гене SRD5A2: c.599_600delA p.E200fsX278/p.Y91H, p.AI5S/p.E197K и c.599_600delA p.E200fsX278/G196S. Данные мутации ранее не описаны. Во всех случаях родители являлись гетерозиготными носителями данных мутаций. Эти 3 пациента клинически были включены во 2-ю группу. При рождении они были зарегистрированы в женском поле, а после уточнения диагноза пол воспитания был сменен с женского на мужской.

Нами выявлено достоверное повышение уровня ЛГ у пациентов пубертатного возраста с выявленными мутациями в гене AR по сравнению с пациентами этой же возрастной группы, но с неуточненным диагнозом. По остальным гормональным показателям достоверных различий между группами пациентов с доказанными мутациями в гене AR и SRD5A2 и таковыми с неверифицированным диагнозом обнаружено не было (рис. 2).

Следует подчеркнуть, что не выявлено разницы в гормональных показателях и соотношении Т/ДГТ у пациентов с доказанными мутациями в гене SRD5A2 и другими пациентами. У пациентов с дефицитом 5-АРII определялись низкие базальные уровни Т и ДГТ, на фоне стимуляции чХГ отмечалось повышение и Т, и ДГТ. Диагностическим критерием дефицита 5-АРII является повышение соотношения Т/ДГТ в крови выше 25; у детей допубертатного возраста данное соотношение оценивается на пробе с чХГ [8, 9]. Во всех случаях дефицита 5-АРII оценка соотношения Т/ДГТ оказалась неинформативной. Соотношение Т/ДГТ на фоне стимуляции чХГ соответствовало нормальным значениям (7,66; 7,85; 7,8). Соответственно гормональная диагностика не имеет достаточной диагностической ценности и не позволяет дифференцировать эти состояния.

При молекулярно-генетическом подтверждении диагноза дефицит 5-АРII был выявлен нами лишь у 3 (3,9%) из 77 пациентов. По данным разных зарубежных исследований [10, 11], частота встречаемости дефицита 5-АРII среди пациентов с НФП 46XY варьирует от 14,6 до 20% в зависимости от распространенности близкородственных браков в популяции. О частоте встречаемости заболеваний в России не было четких сведений. По ранее опубликованным российским данным, дефицит 5-АРII составил 46% от общего числа пациентов с НФП [3]; очень высокая выявляемость пациентов с 5-АРII описана и в другой работе, где дефицит 5-АРII был диагностирован у 364 из 595 пациентов с НФП 46XY [4]. Однако в этих работах диагноз 5-АРII не имел молекулярно-генетического подтверждения.

Из 29 пациентов с доказанным дефектом гена AR 16 были первоначально зарегистрированы в женском поле (среди них 15 — из 1-й группы), а 13 — в мужском поле (2-я и 3-я группы). После уточнения диагноза пол был изменен на женский у 2 больных. У остальных, несмотря на плохую перспективу маскулинизации, был сохранен мужской пол, так как диагноз был поставлен поздно.

Мы столкнулись с проблемой поздней диагностики во 2-й и 3-й группах, в которых средний возраст обращения к эндокринологу составил 6 лет (минимальный — 3 нед). В 17,8% случаев паспортный пол был определен на основании кариотипа, в остальных случаях — только на основании строения наружных половых органов. В 1-й группе средний возраст первичного обращения составил 11,6±6 лет, что имеет объективные причины, так как заболевание выявляется при обнаружении гонад или при обращении по поводу первичной аменореи. Уточнение диагноза в раннем возрасте в этой группе не имеет столь решающего значения, так как пол воспитания однозначно является женским.

Ранняя диагностика заболевания наиболее важна у пациентов с минимальной вирилизацией, так как именно в этой группе пациентов больше всего вопросов о половой принадлежности ребенка.

У 45 (58,4%) пациентов причина НФП осталась неясной. В 1-й группе диагноз не был подтвержден у 1 (6,25%) пациентки, у которой была классическая картина СРА.

Среди пациентов с неоднозначными гениталиями диагноз не установлен у 44 (72,1%) пациентов. У 3 пациентов, достигших пубертатного возраста, клиническая картина заболевания соответствовала СРА, у 1 из этих пациентов был отягощен семейный анамнез, указывающий на Х-сцепленный характер наследования заболевания. Возможно, что у этих пациентов и у пациентки из 1-й группы имеются дефекты в интронной части гена AR, которые приводят к нарушению сплайсинга, соответственно, к синтезу неполноценного белка рецептора. Другим вероятным объяснением может быть дефект или нарушение соотношений белков-корегуляторов, при непосредственном взаимодействии с которыми стимулируются андрогенчувствительные элементы. На данный момент для андрогенового рецептора известно около 150 коактиваторов и корепрессоров, механизм действия которых еще до конца не изучен.

В одном из наших наблюдений у сводных сибсов с НФП 46XY, имеющих разную степень маскулинизации при рождении и зарегистрированных в разном поле, был исследован ген AR, мутации выявлены не были. Пациент, воспитывающийся в мужском поле, достиг половой зрелости, у него отмечается прогрессирующая маскулинизация и отсутствие гинекомастии. Возможно, у данных пациентов имеется дефект гена CXorf6, картируемого на Х-хромосоме, дефект которого приводит к недоразвитию гениталий у мальчиков. Не исключено также, что в данном случае имеет место аутосомно-доминантный тип наследования гена, дефект которого не проявляется у женщин (например, ген SF1).

Вполне вероятно, что существует еще ряд генов, дефекты которых приводят к недоразвитию наружных гениталий у мальчиков. Наконец, к НФП 46XY могут приводить и ненаследственные причины, такие, например, как воздействие на плод эндокринных дизрапторов.

1. У пациентов с НФП 46XY с правильным женским строением наружных гениталий наиболее часто выявляется дефект гена АR (83%).

2. Более половины случаев НФП 46XY с нарушением периферического действия андрогенов с неоднозначным строением гениталий не обусловлено дефектами генов AR и SRD5A2, что требует уточнения причин данного состояния и поиска других патогенетических факторов.

3. В российской популяции дефицит 5α-редуктазы 2-го типа является редкой причиной НФП 46XY.

4. Исследования гормонального профиля (включая определение соотношения Т/ДГТ) не позволяют провести дифференциальную диагностику между СРА и дефицитом 5α-редуктазы 2-го типа у детей допубертатного возраста.

5. Всем пациентам с НФП 46XY, обусловленным нарушением периферического действия андрогенов, необходимо исследовать гены AR и SRD5A2.