Важным патогенетическим механизмом развития макро- и микроангиопатий при сахарном диабете (СД) является окислительный стресс, сопровождающийся усилением генерации свободных радикалов и снижением активности антиоксидантной системы. Развитие оксидативного стресса при СД связано с повышением аутоокисления глюкозы, активацией неферментативного гликозилирования белков с образованием конечных продуктов, усилением метаболизма глюкозы полиоловым путем, что приводит к увеличению продукции таких активных форм кислорода (АФК), как супероксид-анион, гидроксильный радикал, а также перекись водорода [7, 10]. Применение препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, может снизить риск возникновения и прогрессирования микроангиопатий при СД [10].

Согласно некоторым данным [11, 16], пероральные сахарснижающие препараты, применяемые в клинической практике, обладают не только антидиабетической активностью, но и снижают риск развития сосудистых осложнений, что авторы связывают с влиянием на свободнорадикальные процессы. Антиоксидантные эффекты препаратов, применяемых для терапии СД, могут быть обусловлены непосредственным взаимодействием со свободными радикалами, активностью метаболитов, активацией антиоксидантной системы и снижением интенсивности окислительного стресса при адекватной коррекции гипергликемии. В экспериментах in vitro [14] показано наличие свойств скавенджера супероксиданиона и гидроксильного радикала у гликлазида. Антиоксидантные свойства обнаружены и у группы инсулиносенситайзеров, например, розиглитазон снижает НАДН-индуцированную продукцию свободных радикалов и повышает активность каталазы [16]. H. Khouri и др. показали, что метформин в терапевтических концентрациях, возможно, является скавенджером гидроксильного радикала, но не реагирует с супероксид-анионом и перекисью водорода [12]. Однако при анализе химической структуры метформина не выявлены фрагменты, ответственные за антиоксидантное и антирадикальное действие (фенольные группы, азотсодержащие гетероциклы, тиоловые группы и др.). Одним из механизмов терапевтических эффектов нового перорального сахарснижающего препарата диабенола может быть наличие у него антиоксидантной активности [3]. Кроме того, у существующих пероральных сахарснижающих препаратов не прогнозируется прямая антиоксидантная активность в системе компьютерного прогнозирования активности PASS (http://www.ibmc.msk.ru/PASS).

Так как данные о влиянии пероральных сахарснижающих препаратов на свободнорадикальные процессы носят противоречивый характер, весьма разрознены и требуют уточнения, целью настоящей работы являлось изучение механизмов антиоксидантной активности гипогликемических препаратов в условиях in vitro.

Антиоксидантные свойства веществ изучены на модели аскорбатзависимого перекисного окисления липидов (ПОЛ) по методу В.З. Ланкина и соавт. [2]; в качестве субстрата аскорбатзависимого ПОЛ использовали гомогенат печени крысы, реакцию инициировали раствором аскорбиновой кислоты. Содержание гидроперекисей липидов оценивали по интенсивности окраски комплексов тиобарбитуровой кислоты и малонового диальдегида — конечного продукта окислительной деградации липидов. Для оценки действия веществ на Fe²⁺-индуцированную хемилюминесценцию (ХЛ) липидов получали реакционную смесь липидов куриного желтка, содержащую липопротеиновые комплексы, сходные с липидами крови [1]. Процесс ПОЛ индуцировали введением раствора сульфата железа и измеряли кинетику реакции в течение 10 мин.

Для уточнения механизмов антиоксидантного действия использовали две модели ХЛ: ХЛ с аутоокислением люминола и генерацией АФК и ХЛ окисления люминола пероксильными радикалами, генерирующимися 2,2`-азобис (2-метилпропионамидин) дигидрохлоридом (АБАП) [5]. Для моделирования процессов с генерацией АФК готовили реакционную смесь, включающую фосфатный буфер рН 7,45, люминол («Serva», Германия) и цитрат натрия (Россия); ХЛ инициировали введением в пробу сульфата железа и в течение 5 мин измеряли кинетику ХЛ. Реакцию продукции пероксильного радикала индуцировали введением водорастворимого соединения АБАП в пробу, содержащую люминол в фосфатном буфере pH 7,4, и измеряли кинетику ХЛ в течение 30 мин. Все ХЛ-измерения проводили с помощью хемилюминомера «Хемилюминомер-03» (Уфа, Россия).

Также определяли антирадикальную активность по методу J. Glavind [9], эффект оценивали по проценту ингибирования, рассчитанному как отношение изменения оптической плотности спиртового раствора 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФПГ) при добавлении веществ в исследуемой концентрации к изменению оптической плотности при добавлении пирогаллола. Исследовали гликлазид («Сервье», Франция), глибенкламид (Манинил, БЕРЛИН-ХЕМИ, Германия), розиглитазона малеат (Rozenda, «Biofarma Ilac San. ve Tic. A.S.», Турция), метформина гидрохлорид (Сиофор, MERCK, Австрия), а также диабенол (НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, Ростов-на-Дону). Все препараты изучали в диапазоне концентраций от 10^-4 до 10^-6 М/л.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «Statistica 6.0». Для расчета концентрации вещества, ингибирующей реакцию на 50% (ИК₅₀), использовали метод регрессионного анализа, реализованный в программе Microsoft Excel 2000.

На модели аскорбатзависимого ПОЛ гипогликемические препараты проявили низкую антиоксидантную активность. Так, для гликлазида в концентрации 10^-4 М/л процент ингибирования был равен 14% (p>0,05), розиглитазона — 13% (p>0,05), диабенола — 7% (p>0,05), метформина — 4% (p>0,05). Однако данная модель позволяет оценить процесс ПОЛ косвенно (только по конечному продукту — малоновому диальдегиду), поэтому для изучения кинетики окисления липидов использовали Fe2+-индуцированную ХЛ желточных липопротеинов. При исследованиях на этой модели процент ингибирования в концентрации 10^-4 М/л для розиглитазона составил 37% (p<0,01), метформина был в 2 раза ниже, а для остальных веществ не превышал 11%.

При оценке общей антирадикальной активности выявлено, что розиглитазона малеат, диабенол, метформин, глибенкламид в концентрации 10^-4 М/л незначительно снижали оптическую плотность спиртового раствора ДФПГ (см. таблицу),

Гликлазид не оказывал влияния на кинетику реакции ХЛ с генерацией АФК (см. таблицу). Возможно, низкая активность связана с тем, что препарат высоколипофилен, а данная модельная система позволяет изучать вещества только в водной фазе. При этом, согласно A. Sikora и соавт. [17], гликлазид проявил свойства скавенджера супероксид-аниона, гидроксильного радикала и NO-радикала, что обусловлено наличием аминоазобициклооктилового кольца в его молекуле.

В экспериментах по изучению механизмов антиоксидантного действия пероральных сахарснижающих препаратов выявлено, что диабенол оказался активным в отношении супероксид-аниона, гидроксильного и пероксильного радикалов. На модели ХЛ с генерацией активных форм кислорода ИК₅₀ для диабенола составила 2,05·10^-5 М/л, а на модели ХЛ, сопровождающейся окислением люминола пероксильными радикалами, данный показатель был выше (ИК₅₀=3,8·10^-5М/л, R²=0,97). Возможно, антиоксидантная активность диабенола связана с наличием избыточной электронной плотности в бензимидазольном кольце [3].

Розиглитазон уступал в 2,5 раза диабенолу по эффекту на модели ХЛ с аутоокислением люминола (ИК₅₀=5,3·10^-5 М/л, R²=0,98) и практически не влиял на кинетику реакции ХЛ с генерацией пероксильных радикалов, что согласуется с данными литературы. Ранее [13] были получены данные о способности глитазонов (розиглитазон, троглитазон) дозозависимо снижать скорость генерации супероксид-аниона в бесклеточной системе ксантин-ксантиноксидаза и доказано, что эти вещества не влияют на ферментативную активность ксантиноксидазы. Однако G. Ceolotto и соавт. [7, 10] в своих исследованиях описали опосредованные эффекты розиглитазона на свободнорадикальные процессы при СД, связанные с активацией АМФ-протеинкиназы и предупреждением гиперактивации НАДФН-оксидазы при гипергликемии. Таким образом, антиоксидантная активность розиглитазона связана как с прямым взаимодействием с АФК, так и с сахарснижающим действием препарата.

Метформин оказался практически неактивным в отношении супероксид-аниона, гидроксильного и пероксильного радикалов. Антиоксидантные эффекты данного препарата, возможно, связаны с восстановлением активности антиоксидантной системы; так, у пациентов с СД после терапии повышалась концентрация восстановленного глутатиона, активность каталазы и Cu, Zn-супероксиддисмутазы [10, 16]. Кроме того, метформин ингибирует образование конечных продуктов гликирования и регликирует белки, а также опосредованно модулирует внутриклеточную продукцию супероксид-аниона НАДФН-оксидазой [6, 10, 15].

Для глибенкламида в концентрации 10^-4 М/л ингибирование ХЛ с аутоокислением люминола не превышало 40%, а при снижении концентрации эффект исчезал, данный препарат не оказывал влияния на кинетику ХЛ с окислением люминола пероксильными радикалами.

Сочетание у пероральных сахарснижающих препаратов антидиабетического и прямого антиоксидантного эффектов позволило бы корректировать не только уровень глюкозы, но и свободнорадикальные процессы при СД. Известно, что гипергликемия является пусковым фактором развития окислительного стресса при СД, однако гиперпродукция свободных радикалов цепью переноса электронов наблюдается даже при адекватном контроле уровня глюкозы, что объясняется феноменом «гипергликемической памяти» [8]. Гликирование белков митохондрий приводит к усилению генерации супероксид-аниона, а основной фактор защиты от повреждающего действия активных форм кислорода (супероксиддисмутаза) при гликировании теряет функциональную активность [8, 11]. Таким образом, пациенты с СД 2-го типа нуждаются в дополнительной антиоксидантной терапии вне зависимости от степени компенсации углеводного обмена. Проведенные исследования в модельной системе ХЛ с генерацией АФК продемонстрировали, что диабенол в 16 раз, а розиглитазона малеат в 45 раз менее активны, чем водорастворимый аналог α-токоферола — тролокс [4]. Полученные результаты подтверждают сомнительность большинства данных литературы о прямых антиоксидантных эффектах пероральных сахарснижающих препаратов; такие эффекты могут быть опосредованы снижением уровня глюкозы, регликированием белков или ингибированием процессов гликирования.

1. Гликлазид проявляет выраженное антирадикальное действие на модели со свободным радикалом ДФПГ; розиглитазон в условиях in vitro активен только в отношении супероксид-аниона, а диабенол является скавенджером супероксид-аниона, гидроксильного и пероксильного радикалов.

2. Антиоксидантные свойства метформина и глибенкламида в модельных системах in vitro отсутствуют.