Развитие сахарного диабета (СД) обусловлено формированием абсолютной (при СД 1-го типа) или относительной (при СД 2-го типа) недостаточности инсулина [1]. В динамике прогрессирования заболевания недостаточность инсулина приобретает смешанный характер независимо от типа СД. В случае СД 1-го типа это обусловлено развитием вторичной инсулинорезистентности, снижающей эффективность заместительной инсулинотерапии [1, 2]. При длительном течении СД 2-го типа развивается поражение панкреатических β-эндокриноцитов с сопутствующим снижением продукции эндогенного инсулина и формированием потребности в лечении препаратами этого гормона [1]. Абсолютный и относительный дефицит инсулина вызывает нарушения обмена веществ, приводящие к развитию поздних осложнений СД [3]. В первую очередь это касается диабетических нейро- и ангиопатий, относящихся к наиболее распространенным осложнениям СД [4]. Важным аспектом данной закономерности является постепенное развитие диабетической энцефалопатии (ДЭ) смешанного (дисциркуляторно-метаболического) типа [5, 6], которая проявляется медленно прогрессирующим когнитивным дефицитом и сопутствующей депрессией. Неспецифический характер и слабая выраженность симптоматики начальных стадий ДЭ существенно затрудняют ее диагностику, что препятствуют своевременному началу лечения данного синдрома. При этом прогрессирование ДЭ связано с нарастающим ухудшением качества жизни и высоким риском развития деменции [6]. Абсолютная и относительная недостаточность инсулина играет особую роль в формировании ДЭ. Это связано с экспрессией рецепторов инсулина в головном мозге и прямым участием гормона в регуляции аффективного статуса, когнитивных функций и поведения [7—9]. Нарушения отмеченных церебральных функций при экспериментальном СД эффективно корригируются сочетанием инсулинотерапии с 7-дневным курсом применения производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты (эмоксипина, реамберина и мексидола) [10]. Аналогичное действие оказывает α-липоевая кислота (α-ЛК) [10]. Кроме того, перечисленные лекарственные средства улучшают состояние углеводного и липидного обмена на фоне инсулинотерапии при аллоксановом диабете у крыс [10]. Важным механизмом терапевтического действия α-ЛК, а также производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты считается их антиоксидантный эффект [11—13]. Представленная статья посвящена рассмотрению взаимосвязи между влиянием этих антиоксидантов (АО) на чувствительность к инсулину и эффективностью их 2-недельного применения с целью экспериментальной терапии метаболических расстройств и аффективно-когнитивных нарушений при аллоксановом диабете у крыс. Для достижения данной цели в отдельных экспериментальных сериях проводилось последовательное решение 3 задач: 1) изучение влияния АО на чувствительность к инсулину у интактных крыс; 2) оценка АО-индуцированных изменений толерантности к глюкозе у интактных животных; 3) оценка эффективности терапевтического применения АО при экспериментальном СД у крыс.
Материал и методы
Исследование было проведено на 447 половозрелых беспородных крысах (самцах и самках) массой 140—160 г и состояло их 3 серий экспериментов. Организация работы соответствовала международным этическим нормам, регламентирующим эксперименты на животных [14].
В первой серии экспериментов изучали влияние эмоксипина, реамберина, мексидола и α-ЛК на чувствительность к инсулину. В данной серии экспериментов использованы 140 крыс, подвергнутых предварительному суточному голоданию при свободном доступе к воде. Изучаемые АО вводили однократно внутрибрюшинно. Каждый АО применяли в 3 дозах, экстраполированных из разовых дозировок терапевтического диапазона для человека с учетом различий в величинах относительной площади поверхности тела [15]. Во всех случаях минимальной дозой изучаемого диапазона являлась ½ расчетного эквивалента средней терапевтической дозы (ЭСТД). В качестве максимальной дозы использовали удвоенный ЭСТД. Берлитион (α-липоевая кислота, «Berlin-Chemie», Германия) вводили в дозах 25, 50 и 100 мг/кг. Эмоксипин (2-этил-6-метил-3-оксипиридина гидрохлорид, Московский эндокринный завод) использовали в дозах 6,25, 12,5 и 25 мг/кг. Мексидол (2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат, ООО МЦ «Эллара», Москва) применяли в дозах 12,5, 25 и 50 мг/кг. Исследованные дозы 1,5% раствора реамберина (N-(1-дезокси-D-глюцитол-1-ил)-N-метиламмония натрия сукцинат, НТФФ «Полисан», С-Петербург) составили 12,5, 25 и 50 мл/кг. Животные контрольных подгрупп получали соответствующие объемы 0,9% раствора NaCl. Сразу после внутрибрюшинного введения АО или 0,9% раствора NaCl крысам проводили струйную внутривенную инфузию нейтрального раствора инсулина для инъекций (Хумулин регуляр, «Eli Lilly», Франция) в дозе 40 МЕ/кг. Чувствительность животных к инсулину оценивали по латентности развития инсулиновой комы [16].
Во второй серии экспериментов оценивали влияние эмоксипина, реамберина, мексидола и α-ЛК на толерантность к глюкозе у интактных крыс. В этой экспериментальной серии также использованы 140 животных, подвергнутых предварительному суточному голоданию при свободном доступе к воде. Через 30 мин после однократного введения АО в изучаемых дозах у животных брали кровь из хвостовых вен для регистрации исходной гликемии и выполняли тест на толерантность к глюкозе (ТТГ). С этой целью применяли нагрузку глюкозой в дозе 2 г/кг (5 мл/кг 40% раствора глюкозы внутрибрюшинно). Изменения гликемии в динамике ТТГ регистрировали через 60 и 120 мин после сахарной нагрузки. Животным контрольных подгрупп за 30 мин до ТТГ вместо изучаемых АО вводили эквиобъемные количества 0,9% раствора NaCl.
В третьей серии экспериментов, выполненной на 167 крысах, исследовали эффективность АО в лечении экспериментального СД. Его моделировали путем внутрибрюшинного введения аллоксана тригидрата («La Chema», Чехия) или аллоксана моногидрата (ДИАэМ, Россия) в эквивалентных дозах (200 и 163 мг/кг соответственно). Крысы контрольной группы получали эквиобъемное количество 0,9% раствора NaCl. Через 72 ч после индукции СД крыс, получивших инъекцию аллоксана, равномерно распределяли на подгруппы антиоксидантной терапии и контроля. Исследуемые АО вводили внутрибрюшинно, ежесуточно на протяжении 14 дней. Использовали те же разовые дозы АО, которые применялись в экспериментах по изучению чувствительности к инсулину и ТТГ. Животные контрольных подгрупп получали соответствующие объемы 0,9% раствора NaCl. Всем крысам с экспериментальным СД проводили базисную инсулинотерапию, начиная с 4-го дня после инъекции аллоксана. С этой целью животным раз в сутки подкожно вводили 3 МЕ/кг инсулина аспарта двухфазного (НовоМикс 30 Пенфилл, «Novo nordisk», Дания).
Через 14 дней от начала антиоксидантной терапии исследовали поведение животных в «открытом поле» [15] по показателям локомоции, исследовательско-ориентировочной активности, груминга и дефекации, считающейся вегетативным эквивалентом тревоги у крыс [17]. Примененный подход позволяет получить интегральную характеристику аффективного статуса грызунов, активность которых в «открытом поле» формируется как равнодействующая двух противоположных тенденций — страха незнакомого пространства и мотивации к его исследованию [17].
По завершении тестирования крыс в «открытом поле» оценивали их способность к выработке условного рефлекса активного избегания (УРАИ). В работе использовали вариант УРАИ, связанный с формированием навыка «избегания плаванием» за одну попытку [17]. О качестве формирования УРАИ судили по кратности снижения латентного периода избегания через 24 ч после обучающей попытки. Сразу после окончания этологического исследования животных наркотизировали диэтиловым эфиром и декапитировали для получения крови. Уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сыворотке крови определяли спектрофотометрически с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта [15, 18]. Результаты выражали в единицах индексов окисления (ед.и.о.) — Е232Е220 (относительное содержание диеновых конъюгатов — ДК) и Е278/Е220 (уровень кетодиенов — КД, и сопряженных триенов — СТ). Выраженность нарушения углеводного обмена оценивали по гликемии натощак. Одновременно в сыворотке крови регистрировали концентрацию фруктозамина, отражающего интенсивность неферментного гликозилирования белков плазмы крови [19]. О состоянии липидного обмена судили по общему содержанию холестерина и триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови.
Статистический анализ полученных данных выполнен с использованием пакета прикладных компьютерных программ SPSS-13.0. Данные обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±m). О достоверности различий между несвязанными выборками судили по критериям Манна—Уитни, Вальда—Вольфовица и Колмогорова—Смирнова. Статистическую значимость различий между связанными выборками оценивали с помощью парного критерия Вилкоксона. Проверку статистических гипотез выполняли при критическом уровне значимости р=0,05.
Результаты и обсуждение
В результате исследования было установлено, что все изученные лекарственные средства оказывают инсулинпотенцирующее действие (см. рисунок).
Производные 3-оксипиридина (эмоксипин и мексидол) обладали менее выраженной инсулинпотенцирующей активностью, которая подчинялась нелинейной зависимости от дозы (см. рисунок). В обоих случаях максимальное и выраженное в равной степени снижение латентности инсулиновой комы (в 1,2 раза от контроля) отмечалось в середине изученного диапазона доз (ЭСТД). ЭСТД мексидола оказалась единственной дозой, оказывающей достоверный инсулинпотенцирующий эффект. В случае эмоксипина наименее выраженное (но статистически значимое) ускорение развития инсулиновой комы было зарегистрировано на фоне введения максимальной дозы (2 ЭСТД). Вполне возможно, что максимальная выраженность инсулинпотенцирующего действия 3-оксипиридиновых АО в дозе ЭСТД связана с достижением оптимального баланса между оксидативной (НАДФН-оксидазной) трансдукцией инсулинового сигнала [21] и ограничением зависимой от оксидативного стресса инсулинорезистентности.
Функциональную значимость инсулинпотенцирующего действия АО оценивали по их влиянию на показатели ТТГ (табл. 1).
Невзирая на базисную инсулинотерапию, через 17 дней после введения аллоксана наблюдались выраженные гипергликемия, гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия (табл. 2).
Особого внимания заслуживает анализ изменений содержания продуктов ПОЛ в крови крыс с аллоксановым диабетом после 14-дневного применения АО. Прежде всего необходимо отметить, что через 17 дней после введения аллоксана отмечалось достоверное снижение уровня липопероксидов в крови больных животных, получавших только инсулинотерапию. Это касалось интегральной совокупности контрольных крыс с аллоксановым диабетом, у которых было отмечено достоверное по сравнению с интактными животными уменьшение содержания гептанрастворимых ДК (0,63±0,03 ед.и.о. против 0,74±0,02 ед.и.о.; р=0,014), изопронолрастворимых ДК (0,52±0,02 ед.и.о. против 0,64±0,01 ед.и.о.; р<0,001), а также изопропанолрастворимых КД и СТ (0,36±0,02 ед.и.о. против 0,45±0,02 ед.и.о.; р=0,001). Данная ситуация качественно отличается от сдвигов в содержании продуктов ПОЛ через 10 дней после введения аллоксана, когда был отмечен достоверный прирост уровня липопероксидов в крови больных крыс [10]. Вполне возможно, что повышенный уровень продуктов ПОЛ способствует нарушению редокс-праймирования β-субъединицы инсулинового рецептора за счет повреждения инсулинчувствительного НАДФН-оксидазного комплекса со снижением его Н2О2 -продуцирующей функции [21]. Не исключено, что уменьшение содержания продуктов липопероксидации в крови через 17 дней после введения аллоксана связано с реализацией подобного механизма в мышечной и жировой тканях, на долю которых приходится большая часть массы тела. По-видимому, инсулинпотенцирующее действие изученных АО (см. рисунок) способствует поддержанию редокс-механизмов трансдукции инсулинового сигнала с сопутствующим увеличением продукции Н2О2, способной индуцировать ПОЛ [27]. О справедливости этого предположения свидетельствует достоверное нарастание уровня липопероксидов в крови больных крыс после 2-недельного применения всех изученных АО (см. табл. 2). Прежде всего это касалось α-ЛК и реамберина, оказывавших наиболее выраженное инсулинпотенцирующее действие (см. рисунок) и во всех дозах вызывавших значимое повышение содержания изопропанолрастворимых ДК. Производные 3-оксипиридина, уступавшие α-ЛК и реамберину по инсулинпотенцирующему эффекту (см. рисунок), повышали содержание различных категорий липопероксидов лишь в относительно низких дозах. Курсовое применение ½ ЭСТД эмоксипина и мексидола приводило к достоверному приросту уровня изопропанолрастворимых КД и СТ (табл. 3).
Нарушения углеводного и липидного обмена, наблюдавшиеся через 17 дней после введения аллоксана (см. табл. 2), сопровождались выраженными расстройствами поведения и снижением способности к условнорефлекторному обучению. Это проявилось заметным снижением показателей двигательной, ориентировочной и исследовательской активности у животных, получавших после индукции СД только инсулинотерапию (см. табл. 3). Одновременно наблюдалось увеличение параметров груминга и дефекации. Нарушения поведения крыс в «открытом поле» сопровождались существенным уменьшением показателя качества формирования УРАИ. Данные нарушения считаются аналогичными тревожно-депрессивным расстройствам и когнитивному дефициту у больных СД [10, 11]. Изученные АО корригировали расстройства поведения и формирования УРАИ в зависимости от выраженности инсулинпотенцирующего действия и влияния на параметры ТТГ. Наиболее эффективными препаратами оказались α-ЛК, вызывавшая наибольшее сокращение латентности инсулиновой комы (см. рисунок), и мексидол, превосходивший остальные АО по увеличению толерантности к нагрузке глюкозой (см. табл. 1). α-ЛК и мексидол нормализовали все показатели поведения больных животных в «открытом поле» и достоверно улучшали формирование УРАИ во всем диапазоне изученных доз (см. табл. 3). Подобные эффекты наблюдались после курсового применения эмоксипина, который, однако, не корригировал нарушения двигательной и ориентировочной активности в минимальной дозе (1/2 ЭСТД).
Экспериментальная 2-недельная терапия реамберином оказалась наименее эффективной. Невзирая на заметную нормализацию поведения больных животных под действием реамберина, он корригировал нарушения формирования УРАИ лишь в одной дозе (ЭСТД). Относительно высокие дозы этого препарата (ЭСТД и 2 ЭСТД) не повлияли на расстройства груминга при аллоксановом диабете. Следует подчеркнуть, что менее продолжительное (7-дневное) курсовое применение реамберина при аллоксановом диабете корригировало расстройства поведения во всем диапазоне изученных доз [10]. Это свидетельствует о возможном развитии толерантности к ремберину в процессе его 14-дневного применения при экспериментальном СД. Не исключено, что формирование толерантности к реамберину при аллоксановом диабете может быть связано с неблагоприятным влиянием данного препарата на динамику гликемии после сахарной нагрузки (см. табл. 1).
В целом результаты проведенного исследования и ранее полученные данные [10] свидетельствуют о том, что изученные АО способствуют коррекции метаболических расстройств, сопутствующих тревожно-депрессивных нарушений и когнитивного дефицита у крыс с аллоксановым диабетом. При этом эффективность экспериментальной терапии с помощью АО зависит от выраженности их инсулинпотенцирующего действия и способности увеличивать толерантность к нагрузке глюкозой. Наилучшая коррекция проявлений аллоксанового диабета была достигнута при курсовом применении α-ЛК, в наибольшей степени увеличивавшей чувствительность к инсулину, и мексидола, оказавшего наиболее выраженное действие на толерантность к нагрузке глюкозой. Значимое увеличение уровня продуктов ПОЛ в крови крыс с аллоксановым диабетом после курсового применения АО не позволяет непосредственно связать их эффективность с антиоксидантным действием.
Выводы
1. Однократное введение α-ЛК и оригинальных отечественных антиоксидантов (эмоксипина, реамберина и мексидола) интактным крысам увеличивает чувствительность животных к инсулину.
2. Инсулинпотенцирующее действие α-ЛК, эмоксипина и мексидола связано с увеличением толерантности крыс к сахарной нагрузке после однократного введения этих антиоксидантов. Несмотря на выраженную инсулинпотенцирующую активность реамберина, однократное введение данного препарата оказывает гипергликемизирующее действие и снижает толерантность крыс к нагрузке глюкозой.
3. Введение на протяжении 14 дней изученных антиоксидантов в сочетании с препаратом инсулина способствует коррекции метаболических расстройств, сопутствующих тревожно-депрессивных нарушений и когнитивного дефицита у крыс с аллоксановым диабетом.
4. Эффективность экспериментальной терапии аллоксанового диабета с помощью антиоксидантов зависит от выраженности их инсулинпотенцирующего действия и способности увеличивать толерантность к нагрузке глюкозой. Наилучшая коррекция проявлений аллоксанового диабета достигается при курсовом 2-недельном применении α-ЛК, в наибольшей степени увеличивавшей чувствительность к инсулину, и мексидола, оказавшего наиболее выраженное действие на толерантность к нагрузке глюкозой.
5. Значимое увеличение уровня продуктов ПОЛ в крови крыс с аллоксановым диабетом после 2-недельного применения изученных лекарственных средств не позволяет непосредственно связать их эффективность с антиоксидантным действием.