Экспрессия рецепторов соматостатина и дофамина в АКТГ-продуцирующих опухолях

Рецепторы соматостатина (РС) и рецепторы дофамина (РД) широко распространены в нейроэндокринных новообразованиях [1, 2], которыми являются адренокортикотропин (АКТГ)-секретирующие опухоли гипофиза — кортикотропиномы (болезнь Иценко—Кушинга, БИК) и АКТГ-секретирующие опухоли негипофизарной локализации (АКТГ-эктопический синдром, АКТГ-ЭС) [3].

Методом выбора лечения пациентов с БИК и АКТГ-ЭС является хирургическое удаление опухолей [4, 5]. После нейрохирургического удаления кортикотропином длительная ремиссия достигается в 65—83% случаев, тогда как в остальных развивается рецидив или продолженный рост опухоли [6]. У пациентов с АКТГ-ЭС прогноз после лечения может зависеть от характера опухоли, степени злокачественности и распространенности метастазирования [7, 8]. Для больных с карциноидами различной локализации характерны относительно благоприятные результаты хирургического удаления опухоли. У пациентов с мелкоклеточным раком легких или медуллярным раком щитовидной железы могут развиваться регионарные и отдаленные метастазы. Результаты хирургического удаления таких новообразований во многом зависят от продолжительности ремиссии заболевания и возможности рецидива опухоли или развития метастазов с клиническими проявлениями АКТГ-зависимого гиперкортицизма [9].

По данным разных авторов [10, 11], наиболее перспективным консервативным методом лечения пациентов с БИК и АКТГ-ЭС, особенно тех, у кого не достигнута ремиссия после хирургического удаления АКТГ-секретирующих опухолей, является терапия аналогами соматостатина и/или агонистами дофамина. Эти препараты имеют сродство к РС 1, 2, 3, 5-го подтипов и РД 2-го подтипа (РД2) соответственно. Для выбора препарата необходима информация о наличии или отсутствии рецепторов определенных подтипов в опухолевых клетках, степени их экспрессии и распределении в опухоли [11, 12].

Иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) позволяет выявить конкретные подтипы РС и РД, их локализацию, степень экспрессии, гомогенное (все опухолевые клетки имеют рецепторы) или гетерогенное (часть опухолевых клеток не экспрессирует рецепторы) распределение в опухоли [1, 12]. ИГХИ дает возможность выявить локализацию рецепторов в опухолевых клетках или клетках окружающей неопухолевой ткани, сосудов, клетках воспалительной инфильтрации и др., где также могут встречаться РС. Таким образом, использование ИГХИ позволяет избежать возможных ложноположительных результатов при исследовании in vivo (фармакологическая проба с окреотидом [13], сцинтиграфия с введением меченых, аналогов соматостатина [14]).

В настоящем исследовании с помощью ИГХИ проведен сравнительный анализ экспрессии РС 1—5-го подтипов и РД2 в клетках кортикотропином и опухолей с эктопической продукцией АКТГ.

Материалом исследования служили данные медицинских карт и парафиновые блоки хирургически удаленной опухолевой ткани у 35 больных: 21 — с БИК и 14 — с АКТГ-ЭС.

Пациенты были обследованы, оперированы и наблюдались в течение от 3 мес до 8 лет после операции в Эндокринологическом научном центре или Национальном медико-хирургическом центре им. Н.И. Пирогова. Возраст больных с кортикотропиномами (БИК) составил от 24 до 52 лет. По данным гормонального анализа крови у всех пациентов выявлено нарушение ритма суточной секреции АКТГ и кортизола, повышение уровня свободного кортизола в моче. После проведения малой пробы с дексаметазоном у всех больных отмечали снижение уровня кортизола в крови менее чем на 50% (отрицательный результат), после большой пробы с дексаметазоном — более чем на 50% (положительный результат). По данным магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного мозга у всех больных диагностированы опухоли гипофиза, из них у 15 (62,5%) — микроаденомы, у 9 (37,5%) — макроаденомы. Всем больным выполнена трансназальная транссфеноидальная аденомэктомия. При гистологическом исследовании удаленной ткани аденом с применением ИГХИ с антителами к АКТГ выявлены кортикотропиномы гипофиза у всех больных (см. рисунок на цв. вклейке).

Возраст больных с АКТГ-ЭС составил от 19 до 55 лет. У больных данной категории было обнаружено нарушение ритма суточной секреции АКТГ и кортизола, повышение уровня свободного кортизола в моче. Малая и большая пробы были отрицательными у всех больных. При топической диагностике с использованием мультиспиральной компьютерной томографии у 12 из 14 (85,7%) пациентов были выявлены объемные образования в ткани легких. В правом легком образования (8) размерами от 1,0 до 5,1 см в максимальном измерении локализовались в верхней (1), средней (3) и нижней (4) долях, в левом легком (4) — в верхней (2) и нижней (2) долях. У одной пациентки диагностировано объемное образование в правой почке, еще у одной — в вилочковой железе. При гистологическом исследовании удаленных образований диагностированы мелкоклеточный рак (1), атипичные карциноиды (8), типичные карциноиды легких (3), атипичный карциноид вилочковой железы (1) и типичный карциноид почки (1) (рисунок В).

Все больные с кортикотропиномами, включенные в исследование, были отобраны «случайным» образом. Все случаи хирургически удаленных опухолей, ассоциированных с АКТГ-ЭС, собраны за период с 2000 до 2008 г.

Продукция АКТГ клетками опухолей различной локализации подтверждена с помощью ИГХИ с соответствующими первичными моноклональными антителами к АКТГ (NeoMarkers, США; разведение 1:100) (рисунок С, D). Характеристика первичных антител, использованных для выявления экспрессии РС и РД2, представлена в табл. 1.

В качестве вторичных антител и системы визуализации использован чувствительный комплекс универсальных антител с авидин-стрептавидинпероксидазной системой, не содержащей биотин (Nichirei, Япония).

Экспрессию рецепторов различных типов определяли как положительную при позитивной реакции более 30% опухолевых клеток и как отрицательную — в отсутствие реакции или позитивной реакции менее 30% опухолевых клеток.

В качестве положительного контроля использовали для РС ткань инсулиномы, для РД2 — ткань соматотропиномы. Негативным контролем служили срезы ткани исследуемых АКТГ-продуцирующих опухолей, на которые вместо первичных антител наносили раствор фосфатного буфера.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica for Windows, Statsoft Inc, версия 6,0. Анализ качественных признаков (частота экспрессии РС и РД2) в независимых группах (кортикотропиномы и эктопические АКТГ-продуцирующие опухоли) проводили с помощью критерия χ² с поправкой Йетса (для РС 1-го типа), точного критерия Фишера (односторонний тест) — для РС 2—5-го подтипов, РД2. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Иммуноэкспрессия РС 1—5-го подтипов (с преобладанием 1-го подтипа) и РД2 обнаружена с различной частотой во всех кортикотропиномах (см. рисунок E, G). Результаты определения частоты экспрессии рецепторов различных подтипов представлены в табл. 2.

В кортикотропиномах и опухолях с эктопической продукцией АКТГ выявлено преимущественно гетерогенное распределение РС- и РД2-позитивных клеток, характеризующихся цитоплазматической и мембранной реакцией.

Статистический анализ различий частоты экспрессии РС и РД2 в кортикотропиномах и опухолях с эктопической продукцией АКТГ позволил выявить в основном отсутствие статистически значимых различий (для РС1 р=0,62, для РС2 р=0,58, для РС3 р=0,08, для РС4 р=0,04, для РС5 р=0,58, для РД2 р=0,5). Не обнаружено клинических и морфологических особенностей опухолей, демонстрирующих коэкспрессию рецепторов различных типов и подтипов.

В настоящей работе показано, что в АКТГ-продуцирующих опухолях гипофиза и негипофизарной локализации экспрессированы и коэкспрессированы РС и РД2 в различных сочетаниях. Полученные результаты подтверждают данные ранее проведенных исследований D. Batista и соавт. [10] о том, что иммуногистохимический метод является весьма эффективным в обнаружении экспрессии рецепторов опухолевыми клетками, в частности нейроэндокринных новообразований. Теми же авторами [10] выявлена корреляция результатов ИГХИ с результатами, полученными при количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) при определении РС 1—5-го подтипов.

Полученные в нашем исследовании данные о высокой частоте экспрессии РС и РД2 в кортикотропиномах и опухолях с эктопической продукцией АКТГ можно использовать в обосновании целесообразности назначения пациентам аналогов соматостатина и агонистов дофамина. Известно [1], что среди РС выделяют 5 подтипов, которые отличаются по структуре, филогенетическим и фармакологическим свойствам, распределению в органах и тканях человека. РД подразделяют на Д1-подобные (к ним относятся подтипы РД1 и РД5), при активации которых происходит стимуляция аденилатциклазы и цАМФ, и Д2-подобные рецепторы (к ним относятся подтипы РД2, РД3, РД4), которые ассоциируются с подавлением активности аденилатциклазы и снижением цАМФ [2]. РС и РД являются рецепторами, функционально связанными с белками G. Стимуляция этих рецепторов приводит к подавлению секреции гормонов в гормонпродуцирующих опухолях, угнетению пролиферации клеток, уменьшению синтеза факторов роста и ангиогенеза в новообразованиях [10, 15]. При назначении аналогов соматостатина и агонистов дофамина с терапевтической целью необходимо учитывать ряд особенностей, в частности функционирования РС. Известно [2], что при избыточном уровне кортизола в крови в кортикотропиномах, с одной стороны, нарушается экспрессия РС 2-го подтипа, а с другой, изменяется присоединение соматостатина к РС 2-го подтипа за счет уменьшения участков связывания. Это подтверждается более выраженным эффектом октреотида (снижение уровней АКТГ и кортизола в крови, уменьшение размера опухоли) у пациентов с синдромом Нельсона по сравнению с таковым у больных с БИК. В данной ситуации возрастает роль РС 5-го подтипа, и лечение пазиреотидом больных с БИК может быть более эффективным [2].

В новообразованиях с эктопической продукцией АКТГ обнаружена экспрессия РС 2-го подтипа. Данный феномен можно объяснить особенностями пути передачи внутриклеточного сигнала от рецепторов глюкокортикоидов, отличного от такового, функционирующего в клетках кортикотропином [16]. Подтверждением тому могут служить результаты некоторых авторов [14], показавших, что при сцинтиграфии у ряда больных с АКТГ-ЭС возникают очаги накопления октреоскана в опухолях с эктопической продукцией АКТГ, в отличие от кортикотропином. Октреотид также угнетает продукцию АКТГ у таких больных эффективнее, чем у пациентов с БИК. Однако длительное лечение АКТГ-ЭС октреотидом может вызывать тахифилаксию [17].

R. Pivonello и соавт. [15] показали положительный лечебный эффект при назначении каберголина (1—3 мг в неделю в течение 20 мес) у пациентов с БИК, в кортикотропиномах которых была обнаружена экспрессия РД 2-го подтипа. У 3 больных из 11 была отмечена полная нормализация уровня свободного кортизола в моче, у 3 — значительное снижение. В остальных случаях в отсутствие экспрессии РД 2-го подтипа не наблюдали значительного снижения уровня кортизола в моче. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования с участием большего числа пациентов и длительным приемом препарата для подтверждения возможной корреляции между экспрессией РД 2-го подтипа в АКТГ-продуцирующих опухолях гипофиза и положительным эффектом лечения каберголином.

В исследовании R. Pivonello и соавт. [18] особенностей экспрессии РД 2—4-го подтипов и их изоформ (длинные и короткие) при помощи ИГХИ и ПЦР в опухолях с эктопической продукцией АКТГ (4 карциноида легких и по одному карциноиду вилочковой и поджелудочной железы) показано, что у 2 пациентов с экспрессией опухолевыми клетками РД2 (ИГХИ) и длинной изоформы РД2 (ПЦР), а также у одного пациента с экспрессией РД4 и короткой и длинной изоформ РД2 и РД4 выявлено значительное снижение уровня АКТГ в крови, кортизола в крови и моче через 3 мес после назначения каберголина. Через 5 мес после отмены препарата вновь был зарегистрирован рост уровня гормонов. У одного пациента, не ответившего на лечение каберголином, при ИГХИ опухоли выявлено незначительное количество клеток, экспрессирующих РД2, а при ПЦР — длинная изоформа РД2. Следовательно, необходимо дальнейшее исследование взаимосвязи экспрессии РД с терапевтическим эффектом агонистов дофамина.

Нейроэндокринные новообразования могут коэкспрессировать РС и РД, в настоящем исследовании подтверждением тому могут служить 6 кортикотропином и 4 опухоли, ассоциированные с АКТГ-ЭС. Ранее была выдвинута гипотеза, что РС и РД могут функционировать синергично [2]. М. Rocheville и соавт. [19] показали возможность гетеродимеризации РС5 и РД2 на примере стабильной культуры клеток СНО-К1. При стимуляции рецепторов двух подтипов соответствующими агонистами были обнаружены усиление их биологического влияния на подавление секреции АКТГ и антипролиферативный эффект. В связи с этим предложена концепция, обосновывающая одновременное назначение аналогов соматостатина и агонистов дофамина с лечебной целью пациентам с БИК и АКТГ-ЭС. Синтезирована молекула, содержащая структурные компоненты РС и РД и обладающая сродством в большей степени к РС2 и РД2, в меньшей степени — к РС5, а также способная подавлять выработку АКТГ и пролиферацию опухолевых клеток [2, 11]. При связывании гибридной молекулы происходит взаимодействие рецепторов между собой, что, возможно, обеспечивает развитие более выраженного терапевтического эффекта. Полагают [11], что эффект одновременной стимуляции рецепторов превзойдет воздействие на РС и РД по отдельности. В доступной литературе не найдено сведений о крупных испытаниях комбинированного препарата у больных с БИК и АКТГ-ЭС. Однако опубликовано описание случая [11], в котором пациенту было выполнено неполное удаление карциноида легкого, продуцирующего АКТГ, и, соответственно, не была достигнута ремиссия заболевания. В образце удаленной опухоли обнаружили коэкспрессию РС5 и РД2. В послеоперационном периоде был назначен ланреотид, после чего наблюдали лишь временную нормализацию уровня кортизола с последующим его ростом. После отмены ланреотида и назначения каберголина отмечали тот же результат. Дальнейшее одновременное применение двух препаратов привело к полной и продолжительной ремиссии заболевания.

Таким образом, определение экспрессии РС и РД в АКТГ-секретирующих опухолях гипофиза и негипофизарной локализации, а также изучение особенностей функционирования этих рецепторов в различных условиях и установление корреляции между экспрессией и лечебным эффектом соответствующих лекарственных препаратов может иметь не только теоретическое, но и практическое значение с точки зрения выбора адекватных методов лечения пациентов.

1. Во всех кортикотропиномах выявлена экспрессия РС 1—5-го подтипов с преобладанием по частоте экспрессии 1-го подтипа (57%). Коэкспрессия 2 подтипов РС и более констатирована в 81% кортикотропином. Экспрессия РД2 обнаружена в 52%, а коэкспрессия РС и РД2 — в 29% кортикотропином.

2. В 85% опухолей, ассоциированных с АКТГ-ЭС, выявлена экспрессия РС с преобладанием РС 3-го подтипа (72%). Коэкспрессия 2 подтипов РС и более обнаружена в 50% новообразований, 50% опухолей экспрессировали РД2. Коэкспрессия РС и РД2 констатирована в 38% случаев.

3. Не выявлено различий характера и частоты экспрессии РС и РД в кортикотропиномах и опухолях, ассоциированных с АКТГ-ЭС.

4. Полученные результаты экспрессии и коэкспрессии РС и РД могут служить теоретическим обоснованием для назначения аналогов соматостатина и агонистов дофамина с терапевтической целью у пациентов с АКТГ-продуцирующими опухолями гипофиза и негипофизарной локализации.