Злокачественные опухолевые процессы являются одной из основных причин заболеваемости и смертности населения [1]. Высокий уровень смертности при плоскоклеточном раке полости рта связывают с отсутствием специфических биологических маркеров, способных оказать помощь в определении опухолевой прогрессии и прогноза [2]. Полагают, что метастазирование опухоли обусловлено сочетанием различных прогностических факторов [3], хотя сами факторы, способствующие метастазированию, полностью не раскрыты [4].
Цель исследования — провести оценку влияния размера опухоли, степени ее дифференцировки и экспрессии опухолевыми клетками биологических маркеров на вероятность регионарного метастазирования.
Изучали материал, полученный от 80 больных плоскоклеточным раком языка без предшествующей противоопухолевой терапии, обследованных в радиологическом отделении Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба в период с 1990 по 2017 г. Возраст пациентов составил от 33 до 88 лет (средний возраст 57,5±10 года). Материал 53 (66%) наблюдений принадлежал лицам мужского пола и 27 (34%) — женского. Средняя продолжительность заболевания составила 5 мес. В 70 (88%) наблюдениях материал был биопсийный, а в 10 (12%) — операционный. В 9 (11%) наблюдениях опухоль располагалась в области корня языка, в 69 (89%) — в области тела языка. В соответствии с критериями классификации ВОЗ [5] наблюдения были разделены на высокодифференцированные (G1), умеренно-дифференцированные (G2) и низкодифференцированные (G3) плоскоклеточные раки. В соответствии с TNM-классификацией [6], учитывая размер опухоли, наблюдения представляли стадии T1, T2, T3, T4. Наличие или отсутствие регионарных метастазов подтверждено посредством обследования пациента, включая цитологическое исследование пунктата и ультразвуковое исследование регионарных лимфатических узлов.
Операционно-биопсийный материал фиксировали и подвергали гистологической проводке согласно общепринятым методикам. С помощью иммуногистохимического метода в клетках опухоли провели оценку экспрессии белков p53 (клон DO-7, RTU, «Dako», разведение 1:50), Ki-67 (клон MIB-1, RTU, «Dako», разведение 1:100), BCL-2 (клон 124, разведение 1:100), Cyclin D1 (клон AM29, «Zymed Laboratories», разведение 1:50), MMP-9 («Diagnostic BioSystems», разведение 1:40), CD 82/KAI1 (клон EP 160, «Epitomics», разведение 1:200). Экспрессию белков оценивали в клетках опухоли на микроскопе Nikon optiphot-2 при увеличении 100 (ок. ×10 и об. ×10) во всех полях зрения опухоли [7] и выражали в процентах от общего количества опухолевых клеток. В оценке иммуногистохимических микропрепаратов принимали участие два независимых исследователя.
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета Microsoft Excel 2007 и программы SPSS 11.5 для Windows. Оценку согласия распределения морфометрических показателей с нормальным законом осуществляли с помощью критерия Шапиро—Уилка. Поскольку анализируемые выборки были распределены ненормально, то для описания центральной тенденции распределения данных использовали медиану, нижний и верхний квартиль. Для сравнительного анализа частоты метастазирования в зависимости от размера опухоли использовали критерий Фишера φ. Для установки влияния всех изучаемых предикторных факторов на процесс метастазирования применяли бинарную логистическую регрессию, назначение которой состоит в оценке влияния независимых переменных (размер опухоли, степень ее дифференцировки, экспрессия белков клетками опухоли) на зависимую дихотомическую переменную (наличие/отсутствие метастазов). Для сравнения частоты случаев с наличием экспрессии CD82 в опухолевых клетках с частотой случаев с отсутствием экспрессии CD82 использовали биноминальный тест. Уровень значимости α для всех вычислений принимали равным 0,05.
Результаты
Сопоставление количества наблюдений размера опухоли (Т) со степенью опухолевой дифференцировки (G) показано в табл. 1. 
Таким образом, преобладающее количество наблюдений во время обращения пациента в клинику приходилось на стадии Т2 и Т3, а большая часть гистологически соответствовала высокодифференцированному и умеренно-дифференцированному раку.
Сопоставление между наличием/отсутствием метастазов в зависимости от размера опухоли (Т) показано в табл. 2. 
Из табл. 2 следует, что с возрастанием размера опухоли (Т) имеется тенденция к повышению и вероятности ее метастазирования в регионарные лимфатические узлы.
Для оценки степени влияния всей совокупности рассматриваемых факторов на вероятность метастазирования опухоли применена бинарная логистическая регрессия, результаты классификации которой показаны в табл. 3. 
Данная таблица показывает, что из 36 наблюдений без метастатического поражения лимфатических узлов программа корректно определила 29 (80,6%) наблюдений, а из 44 наблюдений с метастатическим поражением лимфатических узлов — 25 (56,8%) наблюдений. Общий процент правильно определенных наблюдений составил 67,5.
Далее, путем пошагового метода с включением значимых для метастазирования факторов из всех рассматриваемых (размер опухоли, степень дифференцировки, экспрессия биологических предикторов) программа выбрала только размер опухоли (табл. 4). 
Из табл. 4 следует, что из всех независимых переменных (размер опухоли, степень дифференцировки опухоли, экспрессия клетками опухоли предикторных белков) фактором, который влияет на процесс метастазирования программой, выбран только размер опухоли (Т). Более того, при стадии Т1 уменьшается вероятность наступления метастазирования по сравнению со стадией Т4 (использовался как референтный уровень), так как уровень значимости р=0,041, что меньше α (0,05). При этом стадии Т2 и Т3 не сопровождаются уменьшением вероятности метастазирования по сравнению с Т4, так как уровень значимости р=0,217 и 0,912 соответственно, что больше α (0,05).
Независимые факторы, исключенные программой как не имеющие влияния на вероятность метастазирования (p>0,05): степень опухолевой дифференцировки (G), экспрессия BCL2, p53, Ki-67, Cyclin D1, MMP9, CD82.
Ввиду неинтервенционности настоящего исследования следует отметить вероятность наличия ложноотрицательных результатов для следующих показателей: степень дифференцировки опухоли, экспрессия опухолевыми клетками BCL2, p53, Ki-67, Cyclin D1, MMP-9, CD82 при определении их влияния на процесс метастазирования. В связи с вышесказанным мощность логистической регрессии может оказаться недостаточной для обнаружения статистически значимых влияний, поэтому для уточнения результатов требуется дальнейшее исследование с увеличением объема выборки и компьютерных симуляций для определения мощности логистической регрессии для каждого конкретного показателя.
Для дополнительной проверки влияния размера опухоли на вероятность ее метастазирования проводили расчет критерия Фишера φ. При сравнении наблюдений T1 (n=17) и Т2 (n=31) (табл. 5) 
При сравнении наблюдений T2 (n=31) и Т3 (n=27) (табл. 6) 
При сравнении наблюдений T3 (n=27) и Т4 (n=5) (табл. 7) 
Результаты и обсуждение
В связи с высокой способностью к диссеминации плоскоклеточный рак полости рта является одной из наиболее тяжело контролируемых патологий [8]. Метастазы в регионарных лимфатических узлах встречаются в 15—60% наблюдений в зависимости от сочетания разных предикторов [3] и рассматриваются как один из прогностических для жизни пациента факторов [9]. Их наличие снижает общую выживаемость примерно на половину и увеличивает риск возникновения рецидивов [10]. Опухоли стадии Т1—Т2 характеризуются риском метастазирования в регионарные лимфатические узлы в 10 и 30% случаев соответственно [11], тогда как опухоли Т3 и Т4 характеризуются гораздо большим риском возникновения метастазов в шейных лимфатических узлах [12]. По мнению исследователей [13, 14], размер опухоли (Т) влияет на прогноз для пациента и может рассматриваться как предиктор метастазирования. Наши результаты подтверждают данные о том, что с увеличением размера опухоли статистически значимо увеличивается и вероятность ее метастазирования. Однако размер опухоли не учитывает ее индивидуальные гистологические, молекулярно-генетические характеристики и, следовательно, не может полностью предсказать метастатический потенциал [11]. Поэтому для предсказания биологического поведения опухоли создана гистологическая система градации, рекомендуются прогностические маркеры, такие как морфометрические, маркеры пролиферации, экспрессия опухолевыми клетками определенных белков [15]. Наши результаты не показали значимого влияния степени дифференцировки опухоли на процесс метастазирования, однако гистологические признаки плоскоклеточного рака изменчивы в разных полях зрения одной опухоли, что объясняется опухолевой гетерогенностью, интерпретация которой весьма субъективна при просмотре разными исследователями [16].
В настоящее время существует большое количество биологических маркеров, контролирующих пролиферацию, апоптоз, метастазирование опухолевых клеток, процессы неоангиогенеза, что послужило основой для разделения маркеров на группы [17], однако значимость экспрессии некоторых биологических маркеров для прогнозирования поведения опухоли спорная. Так, например, по мнению одних авторов [18], повышенная экспрессия регулятора клеточного цикла циклина D1 сочетается с более поздней стадией опухоли и сопровождается метастазами в регионарных лимфатических узлах, хотя другие [19] считают эти данные сомнительными. Мы не получили значимого влияния циклина D1 на процесс метастазирования (рис. 1). 
Прогностическая роль маркера клеточной пролиферации Ki-67 при плоскоклеточном раке области головы и шеи остается сомнительной [20]. Некоторые исследователи показали связь между высоким индексом пролиферативной активности Ki-67 при раке языка и неблагоприятным прогнозом [21], другие не нашли связи между экспрессией Ki-67 и метастазами в лимфатических узлах [22]. Мы также не обнаружили значимого влияния индекса пролиферативной активности Ki-67 на процесс метастазирования (рис. 2). 
Сообщается об ингибирующей роли фактора CD82/KAI1 на процессы метастазирования опухоли [29]. Так, в 97% наблюдений рака ротовой полости с метастазами наблюдалось снижение экспрессии KAI1 [30]. При помощи биноминального теста, проведенного по каждой стадии опухоли, мы показали, что только на стадии Т2 количество опухолевых клеток с отсутствием экспрессии CD82 было меньше, чем количество опухолевых клеток с ее наличием (р=0,03), а так как с увеличением размера опухоли, по нашим данным, увеличивается и вероятность ее метастазирования, можно полагать, что CD82/KAI1 принимает участие в этом процессе. При остальных стадиях рака языка значимых различий между количеством наблюдений, в которых количество опухолевых клеток, экспрессирующих и не экспрессирующих CD82, не получено. Следует отметить, что процент опухолевых клеток с экспрессией CD82 в преобладающем количестве наблюдений был низкий (преимущественно от 1 до 5) (рис. 6), 
Заключение
Для прогнозирования поведения плоскоклеточного рака языка изолированная оценка предикторных факторов может привести к ошибочным результатам, следовательно, для более объективной оценки необходимо одновременно учитывать совокупность как клинических, так и морфологических факторов, включая результаты иммуногистохимических исследований. Большая часть исследуемого материала опухолей данной локализации относится к биопсиям, по которым в ряде случаев достаточно трудно дать полноценную характеристику опухоли вследствие небольшого количества материала и известной гетерогенности ее гистопатологической картины. Оценка иммуногистохимической картины также может отличаться при анализе разными исследователями, в результате применения разных методологических подходов, что в последующем может оказать влияние на данные статистического анализа. В связи с этим необходимо стандартизировать методику оценки экспрессии биологических маркеров, а для объективности результатов подсчета применять компьютерные технологии.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Р.Ф.З.
Сбор и обработка материала — Р.Ф.З., В.В.П.
Статистическая обработка — Р.Ф.З.
Написание текста — Р.Ф.З.
Редактирование — Р.Ф.З., С.А.М., В.В.П., Ф.Е.С.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Зибиров Руслан Фяритович — врач-патологоанатом; e-mail: patologr@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-5252-0436