В настоящее время известно, что гиперкоагуляционное состояние на фоне опухолевого роста является одной из причин, способствующих прогрессированию новообразования за счет участия компонентов системы свертывания крови в процессе неоангиогенеза, роста и метастазирования опухоли [1—3]. В частности, повышенная экспрессия опухолью тканевого фактора, ракового прокоагулянта, повышение агрегационной активности тромбоцитов и концентрации адгезионных факторов способствуют прикреплению опухолевых клеток на сосудистый эндотелий, приводят к формированию фибринового матрикса и образованию опухолевых микротромбов [4—7]. Фибриновый матрикс действует и как основа для адгезии опухолевых клеток, и как депо ангиогенных ростовых факторов. В результате повышается выживаемость опухолевых клеток благодаря защите от механического и иммунного повреждения, происходят локальный рост опухоли и метастазирование [8].

Все вышеперечисленные и многие дополнительные механизмы взаимосвязи свертывающей системы и опухоли создают теоретические предпосылки влияния на опухоль путем регуляции активности системы свертывания. Насколько перспективно это направление – вопрос дискуссионный, однако накопились клинические и экспериментальные свидетельства действенности подобного подхода. В ряде ретроспективных исследований показано преимущество в выживаемости онкологических пациентов при использовании низкомолекулярных гепаринов (НМГ), хотя вопрос рутинного применения препаратов данной группы для противоопухолевой терапии остается открытым и до конца не решен [9—12].

Цель исследования — изучить противоопухолевую активность НМГ, их локальное действие на опухолевый рост, ангиогенез и метастазирование в эксперименте и у пациенток с местно-распространенным раком шейки матки.

Исследование проведено в два этапа: на лабораторных животных с перевиваемыми опухолями и у группы пациенток, страдающих местно-распространенным раком шейки матки (МР РШМ). В качестве НМГ использовали надропарин.

Экспериментальное исследование. Исследование выполнено на 50 белых беспородных крысах массой 120—150 г из вивария РНПЦ ОМР им. Н.Н. Александрова, которым была привита саркома М-1.

Правила содержания, ухода, кормления лабораторных животных осуществляли согласно действующей в Республике Беларусь надлежащей лабораторной практике: Технический кодекс установившейся практики (ТКП) 125–2008 (02040), утвержденный Постановлением Минздрава Республики Беларусь № 56 от 28.03.08 и требованиями гуманного обращения с экспериментальными животными, утвержденными в ГУ РНПЦ ОМР им. Н.Н. Александрова.

Были сформированы пять групп животных по 10 в каждой, в группах применяли различные виды воздействия: 1-я группа — контроль (здоровые животные); 2-я — интактные животные с опухолью; 3-я — животные с опухолью, у которых применяли НМГ; 4-я — животные с опухолью, получавшие контактную лучевую терапию (КЛТ); 5-я — животные с опухолью, получавшие КЛТ в сочетании с НМГ. КЛТ проводили на 7—11-е сутки по 3 Гр ежедневно. НМГ вводили на 7—11-е сутки по 100 Е/кг ежедневно. Крысам 1, 2 и 4-й групп, не получавшим НМГ, вводили подкожно по 0,1 мл физиологического раствора, 3-й и 5-й групп — по 0,1 мл физиологического раствора, содержащего 100 МЕ надропарина. КЛТ в суммарной дозе 15 Гр (5 фракций по 3 Гр ежедневно) осуществляли изотопом Ir-192 на аппарате microSelectron-HDR.

Введение надропарина и КЛТ начинали на 10-е сутки после перевивки и проводили ежедневно в течение 5 сут. На 3-и сутки после окончания курса у 3 крыс каждой группы проводили забор крови для исследования ангиогенных факторов путем декапитации животных.

Клиническое исследование. В проспективное рандомизированное исследование результатов применения НМГ на фоне химиолучевой терапии (ХЛТ) включены 85 пациенток с МР РШМ, которые лечились в отделении онкогинекологии ГУ РНПЦ онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова с 1 января 2011 г. по 31 декабря 2013 г. В группу ХЛТ вошли 42 пациентки (контрольная группа), в группу ХЛТ на фоне введения НМГ — 43 (основная группа), 5 пациенток отказались от применения экспериментального метода лечения уже после того, как прошли рандомизацию и были пролечены стандартным методом. По 2 пациентки из основной и контрольной групп не прошли ХЛТ в полном объеме из-за невозможности проведения КЛТ.

Схема лечения контрольной группы пациенток включала расщепленный курс сочетанной лучевой терапии с применением радиосенсибилизации цисплатином 40 мг/м² 1 раз в неделю. В основной группе с 3-х суток 2-го этапа лечения вводили надропарин из расчета 38 анти-Ха МЕ на 1 кг массы тела 1 раз в сутки подкожно в течение 21 сут лечения.

Статистическая обработка материала. Сравнение количественных показателей в группах проведено по непараметрическим критериям: двух независимых по критерию U Манна—Уитни, двух зависимых по критерию Уилкоксона, трех независимых по критерию Крускалла—Уоллиса, трех зависимых по критерию Фридмана. Все значения р были двусторонними. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Расчеты проводили в программном комплексе Statistica 10.0.

Результаты экспериментального лучевого лечения лабораторных животных с перевивной опухолью саркомы М-1 на фоне применения низкомолекулярных гепаринов. Динамика роста саркомы М-1 у крыс в исследуемых группах представлена на рис. 1.

В группе животных с перевитой саркомой М-1 наблюдали непрерывный рост опухоли в среднем с 1,03 см³ (SE 0,10 см³) на 10-е сутки до 25,22 см³ (SE 2,83 см³) на 21-е сутки (в 24,5 раза; р<0,001). Ни в одном случае не отмечено замедление роста опухоли. Интегральный параметр — площадь под кинетической кривой роста опухоли составил 96,5 см³ в сутки, индекс роста опухоли — 100%. У животных, которым вводили надропарин, так же как и в группе интактных животных с опухолью, наблюдали непрерывный рост опухоли, практически повторяющий динамику роста у интактных животных с опухолью. Площадь под кинетической кривой роста опухоли составила 91,3 см³ в сутки; индекс роста опухоли — 94,6%. У животных, которым проводили КЛТ, на всем протяжении времени эксперимента наблюдали выраженное торможение опухолевого роста. С 10-х до 21-х суток наблюдения опухоль увеличилась в среднем в 3,8 раза против 24,5 раза в группе интактных крыс с опухолью (р<0,001). Площадь под кинетической кривой роста опухоли составила 19,7 см³ в сутки; индекс роста опухоли — 20,4%. У животных группы, которым проводили КЛТ и вводили НМГ, также наблюдали выраженное торможение опухолевого роста. С 10-х до 21-х суток наблюдения опухоль увеличилась в среднем в 3,45 раза (р<0,001 в сравнении с группой интактных крыс с опухолью). Площадь под кинетической кривой роста опухоли составила 28,4 см³ в сутки; индекс роста опухоли — 29,4%.

Таким образом, в группах интактных животных с опухолью и при введении надропарина не отмечено ни клинически, ни статистически значимых различий (р=0,76), в то время как в группах животных, которым проводили КЛТ, замедление роста перевитой саркомы М-1 было клинически и статистически значимо (р<0,001). Влияния надропарина при проведении КЛТ на рост опухоли не установлено (р=0,69).

Для построения кривых выживаемости и сравнения групп по выживаемости излеченными животными (60 сут после перевивки опухоли без признаков опухолевого роста) считали живых на 60-е сутки. Следует отметить, что из каждой группы исключены по 3 особи, которым проводили забор крови для исследования ангиогенных факторов путем декапитации.

Гибель крыс с саркомой М-1 наблюдали начиная с 19-х суток после перевивки опухоли. В контрольной группе и после введения надропарина излеченных крыс не было. После КЛТ излечены 3 (43%) крысы из 7, после введения надропаринаи КЛТ — 2 (29%) из 7. На рис. 2 представлены

Можно обратить внимание на то, что характер кривых выживаемости близок в группах интактных животных и с введением надропарина и существенно отличается от групп КЛТ и КЛТ+надропарин. При сравнении 4 групп по выживаемости выявлены статистически значимые различия — Chi² = 12,1, df =3, p=0,007. Попарное сравнение показало, что выживаемость животных, у которых КЛТ дополнена введением НМГ, статистически значимо отличается от таковой интактных животных (р=0,006) и животных, у которых использовали только надропарин (р=0,006), а с группой, в которой применяли КЛТ как монотерапию, статистически значимые различия не установлены (р=0,88). Медианы выживаемости в группах составили 26,5, 30,5, 31,0 и 44,5 сут соответственно.

В табл. 1, 2

При анализе данных, приведенных в таблицах, можно сделать вывод, что наилучшие результаты по предотвращению увеличения концентрации фактора роста VEGF в плазме крови дает сочетанное воздействие надропарина и КЛТ (р=0,040 по сравнению с контрольной группой). КЛТ как монотерапия также дает статистически значимое уменьшение концентрации VEGF, применение надропарина в качестве монотерапии существенных результатов не приносит (р=0,13). Существует тенденция к снижению концентрации эпидермального фактора роста (EGF) при воздействии КЛТ, однако статистически значимых различий не установлено. Данные по концентрации фактора роста фибробластов в экспериментальных группах качественно повторяют картину сосудисто-эндотелиального фактора роста. Здесь также 4-я и 5-я группы статистически значимо отличаются от контрольной (р=0,049 и р=0,048 соответственно), лучшие результаты дает сочетанное воздействие надропарина и КЛТ.

Анализ сывороточных уровней факторов адгезии, ростовых и провоспалительных цитокинов и плазменных уровней показателей гемостаза у пациенток, страдающих местно-распространенным раком шейки матки. Для анализа степени отклонения сывороточных уровней факторов адгезии, ростовых и провоспалительных цитокинов у пациенток с МР РШМ от нормальных значений проведено сравнение с концентрацией указанных показателей в сыворотке крови 50 клинически здоровых женщин-доноров. Исследуемые показатели, за исключением FGF и ICAM-1, в группе пациенток с МР РШМ статистически значимо выше, чем в группе здоровых женщин, наибольшие клинически значимые различия установлены по уровням EGF (р<0,001), PECAM-1 (р<0,001), TNFα, (р<0,001) и IL-8 (р<0,001). Так, например, медиана показателя TNFα в группе пациенток с МР РШМ в 2 раза выше, чем в группе здоровых женщин (13,3 пг/мл против 6,5 пг/мл), медиана показателя IL-8 составляет 40,0 и 0,0 пг/мл соответственно.

Для всех исследуемых показателей в группе клинически здоровых женщин установлен референсный диапазон, нижняя граница которого определялась как 5-й процентиль в выборке, верхняя граница — 95-й процентиль. Превышение установленных пороговых значений отмечено у 22—72% онкологических пациенток: VEGF у 39% пациенток (р=0,044), EGF у 72%, FGF у 22% (р=0,18), sICAM-1 у 36%, sPECAM-1 у 66% (р<0,001), TNFα у 69% (р<0,001), IL-8 у 24% (р<0,001).

Проведена оценка плазменного звена системы гемостаза пациенток с МР РШМ ввиду участия ее в процессе прогрессирования злокачественных новообразований, а также для контроля изменения ее показателей в динамике противоопухолевого лечения с применением НМГ. Установлено существенное увеличение у пациенток с МР РШМ таких показателей, как содержание фибриногена и концентрация D-димеров, являющихся продуктами распада фибрина, что свидетельствует о значительном усилении процессов коагуляции–антикоагуляции. Можно сказать, что усиление указанных процессов и общее гиперкоагуляционное состояние являются естественной реакцией на высокий индекс стресса у пациенток с МР РШМ. В то же время, несмотря на гиперкоагуляцию, все показатели свертываемости крови в обеих группах далеки от значений, соответствующих опасности тромбоэмболических осложнений.

Далее проведен анализ сывороточных уровней факторов адгезии, ростовых и провоспалительных цитокинов и плазменных уровней показателей гемостаза у пациенток с МР РШМ в динамике противоопухолевого лечения. Лечение на 1-м этапе в основной и контрольной группах пациенток было одинаковым и заключалось в курсе дистанционно-лазерной терапии (ДЛТ) с радиосенсибилизацией цисплатином, поэтому анализ динамики указанных показателей проведен совместно для обеих групп. Как показал анализ, высокие уровни ростовых цитокинов в сыворотке крови у пациенток с МР РШМ до начала лучевого лечения снизились после проведения 1-го этапа лучевой терапии статистически значимо — р<0,001, р=0,007 и р=0,029 соответственно. При этом наблюдалась различная степень клинической значимости снижения уровня факторов роста — наиболее значимо (практически в 2 раза) снизился уровень эпидермального фактора роста, уровень фактора роста фибробластов клинически практически не изменился. Уровень провоспалительных цитокинов и молекул адгезии изменились клинически и статистически незначимо. По некоторым показателям гемостаза после проведенного пациенткам с МР РШМ курса ДЛТ произошел статистически значимый сдвиг в сторону гиперкоагуляции (показатели АЧТВ, АПФК, МНО), однако количественные изменения (медиана АЧТВ уменьшилась на 1,1 с, медиана АПФК — на 6%, медиана МНО — на 0,03) нельзя считать клинически значимыми. В то же время среднее значение показателя концентрации D-димеров увеличилось с 0,56 до 0,91 мкг/л, что указывает на усиление распада фибрина и может объясняться влиянием облучения на опухоль.

На 2-м этапе лечения пациентки получали курс ХЛТ: в основной группе с одновременным введением НМГ, в контрольной — без введения гепаринов. Анализ уровня факторов адгезии, ростовых и провоспалительных цитокинов показал, что по динамике в процессе противоопухолевого лечения исследуемые показатели можно условно разделить на два принципиально разных класса — с однонаправленной и разнонаправленной динамикой в основной и контрольной группах. К первому классу показателей относятся фактор роста VEGF, а также показатели IL-8, TNFα и PECAM (рис. 3).

Следует отметить, что разброс показателей внутри каждой из групп на каждом этапе противоопухолевого лечения значительно превышает изменения, происходящие в процессе воздействия ХЛТ и ХЛТ в сочетании с НМГ.

При анализе зависимости показателей гемостаза на фоне ХЛТ в основной и контрольной группах, также как и в случае с показателями ростовых и провоспалительных цитокинов и молекул адгезии, не установлено влияния НМГ на большинство показателей гемостаза (рис. 5).

Таким образом, в результате анализа динамики плазменных уровней ростовых и провоспалительных цитокинов, молекул адгезии и плазменных уровня показателей гемостаза у пациенток с МР РШМ в процессе противоопухолевого лечения установлено, что введение НМГ не изменило клинически значимо уровень указанных показателей в сравнении с таковыми у пациенток, которые получали ХЛТ без применения НМГ.

Непосредственные результаты лучевого лечения пациенток с местно-распространенным раком шейки матки на фоне применения низкомолекулярных гепаринов. Запланированный курс сочетанной лучевой терапии завершили 45 пациенток контрольной группы и 36 основной. Радиосенсибилизацию в связи с общими противопоказаниями не проводили 3 (8%) пациенткам основной группы и 3 (7%) контрольной, провели в полном объеме 24 (67%) и 26 (58%) пациенткам соответственно, не использовали на 2-м этапе в связи с лучевыми реакциями у 9 (25%) и 16 (36%) пациенток соответственно. Одновременное введение цисплатина в полном или редуцированном объеме осуществлено в 92% случаев в контрольной и 93% в основной группе.

Лучевые реакции отмечены у 21 (58%) пациентки в группе, получавшей ХЛТ с НМГ, и у 19 (42%) пациенток в группе с ХЛТ без НМГ (р=0,22). Сочетание разных видов лучевых реакций наблюдалось у 9 (25%) пациенток основной группы и у 5 (11%) контрольной (р=0,18). Доли пациенток с лучевыми реакциями 2—3-й степени в основной и контрольной группах практически совпадали — 28 и 29% соответственно (р=0,89).

Лучевые осложнения лечения диагностированы у 9 (11%) пациенток в сроки от 9,1 до 47,9 мес (медиана 18,2 мес): у 2 (6%) пациенток основной группы и у 7 (16%) контрольной группы (р=0,29).

Для оценки эффективности химиолучевого воздействия, в том числе и с применением НМГ, рассчитывали степень регрессии опухоли. Для этого измеряли максимальный размер опухоли на МР-изображениях до и после лечения и использовали критерии RECIST: полная регрессия — полное исчезновение опухоли, частичная регрессия — уменьшение более чем на 30%, стабилизация — уменьшение менее чем на 30% или увеличение до 20%, прогрессирование — увеличение более 20% [13]. Указанные параметры исследованы у всех пациенток, завершивших лечение (табл. 3).

Согласно данным табл. 3, непосредственные результаты лечения в группах полностью совпадают (р=1,0): полных регрессий зафиксировано по 47% в каждой группе, частичных регрессий — по 42%, стабилизация опухолевого процесса — по 11%, прогрессирование заболевания к моменту завершения лечения не зафиксировано ни в одной из исследуемых групп. Таким образом, в результате проведения клинического исследования влияния НМГ на первичную излеченность опухоли не установлено.

1. На основании полученных в эксперименте данных установлено, что введение низкомолекулярных гепаринов на фоне КЛТ вызывает значительное торможение роста саркомы М-1, приводит к излечению 29% (95% ДИ 4—71%) животных; статистически значимо (р=0,006) увеличивает выживаемость в сравнении с интактными животными с опухолью. Не установлено статистически значимых различий в выживаемости животных в группах с КЛТ и КЛТ с НМГ (р=0,88), при этом 60-суточная выживаемость составляет 43 и 29% соответственно, а медиана выживаемости — 31 и 44,5 сут. Перевивка саркомы М-1 вызывает увеличение концентрации всех ангиогенных факторов в сыворотке крови животных. Проводимая противоопухолевая терапия в виде КЛТ в суммарной дозе 15 Гр, а также сочетание КЛТ с подкожным введением НМГ вызывает снижение уровней факторов роста.

2. Анализ сывороточных уровней факторов адгезии, ростовых и провоспалительных цитокинов и плазменных уровней показателей гемостаза у пациенток с МР РШМ в динамике противоопухолевого лечения не выявил клинически значимых изменений указанных показателей при использовании в лучевом лечении НМГ по сравнению с ХЛТ как монотерапией.

3. Непосредственные результаты лучевого лечения в группах пациенток с МР РШМ с введением и без введения НМГ не различаются (р=1,0). Таким образом, не установлено влияния применения НМГ на первичную излеченность опухоли, что вполне согласуется с динамикой проанализированных показателей крови.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — О.П.М., В.И.П., Л.В.М., О.Г.С.

Сбор и обработка материала — О.П.М., Л.В.М.

Статистическая обработка — Л.В.М.

Написание текста — О.П.М., Л.В.М.

Редактирование — О.П.М., Л.В.М., О.Г.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Матылевич Ольга Павловна — канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаборатории онкогинекологии;