Рак легкого (РЛ) — наиболее распространенное в мире злокачественное новообразование, которое стабильно занимает 1-е место. По данным Международного агентства по изучению рака, в мире ежегодно диагностируют более 1 млн новых случаев РЛ. В России Р.Л. находится на 2-м месте в общей структуре онкологических заболеваний (11,6%) и на 1-м месте (20,4%) среди злокачественных опухолей у мужчин. Одной из основных проблем остается поздняя диагностика Р.Л. Удельный вес больных РЛ I—II стадии составляет 27,3%, III стадии — 30,3%, IV стадии — 40% [1]. Несмотря на совершенствование методов диагностики и лечения 5-летняя выживаемость после лечения больных РЛ не превышает 15—20%. Летальность больных в течение первого года с момента установления диагноза РЛ составляет 50,5% [2]. По предварительным данным использование низкодозной компьютерной томографии в скрининговых программах позволяет увеличить выявление периферического РЛ на ранней стадии развития, что приводит к улучшению отдаленных результатов лечения. Однако остается актуальным улучшение диагностики центрального РЛ (ЦРЛ) на ранней стадии развития, когда современные органосохраняющие эндоскопические методы лечения наиболее эффективны.

По данным отечественной литературы, во время стандартной бронхоскопии эффективность выявления раннего ЦРЛ составляет 74% [2], а ранний ЦРЛ (рак in situ и микроинвазивный рак) диагностируется только у 0,44% больных [2] и, как правило, является случайной находкой. В Японии скрытый рентгенонегативный ЦРЛ в группе высокого риска (злостные курильщики, лица с профессиональной вредностью, пациенты с хроническими заболеваниями легких, мужчины старше 50 лет) выявляется у 11,4% обследованных пациентов [3]. Высокая частота выявления раннего ЦРЛ в Японии связана с наличием разработанных рекомендаций и современного эндоскопического оборудования высокого разрешения с возможностью мультимодального исследования, которое позволяет выявить очаги предрака и раннего рака, а также проводить структурный анализ с большим оптическим увеличением [4].

История совершенствования эндоскопических технологий в бронхологии имеет три основных периода.

1. Первый период начался в конце XIX века и продолжался до конца 50-х годов ХХ века, когда бронхоскопию выполняли под местной анестезией с помощью ригидных эндоскопов. Первую бронхоскопию выполнил G. Killian в 1897 г., во время которой было извлечено инородное тело из трахеи [5]. В последующем C. Jackson в 1903 г. усовершенствовал конструкцию бронхоскопа, обосновал применение биопсии и внедрил методику бронхографии через бронхоскоп. C. Jackson также используя собственную модель бронхоскопа, впервые произвел удаление «аденомы» правого главного бронха с восстановлением просвета [6]. В 1908 г. W. Brunings (ученик G. Killian) сконструировал бронхоскоп с дистальным освещением, который использовался врачами-бронхологами вплоть до 50-х гг. XX в. [6, 7].

2. Второй исторический период начинается в 1956 г., когда H. Friedel сконструировал ригидный бронхоскоп для выполнения эндоскопического исследования под наркозом с искусственной вентиляцией легких [8, 9]. Ригидный бронхоскоп H. Friedel используется для выполнения эндоскопических операций в большинстве ведущих клиник мира до настоящего времени.

3. Началом третьего, современного этапа в развитии бронхоскопии связано с именем S. Ikeda, который разработал гибкий бронхоскоп и первым выполнил бронхофиброскопию в 1968 г. [8, 9]. Изобретение S. Ikeda бронхофиброскопа расширило возможности как диагностической, так и лечебной бронхоскопии. Стал возможным осмотр бронхов до VI порядка, используя местную анестезию [9, 10]. Один из недостатков бронхофиброскопов — это частое разрушение оптического фиброволокна при сильном сдавливании или перегибе. Дальнейшее совершенствование гибкой эндоскопии было связано с созданием в 1984 г. в США первых видеоэндоскопов [8—10]. Благодаря использованию миниатюрных встроенных цифровых видеокамер и системы линз стало возможным получить высококачественное изображение с увеличением до 100 раз [9, 10]. Сегодня в ряде ведущих клиник используются видеобронхоскопы с высоким разрешением (WLI-HD), которые были созданы в 2005—2007 гг., и позволяют визуализировать эндоскопическое изображение более высокой четкости (1920∙1080 точек на дюйм), чем при эндоскопии стандартного разрешения 720∙576 точек на дюйм [11].

Так как использование компьютерной томографии не решает проблему выявления скрытых, рентгенонегативных форм ЦРЛ, одновременно с совершенствованием конструктивных особенностей бронхоскопов в течение последних лет были разработаны и усовершенствованы различные методики повышения эффективности выявления раннего скрытого ЦРЛ [4]. В 1979 г. D. Doiron, A. Profio впервые применили метод флюоресцентной бронхоскопии с производным гематопорфирина (HPD), а в 1991 г. G. Hung и S. Lam заложили основы аутофлюоресцентной и фотодинамической диагностической бронхоскопии, получивших развитие в работах R. Baumgartner, K. Hauzinger и H. Kato [8]. Флюоресцентная бронхоскопическая диагностика основана на избирательности накопления экзогенных и индуцированных эндогенных фотосенсибилизаторов в ткани злокачественной опухоли и возможности его обнаружения по характерной флюоресценции. Флюоресцентная бронхоскопия с экзогенными фотосенсибилизаторами (HPD, фотофрин II, фотогем, фотосенс и др.) как самостоятельный метод ранней диагностики ЦРЛ не получила широкого распространения из-за высокой стоимости препаратов, замедленной кинетики выведения фотосенсибилизаторов и длительной кожной фототоксичности [12]. Наиболее эффективным для поиска очагов раннего ЦРЛ общепризнан метод аутофлюоресцентной бронхоскопии, который имеет высокую чувствительность, хоть и низкую специфичность. В МНИОИ им. П.А. Герцена в 1992—2000 гг. (проф. В.В. Соколов) совместно с сотрудниками Института общей физики РАН (проф. В.В. Смирнов, к. ф-м.н. Н.Н. Булгакова, к. ф-м.н. В.Э. Фабелинский) был разработан и применен в клинике метод комплексного флюоресцентного бронхоскопического исследования (AFI, PDD, LFS) для поиска и выявления скрытых форм предрака и раннего ЦРЛ [13]. Использование узкоспектральной эндоскопии (NBI) в сочетании с виртуальной спектроскопией и оценкой индекса гемоглобина (iHb) позволяет оценивать аномалию капиллярной сети в области очагов предрака и раннего РЛ, а также определять границы опухолевого поражения [14].

Принцип NBI состоит в элиминации из испускаемого источником света красной спектральной составляющей и эндоскопического осмотра слизистой оболочки в сине-зеленой части спектра, соответствующей пикам поглощения света гемоглобином. В зеленой части спектра визуализируются венулы подслизистого слоя, а в синем свете определяются капилляры слизистой оболочки. Применение NBI-бронховидеоскопии позволяет оценивать архитектонику слизистой оболочки и аномалию капиллярной сети слизистой оболочки бронхиального дерева [14].

В настоящее время в МНИОИ им. П.А. Герцена применяется несколько методик бронхоскопической диагностики раннего ЦРЛ: бронховидеоскопия в белом свете с высоким разрешением (WLI-HD); узкоспектральная бронховидеоскопия (NBI); аутофлюоресцентная бронховидеоскопия (AFI); аласенсиндуцированная флюоресцентная бронхоскопия (PDD); локальная флюоресцентная спектроскопия (LFS); адаптивная цифровая эндоскопическая спектроскопия с оценкой индекса гемоглобина (iHb) [13, 15].

Использование методик мультимодальной эндоскопической диагностики открывает возможности для повышения эффективности выявления скрытых ранних форм ЦРЛ.

Следующим этапом развития современных технологий является разработка методик прижизненной микроскопической диагностики очагов предрака и раннего ЦРЛ [16]. В настоящее время во многих странах мира ведутся экспериментальные и клинические исследования возможностей эндоцитоскопии и конфокальной лазерной эндомикроскопии в качестве методов эндоскопической «оптической биопсии», оптической когерентной томографии и эндобронхиальной ультрасонографии для оценки уровня опухолевой инвазии во время эндоскопического исследования [17].

При эндоцитоскопии проводится исследование поверхности слизистой оболочки с оптическим увеличением изображения от 380 до 1150 раз, что обеспечивает визуализацию ее тканевой и клеточной структуры [18]. Имеются единичные публикации японских экспертов об исследовании возможностей эндоцитоскопии в уточняющей диагностике предопухолевой патологии и раннего ЦРЛ [17]. Ограничение в использовании данного метода диагностики связано с небольшим количеством прототипов бронхоскопов для эндоцитоскопического исследования. Для исследования слизистой оболочки трахеобронхиального дерева в большинстве публикаций использовался прототип эндоцитоскопа Olympus XEC-300 °F с увеличением изображения в 570 раз, диаметром 3,2 мм, который вводится в инструментальный канал (диаметр 4,2 мм) терапевтического (диаметр 6,9 мм) бронховидеоскопа. Как и для традиционного цитологического исследования, для эндоцитоскопии необходимо окрасить клеточные структуры поверхностного слоя слизистой оболочки для их четкой визуализации [18]. И если при цитологическом исследовании ex vivo возможно использовать любые виды красителей независимо от их токсичности, то для прижизненной эндоцитоскопии возможно применение только витальных красителей, разрешенных к применению при эндоскопическом исследовании. По данным литературы, при эндоцитоскопии используются три вида красителей: метиленовый синий, толуидиновый синий и кристальный фиолетовый. В ряде исследований по аналогии с исследованием слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта был использован 0,5% раствор метиленового синего [19].

Основной задачей витальной окраски слизистой оболочки исследуемого при эндоцитоскопии полого органа является визуализация ядер эпителиоцитов с оценкой ядерного полиморфизма, изменения формы, размера, полярности расположения ядер [18]. Первые публикации с оценкой возможностей эндоцитоскопии принадлежат проф. H. Inoue, разработавшему первую классификацию внутриэпителиальных капиллярных петель слизистой оболочки пищевода и первую эндоцитоскопическую классификацию изменений плоского эпителия пищевода [20]. Эндоцитоскопические критерии атипии плоского эпителия с высокой точностью характеризуют этап неопластической прогрессии плоского эпителия, выстилающего рото-, гортаноглотку и гортань. Клеточная атипия 1-й степени по предложенной классификации соответствует нормальному эпителию, в то время как атипия 5-й степени с высокой долей вероятности соответствует плоскоклеточному раку классификации ECA (EndoCytoscopic Atypia) [21].

По мнению К. Shibuya и соавт. [21], при эндоцитоскопическом исследовании диспластическим изменениям плоского эпителия бронхиального дерева может соответствовать наличие округлых несколько полиморфных гиперхромных ядер клеток. При этом отмечается снижение ядерно-цитоплазматического отношения с увеличением доли цитоплазмы в клетках. Можно также говорить о некотором нарушении регулярности расположения клеток эпителия. При плоскоклеточном раке трахеи и бронхов в отличии от дисплазии плоского эпителия ядерно-цитоплазматическое отношение увеличивается, ядра клеток становятся резко полиморфными, клетки располагаются скученно, отмечается формирование перетяжек между клетками. Аденокарцинома характеризуется наличием частично разрушенных железистых структур, выполненных резко полиморфными крупными гиперхромными ядрами опухолевых клеток [21].

Параллельно с эндоцитоскопией ведутся экспериментальные исследования оценки возможностей конфокальной лазерной эндомикроскопии (КЛЭ) в диагностике ЦРЛ. КЛЭ позволяет непосредственно в процессе эндоскопического исследования оценивать тканевую и клеточную структуру слизистой оболочки исследуемого органа in vivo без выполнения биопсии. Для проведения КЛЭ используется лазер длиной волны 488 нм, расположенный в рабочей станции, который генерирует излучение и передает его с помощью системы зеркал, осциллирующей во взаимоперпендикулярных направлениях. На выходе из эндомикроскопической системы лазерный луч проходит через многоволоконный фиброоптический зонд и попадает на поверхность исследуемой ткани. Часть света поглощается, а индуцируемый лазером эффект флюоресценции вызывает свечение тканей, которое идентифицируется блоком регистрации флюоресценции, увеличивается с использованием системы линз и обрабатывается процессором эндомикроскопической системы, что в конечном итоге позволяет получить динамическое монохромное изображение, сходное с морфологическим, на мониторе [22]. В настоящее время для проведения КЛЭ доступны эндомикроскопические системы двух производителей — «Pentax Medical», Япония, и «Mauna Kea Technologies», Франция.

Исторически первой была представлена эндомикроскопическая система Pentax Medical ISC-1000, основанная на технологии австралийского разработчика оптической техники Optiscan. Конфокальный датчик в данной установке встроен непосредственно в сам эндоскоп. Источником света для флюоресценции в данной системе служит твердотельный голубой сканирующий лазер с длиной волны 488 нм и мощностью менее 1 мВт. Частота сканирования лазерного луча составляет 1,6 кадра в секунду с разрешением 1024∙512 точек на дюйм и 0,8 кадра в секунду с разрешением 1024∙1024 точек на дюйм. Толщина оптического среза ткани, обеспечиваемого эндомикроскопической системой Pentax ISC-1000, составляет 7 мкм, плоскостная разрешающая способность 0,7 мкм при поле зрения 475∙475 мкм [23]. По данным компании «Pentax», сравнительное увеличение получаемого при конфокальной эндомикроскопии изображения достигает 1000 раз. Данная эндомикроскопическая система комплектуется конфокальным лазерным гастроскопом Pentax EG-3870CIK диаметром 12,8 мм и длиной вводимой части 1050 мм [24].

Вторая система представлена прибором Cellvizio, выпущенным компанией «Mauna Kea Technologies» (Франция). Для исследования бронхолегочной системы применяются эндомикроскопические зонды Alveoflex, разрешающая способность которых достигает 3,5 мкм, диаметр оптического поля составляет 600 мкм, глубина исследования 50 мкм. Мини-зонд проводится через инструментальный канал эндоскопа, минимальный требуемый диаметр инструментального канала, позволяющий провести зонд, должен быть не менее 2,2 мм, что позволяет использовать подавляющее большинство бронхоскопов, представленных на рынке. КЛЭ проводится непосредственно во время бронхоскопии после завершения этапа общего рутинного эндоскопического исследования [23].

Первое упоминание о применении КЛЭ относится к 2004 г. у больных колоректальным раком [25]. В дальнейшем данный метод стал применяться для диагностики in vivo воспалительных заболеваний толстой кишки, желчевыводящих протоков и двумя годами позже появилась первая публикация о его возможной роли в диагностике патологии дистальных отделов дыхательных путей [26]. Важно отметить, что до появления КЛЭ осмотреть бронхи диаметром менее 3 мм с использованием бронхоскопа не представлялось возможным. До настоящего времени эндобронхиальная диагностика патологии in vivo дистально расположенных отделов бронхов и структур паренхимы легкого оставалась невозможной и реализовывалась только при патогистологическом исследовании полученных при биопсии фрагментов ткани или косвенно при цитологическом анализе материала бронхоальвеолярного смыва (лаважа). В настоящее время имеется большое число публикаций клинических исследований эффективности КЛЭ при патологии желудочно-кишечного тракта и лишь единичные публикации, описывающие данную методику при исследовании дыхательных путей. Так, L. Thiberville и соавт. [21] опубликовали изображения, получаемые при альвеолоскопии, когда КЛЭ проводится без введения экзогенных флюорофоров. В этом исследовании были описаны структуры альвеолы, которые становятся видимыми за счет индуцированного свечения соединительнотканных структур (коллаген, эластин), основываясь на принципах аутофлюоресценции [27, 28].

В России имеется ряд публикаций проф. Ф.Г. Забозлаева и соавт., в которых представлены клинические исследования КЛЭ с использованием эндомикроскопической системы Cellvizio и зонда Alveoflex («Mauna Kea Technologies», Франция) для изучения патологии ацинусов в реальном режиме времени [29]. КЛЭ позволяет получить информацию о состоянии эластиновых волокон, которые входят в состав стенки терминальных отделов дыхательных путей [30, 31]. В одном клиническом наблюдении описано выявление инвазивного легочного аспергиллеза у женщины 41 года при помощи КЛЭ in vivo. При проведении КЛЭ были получены признаки частичного разрушения эластиновых волокон альвеолярной мембраны и флюоресцентное свечение фибриновых волокон в этой зоне [32]. Однако авторы исследования отмечают, что без использования экзогенных флюорофоров невозможно оценить состояние ядерно-цитоплазматического отношения клеточных структур эпителия трахеобронхиального дерева.

Для решения вопроса визуализации клеточных структур при выполнении КЛЭ необходимо использование экзогенных флюорофоров, которые должны иметь флюоресценцию в диапазоне длины волн 505—550 нм при освещении его сканирующим лазером эндомикроскопа длиной волны 488 нм [23].

В 2010 г. с целью решения проблемы применения экзогенных флюорофоров при КЛЭ дыхательных путей по аналогии с удачным опытом применения КЛЭ в колоноскопии, где отмечен высокий уровень накопления красителя в кишечном эпителии, F. Fuchs и соавт. [32] попытались использовать флюоросцеин натрия. Однако авторы не обнаружили ожидаемого накопления флюоресцеина натрия в эпителии трахеи и бронхов. В 2013 г. авторы опубликовали данные о возможности использования в качестве экзогенного флюорофора акрифлавина для проведения КЛЭ, что позволило визуализировать клетки эпителия. В исследование были включены 32 пациента с подозрением на ЦРЛ, которым было проведено комплексное эндоскопическое исследование, включающее КЛЭ с прицельной биопсией. При сравнительном анализе гистологических препаратов и снимков КЛЭ точность диагностики ЦРЛ составила 91% [33]. Ряд экспериментальных исследований показали блокирующее воздействие акрифлавина на механизмы синтеза и репарации ДНК, вследствие чего данный препарат был запрещен для применения при исследованиях in vivo в Российской Федерации и ряде других стран.

Альтернативный метод визуализации клеток эпителия трахеобронхиального дерева был предложен L. Thiberville и соавт. с использованием в качестве экзогенного флюорофора метиленового синего с лазерным излучением на длине волны 660 нм [34].

В ряде публикаций к настоящему моменту при сопоставлении данных гистологического исследования с данными КЛЭ определены критерии дифференциальной диагностики нормальной слизистой оболочки, а также опухолевой ткани и предраковых изменений. Данные критерии включали в себя характеристику ядерно-цитоплазматического соотношения и тканевой архитектоники.

В МНИОИ им. П.А. Герцена разработка эндоскопических методов раннего выявления скрытого ЦРЛ ведется с 1984 г. За последние 30 лет было обследовано более 16 тыс. пациентов из групп высокого риска развития Р.Л. Было выявлено 172 случая раннего ЦРЛ у 125 больных. Изучены и классифицированы эндоскопическая семиотика, различные формы роста и локализации «малых» опухолей слизистой оболочки бронхов. Исследованы возможности стандартной бронховидеоскопии в белом свете (WLI), флюоресцентной диагностики с использованием локальной флюоресцентной спектроскопии (LFS) на установке Спектр-Кластер (ИОФ РАН, Россия), комбинации методов аутофлюоресцентной (AFI), 5-ALК-индуцированной флюоресцентной бронхоскопии (D-light AF system, фирма «Karl Storz») и иммуноцитохимического исследования MUC-1 в покровном эпителии слизистой оболочки бронхов с помощью МКАТ ИКО 25. С 2009 г. в нашем институте изучаются возможности мультимодальной эндоскопической диагностики с использованием бронховидеоскопии с высоким разрешением (WLI+HD) и NBI-режимом, LFS и метод регистрации индекса гемоглобина в тканях. Показатели чувствительности и специфичности при использовании мультимодальной бронхоскопии с целью выявления скрытых очагов раннего ЦРЛ превысили 90%. В последующем благодаря применению эндобронхиальных методов лечения удалось добиться полной регрессии очагов в 89%, а при размере опухоли до 1 см по плоскости полная регрессия составила 100% [13].

С 2015 г. по настоящее время в отделении эндоскопии МНИОИ им. П.А. Герцена накоплен первый клинический опыт мультимодального эндоскопического исследования, включающего конфокальную лазерную эндомикроскопию и эндоцитоскопию, с целью диагностики раннего ЦРЛ (рис. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8).

К настоящему времени нами обследованы 12 больных ЦРЛ. Для проведения КЛЭ (ex vivo, in vivo) использовали эндомикроскопическую лазерную систему Cellvizio компании «Mauna Kea Technologies». В качестве экзогенных флюорофоров применяли 0,02% раствор акрифлавина гидрохлорид (ex vivo) и 0,01% раствор профлавина ацетат. Метод может быть использован при стандартной бронхоскопии, когда для эндомикроскопии через инструментальный канал бронхоскопа вводят мини-зонд в просвет дыхательных путей и прислоняют к поверхности исследуемого участка слизистой оболочки бронха. В процессе эндомикроскопии с увеличением в 1000 раз записывается и архивируется монохромное изображение тканевых и клеточных элементов (см. рис. 6), которое в последующем анализируется подготовленным врачом-эндоскопистом.

Для эндоцитоскопии слизистой оболочки бронхиального дерева (ex vivo) применяли специальную модификацию прототипа эндоцитоскопа Olympus XEC-300 °F, диаметром 3,2 мм, обеспечивающую увеличение изображения в 570 раз. Для окраски слизистой оболочки бронхиального дерева использовали 0,5% раствор метиленового синего. Фокусное расстояние для эндоцитоскопа Olympus XEC-300 °F составляет 30 мкм, т. е. для обеспечения четкости картинки дистальный конец эндоцитоскопа должен быть практически вплотную подведен к слизистой оболочке. После контакта эндоцитоскопа с поверхностью опухоли или слизистой оболочки анализируется полученное изображение, оценивается расположение и полярность эпителиоцитов, форма и размер ядер клеток, а также ядерно-цитоплазматическое отношение (см. рис. 8).

Такой подход можно считать прижизненным оптическим морфологическим исследованием. В процессе дальнейших клинических исследований будет проведено клинико-морфологическое сопоставление результатов обследования для разработки критериев эндоцитоскопической прижизненной диагностики РЛ.

Таким образом, современные методы эндоскопической диагностики злокачественных опухолей позволяют переходить от выявления и оценки макроскопических признаков опухолевого поражения к разработке микроскопической семиотики предраковых состояний и раннего рака с оценкой микроструктурных изменений покровного эпителия слизистой оболочки, особенностей оптической спектральной характеристики, аномалий капиллярной сети слизистой оболочки и подслизистого слоя, особенностей метаболизма, оксигенации и пролиферативной активности в зоне неоплазии [34].

Технология КЛЭ и эндоцитоскопии, вероятно, может помочь в навигации трансбронхиальной биопсии, позволяя определять оптимальное направление для биопсийных щипцов при определении патологически измененной зоны, в реальном времени сделать предварительное морфологическое заключение. Вслед за этим исследователь выполняет таргетированную щипцовую биопсию для гистологического исследования и верификации диагноза.

При выборе метода эндобронхиального лечения раннего ЦРЛ важным является высокая точность в оценке реального размера первичной опухоли, ее гистологического строения, глубины инвазии в стенку бронха и исключении явного или скрытого метастазирования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.