Опухоли головы и шеи занимают одну из лидирующих позиций по встречаемости среди злокачественных новообразований. Распространенным типом этих опухолей является плоскоклеточный рак ротоглотки (ПРР), 60% случаев которого ассоциировано с присутствием вируса папилломы человека (HPV). HPV-позитивный (HPV+) ПРР в отличие от HPV-негативного (HPV–) имеет хороший ответ на лечение, основанное на применении агентов, повреждающих структуру ДНК (производные платины, радиооблучение), однако механизмы, лежащие в основе этого феномена, неясны. Кроме того, тяжесть побочных эффектов комбинированной терапии заставляет исследователей искать новые подходы к лечению ПРР.

Материал и методы. Материалом исследования явились полученные интраоперационно фрагменты HPV+ и HPV– ПРР, выделенные из них первичные культуры клеток, а также клеточные линии ПРР (HPV+ — SCC090, UMSCC47, HPV– — FaDu, SCC61, SCC35, JHU012), hTERT-иммортализованные кератиноциты человека, nude мыши. Экспрессия белков PARP1, XRCC1 установлена методом reverse phase protein array (RPPA). Активность PARP в лизатах клеток и тканей определена в ИФА по поли (ADP)рибозилированию гистонов и по количеству остатков поли (АDP)рибозы (PAR) (вестерн-блот, иммуногистохимия). Ядерные фокусы белков визуализированы с помощью конфокальной флюоресцентной микроскопии. Одноцепочечные разрывы ДНК (ОРДНК) оценены в тесте ДНК-комет. Экспрессия генов установлена методом qRT-ПЦР. Оверэкспрессия и knock-down генов HPV16 проведены с помощью Lipofectamine 2000. Вирус HPV16 выделен из культуральной среды первичных клеток путем ее концентрирования в ПЭГ-4000. Вирусная ДНК была изолирована с помощью набора PureLink viral DNA/RNAkit («Invitrogen»). Терапевтический эффект цисплатина и PARP-ингибитора олапариба («Astra Zeneca») был оценен in vivo на модели подкожного роста клеточной линии UMSCC47. Действие олапариба на клеточную пролиферацию определено в WST-тесте in vitro и по окраске опухолевой ткани Ki67. Обработка полученных данных проводилась методами статистического анализа.

Результаты. Анализ содержания ключевых белков репарации ОРДНК PARP1 и XRCC1 в лизатах опухолей с помощью RPPA показал их увеличение у пациентов с HPV+ ПРР по сравнению с таковым у пациентов с HPV– ПРР. Иммуногистохимическая оценка количества остатков PAR выявила повышенную активность PARP в образцах тканей, полученных от больных HPV+ ПРР. При изучении HPV+ первичных культур было установлено, что указанные клетки, в отличие от HPV–, имеют ядерные фокусы XRRC1, ко-локализующихся с остатками PAR, что является характерным признаком репарации ОРДНК. Тест ДНК-комет позволил выявить в HPV+ первичных культурах повышенное количество клеток с четко выраженными «хвостами комет», являющимися проявлением ОРДНК. В HPV+ клеточных линиях SCC090 и UMSCC47 активность PARP также увеличена относительно аналогичного параметра в HPV– клеточных линиях, и может быть уменьшена путем добавления в культуральную среду ингибитора PARP. Функциональный эффект олапариба на раковые клетки связан с угнетением их пролиферации, и наиболее выражен в культурах HPV+ ПРР. На модели подкожного ксенографта HPV+ UMSCC47 нами было установлено, что олапариба в дозе 50 мг/кг ведет к замедлению роста опухолей по сравнению с контрольной группой животных и делает его сопоставимым с эффектом цисплатина в дозе 2,5 мг/кг. Гистохимическое исследование извлеченных из животных опухолей выявило значимое снижение активности PARP (по окраске на PAR), в группе, получавшей олапариб, а также уменьшение пролиферативного индекса (контроль — 51%, олапариб — 4%, цисплатин — 8%).

Для выявления молекулярных механизмов нами была предпринята оверэкспрессия наиболее изученных онкогенов Е6 и Е7 HPV16 в HPV– клетках, однако активность PARP при этом оставалась неизменной. Ранее было показана возможность физического взаимодействия PARP1 и Е2 HPV16. Knock-down гена Е2 в HPV+ клетках привел к незначительному снижению экспрессии гена parp1, а оверэкспрессия Е2 в кератиноцитах привела к увеличению количества клеток с ОРДНК, однако это лишь частично объясняет наблюдаемые в HPV+ ПРР феномены. В поисках новой модели было обнаружено наличие в HPV+ первичных клеточных культурах ДНК и мРНК всех вирусных генов HPV16, в том числе и ответственных за образование капсида, что дает основание предполагать возможность сборки вирионов. Выделенный из культуральной среды первичных HPV+ клеток HPV16 способен инфицировать HPV– клетки, о чем свидетельствует наличие в них мРНК всех генов HPV16 и down-регуляция белка p53. Более того, инфицирование HPV– клеток вирусными частицами приводило к формированию характерного для HPV+ ПРР фенотипа, обусловленного присутствием ядерных фокусов XRCC1, активацией PARP и повышенной чувствительностью к PARP ингибитору.

Вывод. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о наличии в клетках HPV+ ПРР многочисленных ОРДНК, которые, по всей вероятности, обусловливают чувствительность данного типа рака к производным платины и радиотерапии. Протекающие в этих клетках ОРДНК-индуцированные процессы репарации связаны с гиперактивацией PARP. Полученные данные указывают на потенциальную целесообразность использования ингибиторов PARP при HPV+ случаях ПРР. Молекулярные механизмы наблюдаемой дизрегуляции репарации ДНК при HPV+ ПРР частично связаны с экспрессией гена E2, но не с присутствием онкогенов Е6 и Е7 HPV16, и в большей мере предопределяются внедрением вируса в клетку-хозяина, что, в свою очередь, требует дальнейшего изучения.

310 Cedar street, BML 211, New Haven, CT 06510, USA; тел.: 1−615−646−4270; e-mail: asel. biktasova@yale.edu, andrew. sewell@yale.edu, brandee.t.brown@vanderbilt.edu, mi. zou@yale.edu, wendell. yarbrough@yale.edu, natalia. isaeva@yale.edu