В структуре онкологических заболеваний первичные опухоли костей составляют 0,7—2% всех злокачественных новообразований [6, 8]. Наиболее распространенными среди них являются остеосаркома (30—80%), хондросаркома (10—17%) и саркома Юинга (8—12%) [1, 10, 11, 57]. Пик заболеваемости костными опухолями приходится на социально значимый возраст: при остеосаркоме и саркоме Юинга — 10—25 лет, при хондросаркоме — 35—40 лет.

Саркомы костей являются наиболее агрессивными злокачественными опухолями человека. В связи с этим необходимо определение факторов прогноза заболевания, своевременная оценка эффекта проведенного лечения, выявление возможных рецидивов. В настоящее время для этого наряду с клиническими показателями используют широкий спектр инструментальных методов диагностики: стандартную рентгенографию, ангиографию, сцинтиграфию, компьютерную (КТ) и магнитно-резонансную (МРТ) томографию.

Однако в ряде случаев возникают затруднения в оценке данных инструментальных методов диагностики, в частности при небольшом объеме поражения и на начальных этапах развития опухоли. Неоднозначно и трактование результатов сцинтиграфии в связи с возможностью неспецифического включения радиофармпрепарата при воспалительных и дегенеративных процессах в костной ткани. КТ и МРТ являются высокотехнологичными и дорогостоящими методами диагностики, и далеко не все медицинские учреждения располагают необходимой для этого техникой. В связи с этим актуальным направлением является разработка дополнительных методов для ранней диагностики опухолевого поражения костной ткани у онкологических больных и оценки эффективности проводимой терапии.

Экономически доступным методом для решения этой задачи могло бы стать определение концентрации серологических маркеров в сыворотке крови, которое позволяет в короткие сроки качественно и количественно оценить выраженность костной резорбции при опухолевом поражении костей [4, 33].

Маркеры ремоделирования костной ткани в последние годы в ряде клиник нашли свое применение для оценки изменений метаболизма скелета при таких заболеваниях, как остеопороз, множественная миелома, болезнь Педжета, костные метастазы различных морфологических форм солидных опухолей [21, 22, 40, 53, 54]. Все эти биологически активные вещества по принадлежности к стадиям ремоделирования можно разделить на две большие группы: маркеры остеолизиса и остеосинтеза. В настоящее время описан ряд белков (и тест-системы для их выявления), которые могут характеризовать интенсивность этих процессов в организме человека. По происхождению эти маркеры можно разделить на три основные группы: продукты распада коллагена I типа (к которым относятся С- и N-концевые телопептиды коллагена I типа), неколлагеновые белки и продукты их деградации (например, костный сиалопротеин) и ферменты (представителем является TRAP-5b) [53].

С- и N-концевые телопептиды коллагена I типа

Основными продуктами распада коллагена I типа, определение которых используется в клинической практике, являются карбокси- и аминотерминальные пептиды (CTX и NTX), измерение концентрации которых возможно производить как в сыворотке крови, так и моче соответственно. До настоящего времени их считали наиболее чувствительными маркерами разрушения костной ткани [17].

CTX и NTX являются концевыми фрагментами коллагена I типа, которые отщепляются от него под действием ферментов остеокластов [29]. В литературе описано применение CTX и NTX в качестве маркеров остеолизиса при костных метастазах солидных опухолей [21]. Однако, по мнению ряда авторов [38], корреляция концентрации этих пептидов в сыворотке крови и в моче с интенсивностью резорбции костной ткани умеренная, а диагностическая чувствительность — недостаточна. Так, по мнению J. Halleen и соавт. [33], резорбция костной ткани при опухолевом поражении может происходить двумя различными путями.

В одном случае — при участии фермента катепсина К с последующим отщеплением и выделением в биологические жидкости CTX и NTX, а в другом — без участия катепсина К, но при участии металлопротеаз, при этом образования телопептидов не происходит. Вероятно, эти представления объясняют данные P. Garneo и соавт. [30], согласно которым чувствительность этих маркеров при физиологическом остеопорозе выше, нежели при метастатическом поражении костей. Кроме того, эти маркеры недостаточно специфичны для поражения костной ткани, так как коллаген I типа в человеческом организме входит в состав не только костной, но и других тканей: хрящевой, мышечной, дентина, кожи [29]. Также установлено, что уровень концентрации CTX и NTX в сыворотке крови зависит и от функционального состояния почек в связи с тем, что они имеют достаточно низкую молекулярную массу (9—20 кДа) и выводятся из организма в неизмененном виде в основном с мочой, проходя через почечный фильтр. Вследствие этого в течение суток колебания уровня CTX и NTX могут превышать 60% от базовой величины, что также снижает как чувствительность, так и специфичность метода [47]. Кроме того, установлено влияние принятой накануне пищи животного происхождения на концентрацию этих телопептидов в плазме крови и моче [53]. Все вышеописанные факты замедляют внедрение определения CTX и NTX в клиническую практику и стимулируют дальнейшие разработки в этом направлении.

Костный сиалопротеин

Костный сиалопротеин (BSP) — белок неколлагеновой природы, содержащий сиаловые кислоты. Это один из кальцийсвязывающих гликопротеинов кости, основными функциями которого являются минерализация и стабилизация четвертичной структуры коллагена. BSP, входя в состав белкового костного матрикса, разрушается ферментами остеокластов в процессе патологического или физиологического остеолизиса c выделением сиалопротеина в кровеносное русло. В связи с этим сывороточная концентрация BSP в плазме крови при активации процессов резорбции костной ткани в организме увеличивается [54]. По данным A. Bellahcene и соавт. [15, 16], рост концентрации BSP отмечается при метастатическом поражении костей раком молочной, щитовидной и предстательной желез. При этом авторы также не исключают и эктопическое выделение незначительного количества BSP собственно клетками вышеописанных опухолей. По данным G. De Pinieux и соавт. [24], повышение сывороточной концентрации BSP у больных раком молочной и предстательной желез свидетельствует о риске развития костных метастазов. Снижение его концентрации при проведении антирезорбтивной терапии бисфосфонатами при метастатическом поражении костей описано M. Siebel [54]. Таким образом, BSP представляется перспективным маркером активации остеолизиса костной ткани. В то же время надежный иммунологический метод оценки его концентрации в плазме крови до настоящего времени не разработан. Это обусловлено тем, что в кровеносном русле сиалопротеин в свободной форме практически не присутствует, а прочно связан с фактором H системы комплемента [30].

TRAP-5b

Тартратрезистентная кислая фосфатаза (TRAP), или «фиолетовая» кислая фосфатаза, является металлсодержащим энзимом, одна из форм которого — TRAP-5b — секретируется остеокластами и участвует в процессе ремоделирования костной ткани. TRAP в человеческом организме синтезируется различными клетками: остеокластами, альвеолярными макрофагами легких, дендритными клетками и эритроцитами [27, 45]. В основе биохимической молекулярной структуры TRAP лежит пептидная цепь, содержащая N-связанные олигосахариды, дисульфидный мостик, открытый протеолитический центр, обладающий окислительной активностью и содержащий два иона железа [41]. Один из ионов является пассивным Fe³⁺, другой — активным и способен восстанавливаться до Fe²⁺. Активность TRAP контролируется ионом Fe²⁺, а структуру протеолитического центра поддерживает дисульфидный мостик и маннозосодержащие олигосахариды [65]. Основная функция TRAP — генерировать активные формы кислорода за счет иона Fe²⁺ при нейтральном рH [39] и с их помощью осуществлять распад костного матрикса в везикулах остеокластов посредством свободно-радикальных химических реакций окисления [61].

В циркулирующей крови определяются две формы TRAP: 5а и 5b. TRAP-5а состоит из одной полипептидной цепи массой 35 кД, а TRAP-5b содержит две цепи массой 16 и 23 кД соответственно [37]. TRAP-5а синтезируется в основном макрофагами и дендритными клетками, а TRAP-5b — остеокластами [37]. Вышеописанное обосновывает перспективы применения формы 5а как маркера воспалительных явлений, а 5b как маркера костной резорбции [45].

Исследование механизмов функционирования TRAP-5b в физиологических условиях может помочь в интерпретации данных по уровню этого маркера при различных заболеваниях.

Резорбция кости осуществляется за счет секреции остеокластами кислот и протеолитических ферментов и, в частности, катепсина К в пространство между костной тканью и мембраной остеокласта, которое называется резорбционной лакуной [60]. Кислоты растворяют минеральные составляющие костной ткани, в то время как катепсин К и другие протеолитические ферменты катализируют разрушение органического костного матрикса. Продукты распада вместе с катепсином К поглощаются остеокластами путем фагоцитоза и присутствуют в клетках в виде везикул [51]. Непосредственно в остеокласте происходит слияние лизосом, содержащих TRAP, и везикул (с продуктами распада костного матрикса) с образованием более крупных вакуолей, в которых катепсин К отщепляет от TRAP концевой пептид с образованием TRAP-5b [61]. TRAP-5b, синтезируя активные формы кислорода за счет окисления Fe²⁺, обеспечивает заключительные стадии распада органического матрикса в остеокласте. Далее продукты распада вместе с TRAP-5b секретируются остеокластами в кровеносное русло. Таким образом, остеолизис, осуществляемый остеокластами внеклеточно, стимулирует заключительные внутриклеточные его стадии.

На основании изложенных данных возникло предположение о том, что TRAP-5b отражает активность костной резорбции. Эксперименты по выращиванию in vitro остеокластов, выделенных из соответствующих тканей мышей, свидетельствовали о том, что TRAP-5b является не только качественной, но и количественной характеристикой остеокластов, так как было отмечено повышение концентрации этого фермента в культуральной среде (т.е. при отсутствии костной резорбции) при увеличении количества (т.е. пролиферации) остеокластов [12]. Таким образом, TRAP-5b выделяется остеокластами не только в процессе остеолизиса, но и в его отсутствие. Изменение интенсивности резорбции кости всегда сопровождается изменением количества и активности остеокластов, соответственно секретируемая ими TRAP-5b будет отражать интенсивность этого процесса.

Результаты ряда клинических исследований свидетельствуют о том, что уровень TRAP-5b в сыворотке крови повышается у пациентов с патологическими состояниями костной системы, такими как остеопороз в постменопаузе [33], костные метастазы рака предстательной и молочной желез (при этом чувствительность метода составила 70—90%) [5, 23, 33], множественная миелома [59], болезнь Педжета [33]. В частности, по данным Р. Gerdhem и соавт. [31], повышение концентрации маркера в кровяном русле у женщин с диагностированным остеопорозом с высокой вероятностью прогнозирует возникновение переломов длинных костей.

Данные разных авторов [5, 47, 59] свидетельствуют о снижении уровня маркера в кровеносном русле после назначения эстрогенов и различных видов бисфосфонатов в качестве антирезорбтивной терапии онкологических больных с вторичным поражением костной системы. H. Ylipahkala и соавт. [69] обнаружили, что активность секреции TRAP-5b остеокластами человека in vitro не только коррелирует с изменением их количества, но и с их функциональной активностью: при добавлении в культуру клеток антирезорбтивных агентов секреция TRAP-5b снижалась. Это, с одной стороны, свидетельствовало о том, что одной из мишеней бисфосфонатов являются остеокласты, а, с другой стороны, этими экспериментами была продемонстрирована возможность использования маркера для оценки эффективности проведенной антирезорбтивной терапии [69].

Основными недостатками большинства маркеров, отражающих уровень костной резорбции (СТХ, NТХ и др.), являются высокая лабильность показателей в течение суток, функционального состояния почек и влияние съеденной пищи на их концентрацию в сыворотке крови [67]. Последнее, вероятно, связано с выработкой в процессе пищеварения гастроинтестинального гормона — глюкагоноподобного пептида, который снижает активность остеокластов [35]. В то же время данный гормон, не оказывая влияния на количество отеокластов, не изменяет концентрацию TRAP-5b в кровеносном русле [34].

Выделение большинства маркеров костной резорбции осуществляется почками. Справедливо полагать, что при ухудшении функции почек может снижаться скорость выведения маркеров из кровеносного русла и изменяться их концентрация в сыворотке крови при неизменном уровне резорбции [67]. TRAP-5b (в отличие от многих других маркеров) метаболизируется в печени, поэтому состояние функции почек практически не влияет на его концентрацию [33, 34]. Так, TRAP-5b выделяется остеокластами в плазму крови в активной форме, которая инактивируется и распадается на фрагменты в кровеносном русле до захвата клетками печени. Таким образом, при нарушении функции печени увеличится концентрация метаболитов TRAP-5b, в то время как количество активных молекул останется неизменным.

В настоящее время в отечественной и зарубежной литературе практически нет публикаций по применению TRAP-5b в качестве маркера при первичной и уточняющей диагностике у пациентов с первичными опухолями костей. Механизм деструкции костной ткани при первичном и метастатическом опухолевом поражении сходен: вокруг любой костной опухоли происходит процесс патологического ремоделирования костной ткани, т.е. осуществляется и резорбция, о выраженности которой традиционно судят по стандартным рентгенограммам. В связи с этим представляется перспективным использование TRAP-5b в качестве маркера при первичной и уточняющей диагностике, для оценки адекватности проводимого комбинированного или комплексного лечения, а также с целью доклинического выявления рецидивов у больных с первичными злокачественными опухолями костей.

В настоящее время перспективными для использования в клинической практике маркерами остеосинтеза считают остеокальцин и концевые пептиды проколлагена I типа, а также костную фракцию щелочной фосфатазы.

Остеокальцин

Одним из наиболее часто используемых маркеров остеосинтеза белковой природы является остеокальцин (ОК) — специфический маркер активности остеобластов [22]. ОК является белком с молекулярной массой 5,8 кД, состоящим из 49 аминокислотных остатков, в число которых входят три остатка карбоксилированной глутаминовой кислоты, способных связывать кальций. Как и сиалопротеин, он стабилизирует четвертичную структуру коллагена, контролируя его сборку. ОК выделяют во внеклеточный матрикс остеобласты в процессе синтеза новой костной ткани.

В экспериментах in vitro показано, что этим же свойством обладают и клеточные культуры одонтобластов и хондроциты [53].

В научной литературе описано применение ОК в качестве маркера остеосинтеза при различных патологических состояниях костной ткани, в том числе и при метастазах злокачественных опухолей. Так, Y. Arai и соавт. [13] оценили сывороточную концентрацию ОК у 32 пациентов с локализованным раком предстательной железы и у 31 больного с метастазами в костях. Отмечено достоверное повышение уровня ОК у пациентов с диссеминацией процесса по скелету в сравнении с группой больных с локализованной формой заболевания. Уровень ОК, превышающий референтные значения, был определен у 20 из 25 пациентов с костными метастазами рака предстательной железы.

В последние годы было установлено, что в процессе нормального костеобразования в течение 15—70 мин после попадания ОК в кровеносное русло происходит его деградация на более мелкие пептиды, выделение которых осуществляется с мочой и, таким образом, зависит от функционального состояния почек [25]. Применяемые в настоящее время способы определения концентрации ОК в сыворотке крови на основе моно- и поликлональных антител обладают сравнительно низкой специфичностью, так как используемые антитела перекрестно реагируют с продуктами распада этого энзима в кровеносном русле, что, по мнению ряда авторов [58], и ограничивает использование этого маркера в клинике. Кроме того, ОК, входя в состав костного матрикса, распадается и в процессе резорбции кости, что обусловливает повышение уровня метаболитов энзима в сыворотке крови при активизации не только остеосинтеза, но и остеолизиса, тем самым значительно снижая специфичность метода [48].

Амино- и карбоксиконцевые фрагменты проколлагена I типа

Синтез основного белка костной ткани — коллагена I типа — остеобластами проходит через стадию образования проколлагена I типа, при этом амино- и карбоксиконцевые фрагменты (АКФ, ККФ) отщепляются от молекулы проколлагена I типа при помощи специфических ферментов уже после выделения проколлагена из остеобластов. Зрелая молекула коллагена I типа участвует в формировании фибрилл костного матрикса, а терминальные фрагменты поступают в сосудистое русло, где происходит их дальнейшая деградация. Соотношение между количеством зрелого коллагена, откладываемого в костный матрикс, и количеством концевых фрагментов, поступающих в кровоток, теоретически равно единице, поэтому по концентрации АКФ и ККФ проколлагена I типа в сыворотке крови представляется возможным судить о синтетической активности остеобластов в отношении коллагена I типа [2]. В то же время сывороточная концентрация АКФ и ККФ не является истинным отражением активности остеосинтеза, так как эти маркеры слишком быстро разрушаются печенью [50].

Щелочная фосфатаза и ее костная фракция

Щелочная фосфатаза (ЩФ), циркулирующая в кровеносном русле человека, — гликопротеин, общая концентрация которого в сыворотке крови определяется несколькими фракциями. Основными источниками, синтезирующими собственные фракции ЩФ в организме, являются костная система, печень, желудочно-кишечный тракт и плацента [46].

Костная фракция щелочной фосфатазы (КФЩФ) — один из первых ферментов, обнаруженных в костной ткани. Было установлено, что при помощи гликозилфосфатидилионостирольного якоря она фиксируется на клеточной мембране остеобластов, от активности которых и зависит ее содержание в костной ткани [36]. Одной из функций КФЩФ является инициация минерализации костного матрикса в процессе ремоделирования костей [58, 66]. Концентрация КФЩФ в сыворотке крови отражает активность остеобластов и является одним из наиболее часто используемых в клинической практике маркером активности остеосинтеза [26, 27].

Известно, что на концентрацию КФЩФ в сыворотке крови влияет активность процессов дифференцировки остеобластов из клеток-предшественников, находящихся во внутреннем слое надкостницы. В связи с этим в молодом и юношеском возрасте в сыворотке крови отмечается физиологическое увеличение показателей общей ЩФ за счет преобладания именно костной фракции этого энзима [63]. Так, по данным ряда авторов [44, 62], в этот период до 90% энзима представлено его костной составляющей. У здоровых лиц более старшего возраста до 90% общей концентрации ЩФ приходится на костную и печеночную формы в соотношении 1:1 [42]. Очевидно, что активизация костеобразования может происходить и при различных патологических состояниях, в том числе и при остеобластическом опухолевом поражении скелета.

Возможность использования общей ЩФ и ее костной фракции как маркеров метаболизма костной ткани исследована при ряде патологических состояний костей, таких как остеопороз [19], метастатическое поражение скелета при опухолях различных локализаций и морфологической структуры [18, 22, 68], а также при первичном опухолевом поражении костной ткани [20, 56, 64]. По данным А. Berruti и соавт. и J. Brown и соавт. [18, 21], повышение концентрации КФЩФ в сыворотке крови наблюдалось у 72% больных с метастатическим поражением скелета при раке почки, у 60% — при раке молочной железы и у 54% — при раке легкого. Также увеличение в 1,6 раза частоты осложнений, потребовавших хирургического вмешательства, было отмечено в группе пациентов с повышенной концентрацией КФЩФ в сравнении с больными, уровень КФЩФ у которых был в пределах допустимых референтных значений. Ряд авторов [43, 52] считают необходимым исследование возможности применения данного маркера при комплексной оценке адекватности проводимой антирезорбтивной терапии при метастатическом поражении костей. Так, по данным P. Magnusson и соавт. [43], у больных раком предстательной железы с метастазами в костях отмечено увеличение сывороточной концентрации КФЩФ после начала проведения антирезорбтивной терапии, что, по мнению авторов, связано с усилением репаративных процессов в очаге поражения кости опухолью. По данным М.В. Пашкова [9], чувствительность КФЩФ как маркера костеобразования при метастазах в костях рака молочной железы составила 78,9%, а рака предстательной железы — 84,4%. Кроме того, автором отмечено повышение уровня КФЩФ в плазме крови за 5—18 мес до клинического выявления множественных костных метастазов вышеописанных форм опухолей, что также подтверждает высокую диагностическую чувствительность метода.

В литературе освещен опыт применения общей фракции ЩФ в качестве маркера для диагностики и мониторинга эффективности лечения больных с остеосаркомой. Диагностическая значимость общей фракции ЩФ при первичной диагностике больных с остеосаркомой составляет, по данным разных авторов [7, 20, 56], от 46% до 90%. Кроме того, по данным ряда исследователей, целесообразно использовать уровень общей ЩФ в качестве одного из факторов прогноза. Так, 10-летняя выживаемость больных с локализованной формой остеосаркомы зависела от уровня общей ЩФ после системного лечения: при уровне маркера, более чем в 2 раза превышающего нормальные значения, она составила 25%, менее чем в 2 раза — 39%, а при показателе в пределах референтных значений — 68% [20]. Авторами отмечена корреляция низкой степени опухолевого патоморфоза после проведенного лекарственного лечения у больных с высокой концентрацией ЩФ в сыворотке крови перед началом терапии. Итальянские исследователи из Instituto Ortopedico Rizzoli (Болонья) показали, что общая безрецидивная выживаемость у пациентов с исходно нормальными показателями общей ЩФ перед началом лечения составила 67%, в то время как у больных с исходно повышенной концентрацией — лишь 54%. Пятилетняя выживаемость в этих группах пациентов составила 59% при повышенной концентрации маркера и 76% — при нормальной. Сроки выявления прогрессирования болезни после окончания лечения у больных с исходно повышенной ЩФ также были короче [14].

Тем не менее специфичность и чувствительность общей ЩФ как маркера для уточняющей диагностики и прогноза течения заболевания у больных с остеосаркомой оказались далекими от идеальных. Были отмечены существенные колебания уровня общей ЩФ, напрямую не связанные с течением опухолевого процесса [27, 49], что не позволяло осуществлять мониторинг у каждого конкретного больного. По мнению ряда авторов [44, 70], апробация КФЩФ в качестве маркера активности остеобластов и процесса остеосинтеза при патологических состояниях костной ткани является более оправданной, нежели общей фракции этого энзима. Теоретическим подкреплением этого является тот факт, что клеточная культура остеосаркомы способна продуцировать КФЩФ in vitro [32, 55].

Учитывая вышеизложенное, изучение возможности использования КФЩФ и TRAP-5b в качестве серологических маркеров у больных с первичным опухолевым поражением костной ткани является теоретически обоснованным. В этом плане определенный интерес представляет работа В.А. Державина [3]. Автор показал, что с целью уточняющей лабораторной диагностики у пациентов с первичными местно-распространенными и диссеминированными опухолями костей целесообразно исследовать два маркера — TRAP-5b и КФЩФ, диагностическая чувствительность которых составляет 57,1±5 и 54,4±6% соответственно, а если они используются в комплексе — 71,2±5,3%. Общая специфичность TRAP-5b составила 75±3%, а КФЩФ — 72±6%. Установлено, что при первичных злокачественных и гигантоклеточных опухолях костей сывороточная концентрация TRAP-5b и КФЩФ определяется клинической стадией заболевания и общим объемом опухолевой массы. Исходные показатели TRAP-5b и КФЩФ на старте лечения могут быть использованы в качестве независимых критериев прогноза эффективности планируемой химиотерапии: чем они выше, тем выше вероятность химиорезистентности опухоли. На этапе неоадъювантного системного лечения традиционно используемую диагностическую линию мониторинга целесообразно дополнить определением сывороточной концентрации TRAP-5b. Показано, что динамика уровня TRAP-5b в процессе полихимиотерапии отражает ее эффективность только в отношении опухолевых очагов, локализованных в костной ткани. При проведении TRAP-5b-мониторинга пациентов с первичными местно-распространенными злокачественными опухолями костей в ремиссии после хирургического лечения с целью доклинического выявления прогрессирования заболевания необходимо учитывать продолжительный (около года) период стабилизации маркеров после операции.

Таким образом, до сегодняшнего дня комплексная диагностика первичных злокачественных новообразований костной ткани и мониторинг больных с такими опухолями не включали в себя применение биохимических маркеров костного ремоделирования. Очевидно, результаты последних исследований в области использования маркеров метаболизма костной ткани могут дополнить сложившийся алгоритм диагностического обследования пациентов со злокачественными опухолями костей в целях уточняющей диагностики и прогноза заболевания.