Молекулярно-биологические параметры и прогноз лейомиосаркомы тела матки с большим количеством многоядерных клеток

Злокачественные новообразования мягких тканей остаются одним из самых сложных разделов онкологии как в диагностике, так и прогнозировании течения заболевания [1]. Одной из редких локализаций злокачественных неоплазий этой группы является лейомиосаркома (ЛМС) тела матки, хотя среди всех неэпителиальных опухолей она встречается наиболее часто — в 25—60% случаев [7, 10]. В целом ЛМС составляет 1—1,3% злокачественных новообразований матки [6] и 25—60% сарком матки [12]. При этом ряд авторов считают, что данная опухоль практически нечувствительна к химиотерапии и лучевому лечению, причины этого неизвестны [3, 5]. Следует отметить, что с точки зрения гистологических типов опухоли ЛМС — достаточно гетерогенная группа, включающая в себя наиболее часто встречающиеся веретеноклеточный и эпителиоидно-клеточный типы [13]. В редких случаях выделяют еще один тип опухоли — миксоидную [16]. Вместе с тем достаточно часто патолог сталкивается с ЛМС тела матки, одним из компонентов которой являются многоядерные клетки, иногда охватывающие значительный объем опухоли. Безусловно, многоядерные клетки в мезенхимальных злокачественных опухолях — явление достаточно частое и может входить в понятие опухолевого полиморфизма, но регулярность встречаемости таких типов опухоли позволяет рассмотреть их отдельно. Однако отсутствие соответствующей рубрики в классификации ВОЗ не позволяло оценить клинико-морфологические характеристики и особенности характеристики биомолекулярных маркеров в опухолях такого типа. В настоящее время в оценке биомолекулярных характеристик опухолей практически всех локализаций определенный интерес представляет исследование белков, регулирующих основные свойства клеток: Ki-67 и BrdU-метка (G1/G2 и S-фракция клеточного пула), wр53 (активация апоптоза), Bcl-2 (супрессия апоптоза), количество аргирофильных белков области ядрышкового организатора (показатель активности рибосомальных генов, AgNOR). Кроме того, исследования последних лет показали высокую практическую и научную значимость выявления фермента-гиразы Topoisomerase IIα и белка теплового шока 70 (HSP70) из семейства цитозольных шаперонов, которые являются одними из ведущих в реализации разрывного трансмембранного митохондриального потенциала; они влияют, а точнее блокируют каспазозависимый путь апоптоза [9, 15]. Не менее важным и интересным представляется изучение ряда клинико-морфологических параметров различных гистологических типов ЛМС: продукции внеклеточного матрикса (ВКМ), метаболической активности, морфоденситометрических (МДМ) характеристик, плотности микроциркуляторного русла (ПМЦР), рецепторного статуса (эстрогенового и прогестеронового — РЭ и РП) и выживаемости. При ЛМС тела матки данные исследования ограниченны, результаты их противоречивы, а часть из них не освещена в литературе.

Исходя из вышеизложенного, целью работы стало определение клинико-морфологических и молекулярно-биологических характеристик ЛМС тела матки с большим количеством многоядерных клеток в своей структуре и прогноза больных с таким типом неоплазии.

Материалы и методы

В исследование включили 66 ЛМС от больных, прооперированных по поводу быстрорастущей опухоли тела матки за период 1996—2008 гг. в Алтайском крае. Все случаи были классифицированы как I—II стадия по критериям FIGO. Изучали образцы опухоли (центр и периферия), исследовали неизмененный миометрий перитуморозной зоны (не более 0,5—1 см от опухоли). По клинико-морфологическим данным оценивали состояние репродуктивной функции, возраст больных ЛМС, размер и локализацию образования, количество неоплазий в теле матки. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, железным гематоксилином по Гейденгайну, пикрофуксином по Ван-Гизону. Параллельно гистологические срезы окрашивали нитратом серебра по методу W. Howell и D. Black (1980) в модификации И.П. Боброва и соавт. (2002) для определения AgNOR. Для исследования НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ на замораживающем микротоме готовили срезы толщиной 10—15 мкм, наклеивали на стекло и инкубировали в субстрате соответствующего фермента: НАДН₂-диафоразы (IUBMB 1.6.99.1), сукцинатдегидрогеназы — СДГ (IUBMB 1.3.99.1) и лактатдегидрогеназы — ЛДГ (IUBMB 1.1.1.27). Ядра докрашивали 0,1% водным раствором нильского голубого. Активность ферментов в гладкомышечных клетках оценивали количественным методом Р.П. Нарциссова, основанным на подсчете образованных в клетке видимых гранул формазана, при использовании n-нитротетразолия фиолетового. Микроциркуляторное русло (МЦР) с целью исследования особенностей архитектоники изучали на свежезамороженных нефиксированных срезах опухоли толщиной 30—40 мкм, окрашенных по Гомори на щелочную фосфатазу — ЩФ (IUBMB 3.1.3.1). МДМ-особенности клеток опухоли (плоидность и площадь ядер) выявляли на срезах, окрашенных по Фельгену. При определении гистограмм плоидности за эталон 2с принимали малый тканевый лимфоцит. Использовали иммуногистохимический способ с полимерной системой визуализации BioGenex Super Sensitive Polymer-HRP Detection System/DAB. Для дифференциальной диагностики использовали панель, состоящую из виментина, десмина, гладкомышечного актина и CD68, считали, что опухоль гладкомышечного гистогенеза при умеренной либо выраженной цитоплазматической позитивной реакции к SMAα. ПМЦР оценивали на позитивно окрашенном эндотелии CD31 на 2 мм². Пролиферативную активность оценивали по уровню Ki-67 (клон MIB-1), количество клеток в S-фазе — по BrdU-метке: для предобработки использовали раствор BrdU (Sigma B 5002,7 mg/ml saline; Sigma), который вводили в маточную артерию и инкубировали при температуре 37 °С 24 ч. Далее вместо предобработки 2 М HCl с последующим использованием протеазы по G. Harms и соавт. (1986) мы использовали обработку в цитратном буфере с рН 6,0 в модификации X. Tang и соавт. (2007) [14]. Оценивали содержание белков-регуляторов апоптоза Bcl-2 (клон МКА 124) и p53 (клон DO-7). Определяли активность фермента-гиразы Topoisomerase IIα (клон Ki- S). Оценивали содержание и локализацию HSP70 (клон W27) в клетке: цитоплазматический, ядерный и ядерно-ядрышковый типы локализации белка [9]. Рецепторный статус неоплазии оценивали по наличию рецепторов прогестерона (клон PgR636) и эстрогена α (1D5) по методике согласно ER/PR pharmDx в балльной системе. Поскольку методики подсчета РП и РЭ для гладкомышечных образований тела матки не существует, была адаптирована к применению система подсчета для рака молочной железы. Система подсчета учитывает как число положительно окрашенных ядер опухолевых клеток (до 5 баллов в зависимости от процента окрашенных ядер), так и интенсивность окраски (до 3 баллов). Итоговый балл, означающий гормонозависимость ткани, получают путем сложения обоих показателей. Новообразования, имеющие от 0 до 2 баллов, считаются гормонально-негативными, 3 балла и более — гормонально-позитивными. Ядерные маркеры оценивали вне многоядерного компонента. Оценивали количество коллагена общего типа. Для подсчета полученных результатов использовали компьютерный анализатор с программой Image Tool 3.0 и Image J в автоматическом и ручном режимах подсчета — количество коллагена в процентном соотношении, площадь и плоидность и количество аргирофильных гранул в ядре клетки (кариоплазматический и нуклеолярные кластеры). Прогноз оценивали, исследуя 10-летнюю выживаемость по Каплану—Мейеру, проводили многофакторный регрессионный анализ по Коксу. Для статистической обработки использовали программу Statistica 6.0, корреляцию определяли непараметрическим методом по Пирсону.

Результаты и обсуждение

ЛМС с большим количеством многоядерных клеток (ЛМСБКМ) наиболее часто выглядела как веретеноклеточная гладкомышечная опухоль со всеми светооптическими признаками злокачественности и с широкими полями многоядерных клеток, занимающих не менее 10% общей структуры (рис. 1, а—в на цв. вклейке).

Рисунок 1. Лейомиосаркома с большим количеством многоядерных клеток различной степени злокачественности. В левом верхнем углу – позитивная иммуногистохимическая реакция к SMAα. а – степень злокачественности G1; б – G2; в – G3. При степени злокачественности G3 сложно дифференцировать с фиброзной гистиоцитомой. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: а,в – 200; б – 100.

При высокой степени опухолевой анаплазии на светооптическом уровне такие компоненты опухоли было невозможно отличить от фиброзной гистиоциомы либо гигантоклеточной опухоли, что требовало иммуногистохимической диагностики, как правило, с отрицательной реакцией к CD68 и позитивной к SMAα. Реже такие структуры встретились нам в эпителиоидных ЛМС тела матки. Поскольку неоплазия с таким типом структуры в большей степени была выявлена в веретеноклеточных саркомах, то в последующем сравнение параметров проводили именно с ней. Веретеноклеточная ЛМС (ЛМСВ) выявлена в 57,6% случаев, а ЛМСБКМ — в 19,7% случаев, что было относительно частым показателем. Средний возраст больных ЛМСВ составил 52,3±0,9 года, а ЛМСБКМ — 54,2±1,6 года, различия статистически незначимы. 52,7% больных с ЛМСВ были в менопаузе, а больные с ЛМСБКМ в менопаузе составили 46,1%, что также было сопоставимо. Не было выявлено различий и в размере неоплазии.

Наибольшие различия были выявлены при исследовании биомолекулярных характеристик неоплазии (см. таблицу).

Избыточная продукция внеклеточного матрикса в виде коллагена общего типа при ЛМСВ отмечена в 5,3±2,5% случаев, а при ЛМСБКМ — в 23,2±6,7% (р≤0,05). Метаболическая активность ЛМСБКМ по уровню общего метаболизма была значимо выше таковой ЛМСВ и составила 173,3±5,6 гранулы НАДН₂-диафоразы, причем за счет усиления обоих типов метаболизма с усилением ЛДГ и СДГ (инверсия метаболического профиля). При исследовании МЦР по данным контрастного компьютерного анализа ЛМСБКМ характеризовалась интенсивным окрашиванием эндотелия сосудов на ЩФ и наличием множества истинных сосудисто-капиллярных петель вне зон некроза. Кроме того, в большинстве случаев отмечали незавершенность строения некоторых петель и большое количество растущих новообразованных капилляров в зоне, свободной от некротических изменений. ЛМСВ была с более завершенным ангиогенезом с преобладанием сосудов модульного типа и небольшим количеством петель и анастомозов. ПМЦР при ЛМСБКМ составила 71,4±2,1 на 2 мм², а при ЛМСВ была значимо меньше — 60,4±1,9. При анализе МДМ образований обоих типов были получены данные, показывающие значимые различия: при ЛМСВ площадь ядер была 82,2±1,9 мкм2, а плоидность — 8,6±0,2 с; параметры ЛМСБКМ были значимо выше — площадь ядер 108,7±6,5 мкм2, а плоидность — 12,4±0,7 с. Количество AgNOR также было значимо выше в ЛМСБКМ, чем в ЛМСВ (30,5±4,1 и 19,8±0,7 соответственно) за счет обоих типов кластеров гранул. Пролиферативная активность имела отличия с большим индексом Ki-67 в ЛМСВ (24,6±2,5 и 16,5±2,1% соответственно). Вместе с тем количество клеток с повышенным содержанием белка было выше в ЛМСБКМ (60,2±3,2 и 45,7±2,2% соответственно). Количество клеток в S-фазе цикла по данным BrdU-метки было выше в ЛМСБКМ (6,8±0,1 и 4,9±0,07% соответственно). Активность Bcl-2 была практически одинаковой при всех гистологических типах ЛМС и варьировала от 78 до 81%. Вместе с тем степень активности значимо различалась: при ЛМСВ низкую степень отмечали в 21,4±4,4% случаев, а при ЛМСБКМ — всего в 9,1±5% (р≤0,05). Активность белка-активатора апоптоза р53, так же как и Bcl-2, значимо не различалась при разных гистологических типах ЛМС, степень активности также была сопоставима при различных типах ЛМС. Активность фермента-гиразы Topoisomerase IIα была значимо выше при ЛМСБКМ, чем при ЛМСВ, — 23,1±2,9 и 13,1±2,6% соответственно. Клеток с выраженной степенью активности фермента было также больше при ЛМСБКМ — 61,5±8,9 и 37,2±4,9% соответственно. ЛМСВ была чаще позитивнее по отношению к рецепторам прогестерона и эстрогена, чем ЛМСБКМ — 52,6±4,6 и 38,4±8,1%.

Содержание и ядерный и/или ядерно-ядрышковый тип реакции HSP70 не были связаны с гистологическим типом саркомы. Следует отметить, что в целом ядерно-ядрышковая локализация белка была более характерна для ЛМС по сравнению с лейомиомой (50,1±3,4 и 11,5±3,6% соответственно). Полученные данные согласуются с основными характеристиками и функциями HSP70. Известно, что в стабильном состоянии клетки белок локализуется в цитоплазме, но при стрессе (в том числе и канцерассоциированном) происходит сначала увеличение, а затем и переход по микротрубочкам в ядро, за которым следует этап блокирования апоптоза. Такой процесс проникновения белка из цитоплазмы в ядро некоторыми авторами рассматривается как ядерная транслокация белка [2, 4]. Для характеристики белков теплового шока такой процесс рассматривают как более важный показатель, чем просто наличие и количество в клетке неоплазии [12].

Анализ выживаемости показал, что в группах ЛМС обоих типов в стадии I—II прогноз был наиболее неблагоприятен при ЛМСБКМ — до 10 лет дожили 9,1±5% больных, а при ЛМСВ 10-летняя выживаемость была значимо выше — 66,7±6.4% (рис. 2).

Рисунок 2. Кумулятивная выживаемость в зависимости от гистологического типа по Каплану—Мейеру.

Заключение

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о значимых отличиях в патоморфологических и молекулярно-биологических параметрах лейомиосаркомы с большим количеством многоядерных клеток и значимо неблагоприятном прогнозе в сравнении с другими типами гладкомышечных злокачественных неоплазий этой локализации. Эти отличия должны указываться в патологоанатомическом заключении. Этот тип лейомиосаркомы может быть выделен в отдельную классификационную рубрику.