Роль внутриклеточных нуклеаз в коррекции аберрантных 5’-концов преспейсеров в системе CRISpr-Cas i-E E.coli

ЦЕЛЬ

CRISPR-Cas системы нужны бактериям для формирования адаптивного иммунного ответа, необходимого для защиты от инфекционных агентов. Кроме того, в последние годы CRISPR-Cas системы активно изучаются в контексте разработки новых методов редактирования генома, имеющих большой потенциал в области разработки новых стратегий в борьбе с инфекционными и другими заболеваниями. Механизм формирования адаптивного иммунитета бактерий с помощью CRISPR-Cas систем заключается в способности бактерий встраивать в свой геном фрагменты чужеродной ДНК (например, ДНК бактериофагов), которые называются спейсерами, что в дальнейшем обеспечивает бактериям распознавание и защиту от этих инфекционных агентов. Однако, не так много известно о молекулярных механизмах этого процесса, что значительно ограничивает возможности ученых в понимании и применении CRISPR-Cas систем. В частности, открытым остается вопрос о роли компонентов бактериальных клеток, не относящихся к системам CRISPR-Cas, в формировании CRISPR адаптации. Такими компонентами, например, являются внутриклеточные нуклеазы. Нуклеазы участвуют в подготовке чужеродного ДНК фрагмента для встраивания в ДНК бактерии (CRISPR-кассету), что необходимо для обеспечения CRISPR адаптации — для этого необходимо, чтобы он обладал нужной структурой и был правильной длины. Ранее было показано, что нарушения в формировании 5’-концов предшественников спейсеров не влияют на их встраивание в CRISPR-кассету и на эффективность адаптации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Были созданы два мутантных штамма Bl21-AI Δxni (Flap-эндонуклеаза ExoIX) и Bl21-AI ΔpolA exo (PolI). Далее полученные штаммы были трансформированы плазмидой pCDF Cas1/Cas2. Были проведены эксперименты по олигоэлектропорации на фоне индукции наивной адаптации с помощью добавления арабинозы и IPTG. Высокопроизводительное секвенирование проводили с помощью MiniSeqTM Sequencing System (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В данной работе было описано, что ДНК полимераза I скорее всего удаляет лишний нуклеотид на 5'-концах предшественников спейсеров, тем самым делая возможным встраивание предшественников спейсеров с удлиненными 5’-концами в CRISPR-кассету в качестве спейсеров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные знания значительно расширяют представления о ходе CRISPR адаптации, имеют фундаментальную и практическую значимость, открывая новые возможности в понимании и применении CRISPR-Cas систем, в том числе в контексте разработки новых методов по борьбе с инфекционными и другими заболеваниями.