Изучение механизмов формирования 3’-концов преспейсеров в процессе CRISPR-адаптации с помощью одновременной репрессии генов с использованием dCas9

ЦЕЛЬ

Бактерии способны интегрировать часть генетического материала атакующего инфекционного агента в качестве спейсера в CRISPR-кассету. Этот процесс называется CRISPR-адаптацией и необходим для того, чтобы бактерии могли в будущем адекватно ответить на тот же инфекционный агент. Молекулярные механизмы CRISPR-адаптации пока полностью не выяснены, особенно роль вне-CRISPR-Cas-компонентов бактерий в процессе генерации преспейсеров и приобретении спейсеров. В этой работе был разработан подход для поиска нуклеаз, отвечающих за образование 3’-концов преспейсеров in vivo.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Была получена генетическая конструкция на основе плазмидного вектора pBR322 с гРНК, направленными на гены клеточных экзонуклеаз с 3’-5’ активностью в E.coli. Данная генетическая конструкция и плазмида pdCas9 были трансформированы в клетки KD403. Уровень праймированной CRISPR адаптации оценивался с помощью ПЦР и секвенирования. Структура 3’-концов преспейсеров оценивалась с помощью метода FragSeq для секвенирования коротких фрагментов с использованием набора Accel-NGS® 1S Plus DNA Library Kit, Swift biosciences (xGen™ ssDNA & Low-Input DNA Library Preparation Kit, IDT).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В штамме KD403 ΔrecB с супрессированными нуклеазами было выявлено снижение праймированной адаптации, однако по результатам секвенирования не было обнаружено нарушения структуры 3’-концов предшественников спейсеров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши результаты вносят вклад в изучение молекулярных механизмов адаптации CRISPR, что может помочь в разработке подходов на основе CRISPR в медицине и сельском хозяйстве в будущем.