Введение

Туляремия — зоонозная природно-очаговая особо опасная инфекция, возбудителями которой являются бактерии Francisella tularensis. Почти во всех странах Европы, в Японии, а также в России проводится обязательная регистрация случаев заболевания туляремией в связи с его эпидемической опасностью, а также с возможностью использования возбудителя в качестве агента биотерроризма; разрабатываются новые более совершенные методы сравнительного генотипирования штаммов.

На территориях Европы, Северной Америки, Азии и Российской Федерации циркулируют штаммы F. tularensis subsp. holarctica, которые долгое время внутри подвида делили только на биовары: I EryS (эритромицин-чувствительный), II EryR (эритромицин-устойчивый) и japonica. С развитием технологий и ростом количества секвенированных геномов каждый год предлагается новая усовершенствованная схема полногеномной филогении, особенно подвида F. tularensis subsp. holarctica. По текущей современной классификации на основе делеций-вставок (INDEL) и однонуклеотидного полиморфизма (SNP) штаммы внутри подвида разделяют на 4 основные филогенетические группы: B4, B.6, B.12 и B16 и далее на подгруппы, линии, сублинии и генотипы. К настоящему времени насчитывается свыше 300 SNP-типов внутри подвида [1, 2]. Наиболее распространены на территории Европы штаммы групп B.6 и B.12 [3]. Отличить штаммы основной филогенетической группы B.12 внутри подвида F. tularensis subsp. holarctica оказалось возможно с помощью определения устойчивости изолятов к эритромицину, так как этот признак связан с конкретной мутацией в rrl-гене, и фенотипическая дифференциация является также и таксономической. Штаммы основной филогенетической группы B.12, устойчивой к эритромицину, имеют точечную (SNP) мутацию A®C в позиции 2059 во всех трех копиях rrl-гена [4]. Штаммы F. tularensis subsp. holarctica bv. japonica группы B.16 в основном распространены в Японии, но встречаются в Турции и Китае. На территории Российской Федерации штаммы этой группы до настоящего времени не выделялись и находятся только в музейных коллекциях учреждений, занимающихся изучением особо опасных инфекций. Дифференцирование эритромицин-чувствительных штаммов основных филогенетических групп B.4, B.6, B.16, а также штаммов широко распространенной группы B.12, до сих пор является проблемой даже при наличии полногеномной нуклеотидной последовательности штамма.

В противочумном институте Ростова-на-Дону была разработана система дифференцирования штаммов на основе данных полногеномного секвенирования, которая рассчитана на работу также с набором контигов. Референс-последовательность каждого анализируемого гена выявлялась среди всех представленных контигов. Для анализа были использованы все полногеномные последовательности штаммов возбудителя туляремии, имеющиеся в базе данных NCBI, что позволило создать локальную базу из 997 геномов [5].

Цель данной работы — проведение генетического типирования на основе данных полногеномного секвенирования и выявление генетического разнообразия штаммов подвида F. tularensis subsp. holarctica, выделенных в разное время на территории Российской Федерации.

Материал и методы

В работе использовали нуклеотидные последовательности 63 штаммов F. tularensis subsp. holarctica (табл. 1, 2), из которых 36 штаммов были выделены на территории Российской Федерации. В Ростовской области в разные годы было изолировано 22 штамма, 5 штаммов выделены на территории Ханты-Мансийского автономного округа во время эпидемиологической вспышки в 2013 г., 4 штамма выделены в Донецкой Народной Республике в 2022 г. Ряд последовательностей штаммов разных филогенетических групп подвида F. tularensis subsp. Holarctica, выделенных на территории Российской Федерации, получен из базы данных NCBI (см. табл. 1).

Таблица 1. Выделенные в России штаммы F. tularensis subsp. holarctica, нуклеотидные последовательности которых использованы в работе

Таблица 2. Штаммы F. tularensis subsp. holarctica из базы данных NCBI, нуклеотидные последовательности которых использованы в работе

В качестве референс-штамма основной филогенетической группы B.4 использовали последовательность штамма OSU18, для группы B.6 подгруппы B.7 использовали последовательность штамма OR96-0246, также обозначаемую как генотип B.40, а для группы B.6, подгруппы B.10/11 — последовательность штамма FTNF002-00, или FTA, также обозначаемую как генотип B.41. В качестве референс-штамма F. tularensis subsp. holarctica bv. japonica, основной филогенетической группы B.16, использовали последовательность штамма FSC022. Для основной филогенетической группы эритромицин-устойчивых штаммов B.12, подгруппы B.26-B.20 (или B.42) референс-штаммом была взята последовательность штамма FSC200 (табл. 2, рис. 1), а для подгруппы B.26-B.23-B.24 — вакцинного штамма 15 NIIEG.

Рис. 1. Анализ филогенетического родства 36 штаммов F. tularensis subsp. holarctica, выделенных на территории Российской Федерации с 1966 по 2023 гг., по данным полногеномного секвенирования.

Дендрограмма построена на основе выявленных в геномах 6626 SNPs с использованием программы MEGA5 и метода максимального правдоподобия (ML).

Для определения биовара исследованных штаммов F. tularensis subsp. holarctica, различающихся по чувствительности к эритромицину (и другим макролидам), использовали диски с эритромицином, содержащие 15 мкг антибиотика. Эта концентрация антибиотика позволяет делить штаммы голарктического подвида туляремийного микроба на два биологических варианта — биовар I EryS (эритромицин-чувствительный) и биовар II EryR (эритромицин-резистентный). Для определения принадлежности к тому или иному биовару в центральную часть чашки помещали диск с эритромицином. При посеве чувствительной к эритромицину культуры вокруг диска с антибиотиком обнаруживади выраженную зону задержки роста диаметром 2—3 см, а при посеве культуры, резистентной к эритромицину, по всей поверхности чашки отмечался равномерный рост.

Геномную ДНК выделяли при помощи набора Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Life Technologies Inc., США) согласно инструкции производителя.

Полногеномное секвенирование проводили на генетическом анализаторе MiSeq (Illumina, США). Сборку геномов, представленных в виде ридов, проводили с использованием программы Spades [6]. Для определения основных генетических групп в исследуемой последовательности использовали «канонические» делеции-вставки (canINDEL) и однонуклеотидные замены (canSNP), описанные в работах: B.1 [7]; B.2-B13 [8]; B.16, B.21-B.25 [9]; B.26-B.32 [10]; B.33-B.38 [11]. Для анализа применяли авторское программное обеспечение GeneExpert, PrimerM и VirtualPCR, написанное на языке программирования Java. Формирование перечня 6626 SNP для построения дендрограммы выполняли по методике, описанной ранее [12]. Кластерный анализ проводили с использованием метода UPGMA, для построения дендрограммы использовали программу MEGA 5 [13]. Для сравнительного анализа использовали данные, полученные из базы данных NCBI. Для определения «канонических» SNP использовано свободное программное обеспечение CanSNPer2 [14]. Поиск SNP для попарного сравнения штаммов проводили с помощью программы Snippy [15]. Для визуализации дендрограммы использовали программу Cytoscape [16].

Результаты и обсуждение

Предложенная схема SNP-типирования штаммов возбудителя туляремии на основе данных полногеномного секвенирования использует набор из выбранных 6626 SNP-маркеров для анализа, что значительно больше, чем классификация F. tularensis subsp. holarctica на основе «канонических» делеций-вставок (canINDEL) и однонуклеотидных полиморфизмов (canSNP). Проанализированные в работе нуклеотидные последовательности 63 штаммов F. tularensis subsp. holarctica, приведенные в табл. 1 и 2, разделились на 4 группы, принадлежащие всем основным филогенетическим группам и подгруппам подвида: 4 штамма — B.4, 8 штаммов — B.6 (B.7 и B.10), 2 штамма — B.16 и 48 штаммов — B.12 (см. рис. 1).

Эритромицин-чувствительные штаммы, выделенные в России, принадлежащие к группе B.4 — это штамм A-1045, полученный из клеща Dermacentor reticulatus в Алтайском крае в 2011 г. и штамм B-8367 (или И-339), выделенный от больного человека в г. Хабаровске в 1975 г. (см. рис. 1). Два других эритромицин-чувствительных штамма, выделенных на территории Российской Федерации, относятся к группе B.6, в которую входят две крупных подгруппы — B7 и B.10. Подгруппа B.10 широко распространена в Европе. Штаммы №27, выделенный в Ростовской области в 1996 г., и B-8365 (или И-223), выделенный от больного человека в Хабаровске в 1968 г., относятся к подгруппе B.7 (рис. 1). Среди культур возбудителя туляремии, выделенных на территории России, не обнаружены штаммы, принадлежащие к основной филогенетической группе B.16.

Большая часть штаммов, исследованных в данной работе, — 32 штамма — принадлежат к эритромицин-устойчивым штаммам группы B.12. К настоящему времени «текущая» схема типирования штаммов, относящихся к этой основной филогенетической группе, делит их на 5 подгрупп: B.71, B.39, B.27 (или B.43), B.26-B.23 и B.26-B.20 (или B.42), которые затем разделяются на линии и сублинии штаммов (рис. 2) [17].

Рис. 2. Схематическое филогенетическое дерево F. tularensis subsp. holarctica группы B.12, на основе канонических делеций-вставок (canINDEL) и однонуклеотидных замен (canSNP). В скобках указаны референс-штаммы, в некоторых случаях указаны альтернативные маркеры группы и подгрупп [17].

К подгруппе B.71 принадлежат в основном эритромицин-устойчивые штаммы, выделенные в Германии [17]. К подгруппе B.39 относятся эритромицин-устойчивые штаммы, выделенные в Швейцарии, Франции, Дании. Штаммы этих подгрупп пока не обнаружены на территории России.

Исследованные последовательности 32 российских эритромицин-устойчивых штаммов группы B.12 принадлежат к подгруппам B.26 и B.27 (или B.43) (см. рис. 1). Выделенные на территории Ростовской области штаммы в 1988 (№250) и в 2020 гг. (№№249, 251, 256) в Сальском районе, в Целинском (№799), Ремонтненском (№№1-23) и Неклиновском (№783) районах в 2022 г. и в Ремонтненском районе (№№7-23, 22-23) в 2023 г., а также 4 штамма, выделенные на территории Донецкой Народной республики в 2022 г., генетически близки и относятся к подгруппе B.27 (или B.43). В данном случае с 1988 по 2023 г. в Ростовской области и на территории Донецкой Народной Республики циркулировали очень близкие генотипы штамма F. tularensis subsp. holarctica. Остальные 19 штаммов, выделенных на территории Российской Федерации, распределились внутри подгруппы B.26. Штамм №38, выделенный в Калмыкии в 1987 г., оказался генетически близок к штаммам, выделенным в Западно-Казахстанской области и Павлодаре, относящимся к подгруппе B.26-B.23. Данная подгруппа далее разделяется на 2 линии, одна из которых — B.24 — содержит штаммы LVS, 15 NIIEG и штаммы, выделенные в Болгарии.

Для проведения сравнительного анализа между штаммами LVS и 15 NIIEG был проведен поиск единичных однонуклеотидных замен с помощью программы Snippy [15]. В качестве референсного штамма для поиска использован геном штамма F. tularensis subsp. holarctica FSC200 (NCBI Accession Number NC_019551.1). По итогам анализа выявлены различия в 6 генах (табл. 3), причем в 3 случаях (штамм 15 NIIEG и 2 штамма LVS) обнаружены сдвиги рамок считывания.

Таблица 3. Выявленные различия между штаммами LVS и 15 НИИЭГ, найденные с помощью программы Snippy

Примечание. * — полиморфизм, приводящий к образованию сдвига рамки считывания.

Выделенный в Ростовской области в 1997 г. штамм №1238, а также выделенные в 2020 г. штаммы (№№210, 211, 257) и в 2022 г. штаммы (№№90, 795, 794, 792, 75, 464 и 463) генетически близки друг к другу и к хорошо изученному штамму FSC200, принадлежащему линии B.26-B.20-B.21 (см. рис. 1). Также из данных дендрограммы следует, что на территории Ростовской области циркулировали несколько разных генотипов штамма возбудителя туляремии этой подгруппы. Последовательности штаммов, выделенных во время эпидемической вспышки в 2013 г. в Ханты-Мансийском автономном округе, использованные в данной работе, исследовались ранее методом мультилокусного анализа количества тандемных повторов (MLVA), показавшего их отличие друг от друга только количеством повторов гипервариабельного локуса FtM-3. Три исследованных штамма (Kh-M 26-2, Kh-M 8m и B-7555) содержали 15 повторов, и один (B-7558) — 10 повторов [18]. На основе анализа данных полногеномного секвенирования этих штаммов установлено, что все 4 штамма принадлежат также подгруппе B.26-B.20 (или B.42), но штамм, содержащий 10 повторов гипервариабельного локуса FtM-3 (B-7558), генетически близок штамму 117, выделенному в Ростовской области в 1989 г., и штамму FDC 205, выделенному на территории Турции, который определяется в линии B.67, а Ханты-Мансийские штаммы, содержащие по 15 повторов гипервариабельного локуса FtM-3 (Kh-M 26-2, Kh-M 8m и B-7555), оказались близки штамму FDC 200, также выделенному на территории Турции, но принадлежащему линии B.68 (см. рис. 1).

Культура, выделенная от одного пациента при эпидемической вспышке в Ханты-Мансийске в 2013 г., при рассеве до изолированных колоний содержала 2 типа морфологически отличных колоний, различающихся по размеру: мелкие (одна из которых обозначена как штамм (X-8M) и крупные (одна из которых обозначена как штамм X-8K) [18]. Сравнение этих штаммов с помощью программы Snippy позволило выявить всего 3 полиморфизма, 2 из которых являлись синонимичными и не приводили к изменению аминокислотного состава (табл. 4). Таким образом появляется возможность изучения связи морфологических отличий штаммов с обнаружением изменений в структуре генов.

Таблица 4. Выявленные различия между штаммами Х-8м (B-7557) и X-8K (B-7556), найденные с помощью программы Snippy

Примечание. * — полиморфизм, приводящий к образованию сдвига рамки считывания; ** — синонимичная замена.

Систематизировать все разнообразие найденных микроорганизмов подвида F. tularensis subsp. holarctica необходимо для выявления источника при вспышках инфекции в стране, а также из-за наличия многочисленных трансграничных природных очагов туляремии при протяженных границах России с 16 государствами. В современных текущих схемах полногеномной филогении практически нет штаммов F. tularensis subsp. holarctica, выделенных на территории России, и, соответственно, нет представления о филогеографии циркулирующих в стране штаммов возбудителя туляремии. Сравнение последовательностей штаммов возбудителя туляремии, выделенных на территории Российской Федерации, с помощью различных программ, позволяет показать генетическое разнообразие F. tularensis subsp. holarctica, распространенных на территории страны, сравнить штаммы, обнаружить гены, имеющие отличия, определить родственные связи между штаммами, выявить идентичность генотипов штаммов, выделенных в разные годы и на разных территориях, установить наличие циркуляции нескольких генотипов на одной территории и указать место штаммов, выделенных на территории Российской Федерации, в международной иерархии возбудителя туляремии.

Заключение

Проведенное типирование 36 штаммов F. tularensis subsp. holarctica, выделенных в России в период с 1966 по 2023 г., позволило определить их родственные связи со штаммами, выделенными в разное время на территории страны и в других частях света. На территории Российской Федерации обнаружена циркуляция штаммов подвида F. tularensis subsp. holarctica основных филогенетических групп B.4, B.6 и B.12. Эритромицин-чувствительные российские изоляты F. tularensis subsp. holarctica, принадлежащие к основной филогенетической группе B.4, выделены из клеща Dermacentor reticulatus в Алтайском крае в 2011 г. (штамм A-1045), штамм B-8367 (или И-339), выделен от больного человека в Хабаровске в 1975 г. Эритромицин-чувствительные российские штаммы F. tularensis subsp. holarctica, принадлежащие к основной филогенетической группе B.6, подгруппе B.7, выделены в Ростовской области в 1996 г. (штамм №27), в г. Хабаровске от больного человека в 1968 г. (штамм B-8365 (или И-223). Исследованные последовательности российских эритромицин-устойчивых штаммов группы B.12 принадлежат к подгруппам B.26-B.23, B.26-B.20 и B.27. На территории Ростовской области кроме эритромицин-чувствительных штаммов с 1988 г. циркулируют генотипы эритромицин-устойчивых штаммов возбудителя туляремии основной филогенетической группы B.12, относящиеся к подгруппе B.27, которые также распространены на территории Донецкой Народной Республики, и два генотипа, принадлежащие разным ветвям подгруппы B.26-B.20. Эритромицин-устойчивые штаммы F. tularensis subsp. holarctica, выделенные на территории Ханты-Мансийского автономного округа в 2013 г. и содержащие разное количество тандемных повторов локуса M-3, принадлежат к разным линиям подгруппы B.26-B.20. Штамм, выделенный на территории Калмыкии в 1987 г., и вакцинный штамм 15 NIIEG относятся к разным линиям подгруппы B.26 (B.23).

Финансирование работы. Работа выполнена в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.