Введение

Acidovorax citrulli — это фитопатогенная бактерия, способная наносить значительный ущерб производству продукции тыквенных культур в местах своего распространения [1]. A. citrulli является карантинным организмом для многих стран [2]. Ранняя диагностика возбудителя — ключ к контролю его распространения [3]. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) является самым быстрым способом обнаружения бактерий в образце. При этом ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) — метод, требующий минимальных трудозатрат [4]. На сегодняшний день для диагностики A. citrulli применяется только один метод ПЦР-РВ, представленный в диагностическом протоколе Европейской и средиземноморской организации по карантину и защите растений (ЕОКЗР) PM7/127(1) [5]. Однако оценка специфичности данного теста показала неудовлетворительный результат [6]. В связи с высокой актуальностью проведено исследование, целью которого являлась разработка нового теста на основе ПЦР-РВ для идентификации A. citrulli.

Материалы и методы

Для поиска мишени использовали аннотированные белки, соответствующие кодирующим последовательностям 9 геномных сборок Acidovorax citrulli и 9 геномных сборок Acidovorax avenae, загруженным с NCBI RefSeq (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/) в сентябре 2019 г. (табл. 1).

Таблица 1. Геномные сборки штаммов A. citrulli и A. avenae, использованные для биоинформатического предсказания ПЦР-мишени

С целью получения неизбыточных наборов белков для каждого из геномов каждый набор белковых последовательностей кластеризовали с помощью программы cd-hit. Алгоритм программы производит группировку последовательностей по заданному пользователем порогу идентичности с использованием «жадного» алгоритма фильтрации по коротким «словам» (коротким частям последовательностей: дипептидам, трипептидам и др.). Для создания неизбыточного набора последовательностей использовали порог идентичности 90%, допустимая разница в длине последовательностей составила 80%.

Неизбыточные наборы белковых последовательностей 9 штаммов A. citrulli и 9 штаммов A. avenae были помечены в соответствии с видом и кластеризованы с помощью программы cd-hit при пороге идентичности в 60% и допустимой разнице в длине последовательностей 80%. Для идентификации белковых кластеров, присутствующих во всех 9 штаммах A. citrulli и отсутствующих во всех 9 штаммах A. avenae, нами был применен скрипт на языке Python.

Полученные белковые кластеры, присутствующие у A. citrulli и отсутствующие у A. avenae, сравнивали с известными белковыми последовательностями (nr) с помощью программы blastp с целью оценки их специфичности для A. citrulli. Специфичными считались белки, имеющие низкое сходство (<70% идентичности) с белками других бактериальных видов как родственных, так и не родственных A. citrulli. Из анализа исключили фаговые белки, а также белки, имеющие внутривидовую вариабельность у A. citrulli как неподходящие в качестве мишени.

Праймеры подбирали с использованием программы PrimerBlast.

Праймеры и зонд произведены ЗАО «Евроген» (Россия).

Оценку аналитической специфичности нового метода ПЦР-РВ проводили со следующими штаммами: изоляты A. citrulli, выделенные из растений арбуза в США, Испании и Китае и позднее заложенные в Испанской коллекции фитопатогенов Института сельскохозяйственных исследований (IVIA), г. Валенсия под номерами 51, 2609 и 3000 соответственно. Также в исследовании использовали 2 штамма A. citrulli DLS 1035, выделенные из экстрактов семян арбуза и дыни, и штамм DLS 1456, выделенный из экстракта семян арбуза; происхождение экстрактов — Италия. Также использовали следующие нецелевые бактерии: Acidovorax cattleya (NBC 430), Arthrobacter castelli, Arthrobacter sp. (2 изолята), Burkholderia sp., Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (3 изолята), Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis (CFBP (Франция) 2405 и 3491), Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (10 изолятов, а также штамм NCPPB (UK) 2137), Curtobacterium sp. (2 изолята), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flacumfaciens (1 изолят, а также штамм CFBP 3418), Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii (CFBP 1384), Curtobacterium flaccumfaciens pv. poinsettiae (CFBP 2403), Dickeya sp. (изолят из коллекции EVIRA, Финляндия), Dickeya chrysanthemi (DSMZ (Германия) 4610-0508-001), Dickeya dadantii subsp. dadantii (DSMZ 18020-1112-001), Dickeya dadantii subsp. dieffenbachiae (DSMZ 18013), Dickeya paradisiaca (DSMZ 18069-0406-001), Dickeya solani (DSMZ 28711), Dickeya zeae (DSMZ 18068-0816-001), Enterobacter amnigenus, Erwinia amylovora (47 изолятов, а также штаммы CFBP 1430 и 3025, ACW (Швейцария) 35298, 35295, 58459, 37905, 35356 и 57467, LMG (USA) 2068 и NCPPB 683), Erwinia billingiae, Erwinia piriflorinigrans (2 изолята), Erwinia tasmaniensis, Microbacterium sp. (2 изолята), Microbacterium phyllosphaerae, Ochrobactrum anthropi, Ochrobactrum lupini, Ochrobactrum sp. (2 изолята), Paenibacillus, Pantoea agglomerans (2 изолята, а также штамм DSMZ 1619), Pantoea ananatis, Pantoea dispersa, Pantoea stewartii subsp. stewartii (6 изолятов), Pectobacterium atrosepticum (штамм DSMZ 18077 и изолят из коллекции EVIRA, Финляндия), Pectobacterium betavasculorum (DSMZ 18076-0306-001), Pectobacterium cacticida (DSMZ 21821-0908-001), Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (DSMZ 30168), Pectobacterium carotovorum subsp. odoriferum (DSMZ 22556-0509-001), Pectobacterium wasabiae (DSMZ 18074-0315-001), Phyllobacterium sp., Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas congelans (ICMP (Новая Зеландия) 9032), Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fuscovaginae (DSMZ 7231-0205-001), Pseudomonas graminis, Pseudomonas hibiscicola, Pseudomonas savastanoi pv. glycinea (CFBP 2214), Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (штаммы CFBP 1390, 1429 и 3652), Pseudomonas syringae pv. syringae (2 изолята), Pseudomonas syringae, Rahnella aquantilis, Ralstonia solanacearum (16 изолятов, а также штаммы NCPPB 2315 и 2316, AOBC PPSCD (Венгрия) 1069 и 1071), Rathayibacter tritici (CFBP 1385), Sphingomonas paucimobilis, Stenotrophomonas sp. (2 изолята), Stenotrophomonas maltophilia, Xanthomonas arboricola pv. pruni, Xanthomonas axonopodis pv. alli (CFBP 6107), Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (CFBP 2534), Xanthomonas campestris pv. campestris (2 изолята), Xanthomonas campestris pv. raphani (NCPPB 1946), Xanthomonas euvesicatoria (DSMZ 19128), Xanthomonas fragariae (NCPPB 1469), Xanthomonas gardneri (DSMZ 19127), Xanthomonas hyacinthi, Xanthomonas oryzae pv. oryzae (NCPPB 3002), Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (CFBP 2286), Xanthomonas perforans (DSMZ 18975), Xanthomonas translucens (DSMZ 18974), Xanthomonas vesicatoria (DSMZ 22252), Xylella fastidiosa и Xylophilus ampelinus (2 изолята, а также штамм LSV 28.02, Франция). Всего для проведения тестов использовали 188 штаммов нецелевых бактерий.

ДНК-матрицу всех штаммов брали в концентрации 15—20 нг/мкл. Для измерения концентрации использовали спектрофотометр NanoDrop 2000C Thermo Fisher Scientific (США). Каждый штамм тестировали в трехкратной повторности.

Так, qPCR проводили, используя следующий состав смеси на 1 реакцию: 12 мкл деионизированной воды, 5 мкл мастер-микса 5X qPCRmix-HS производства фирмы ЗАО «Евроген» (Россия), по 1 мкл каждого праймера в концентрации 10 пкм, 1 мкл зонда в концентрации 5 пкм и 5 мкл ДНК-матрицы. Для проведения ПЦР использовали амплификатор детектирующий ДТпрайм, ООО «ДНК-Технология» (Россия). Программа амплификации: начальная денатурация — 5 мин при 95 °C, затем 40 циклов: 10 с при 94 °C, 30 с при 62 °C и 20 с при 72 °C.

Результаты и обсуждение

В результате кластеризации белковых последовательностей штаммов A. citrulli и 9 штаммов A. avenae были идентифицированы 4744 белковых кластера, содержащих 2 и более белков. Не были определены ни в один кластер 977 белков.

Нами было идентифицировано 153 белковых кластера (размером от 60 до 1389 аминокислот), присутствующих во всех 9 штаммах A. citrulli и отсутствующих во всех штаммах A. avenae. Большинство из данных кластеров были аннотированы как мембранные белки, рестриктазы, фаговые белки и др. В результате сравнения полученных белковых кластеров с известными белковыми последовательностями (nr), многие из них были исключены из кандидатов на ПЦР-мишень, поскольку имели высокое сходство с белками других бактериальных видов и родов (таких как Variovorax, Ottowia, Stenotrophomonas, Bordetella и др.), хотя их кодирующие последовательности и отсутствовали в геноме близкородственного вида A. avenae.

В результате такого отбора нами был идентифицирован белок S-box длиной 524 аминокислотных остатка (WP_011796953.1). Этот белок принадлежит домену PAS и участвует в принятии бактерией сигналов, таких как фотоны, молекулы газа и др. Сигнальные домены PAS встречаются у многих организмов, но отличаются высокой вариабельностью (идентичность около 20%) [7]. Белок S-box домена PAS был идентичен во всех 9 штаммах A. citrulli и не имел значительного (согласно вышеупомянутому критерию в 70% идентичности) сходства с другими белками.

Кодирующая последовательность A. citrulli штамма AAC00-1 # 5596 (NZ_QUNC01000001.1), соответствующая белку WP_011796953.1 (locus_tag=«C8E07_RS00895»), была в дальнейшем использована для разработки праймеров. Были подобраны следующие праймеры на ген S-box PAS домена (локус C8E07_RS00895) A. citrulli штамма AAC00-1 #5596 (NZ_QUNC01000001.1) (табл. 2).

Таблица 2. Последовательности праймеров и зонда на локус C8E07_RS00895

В ходе оценки специфичности ПЦР-РВ были получены положительные результаты реакции со всеми 6 штаммами A. citrulli. Проведение реакции с 188 нецелевыми бактериальными изолятами показало отрицательные результаты. Таким образом, новый метод ПЦР-РВ, основанный на нуклеотидной последовательности гена S-box PAS домена, позволяет проводить выявление и идентификацию A. citrulli, избегая перекрестных реакций с нецелевыми бактериями.

Заключение

В данном исследовании методом кластеризации белковых последовательностей геномов A. citrulli и A. avenae были получены 153 белковых кластера, присутствующих только в штаммах A. citrulli. После анализа полученных кластеров на предмет их специфичности для A. citrulli нами был идентифицирован белок S-box PAS домена. Кодирующая последовательность, соответствующая данному белку, была использована для подбора праймеров и зонда. В результате оценки специфичности нового метода ПЦР-РВ было установлено, что тест подходит для обнаружения и идентификации всех штаммов A. citrulli и не приводит к получению ложноположительных реакций с нецелевыми бактериями. Использование нового метода ПЦР-РВ для идентификации A. citrulli, основанного на последовательности, кодирующей белок S-box домена PAS, позволит быстро проводить тестирование здоровья продукции тыквенных культур в условиях рутинной диагностики.

Соблюдение этических стандартов

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Информация о соблюдении стандартов работы с животными: настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

Информация об исследованиях, где в качестве объектов выступали люди: настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Финансирование. Отсутствует.

The authors declare no conflicts of interest.