История синтетической биологии

Управление функциями клеток, их развитием и поведением представляло интерес с ранних этапов развития биологии как отдельного направления науки. На протяжении всего XX века попытки направленного изменения фенотипа ограничивались аппликацией какого-либо внешнего фактора, в результате чего клетки либо кратковременно, либо неконтролируемо меняли свой фенотип. Ситуация начала меняться с появлением синтетической биологии (СБ). Как и многие другие направления, СБ развивалась нелинейно, временами представляя собой мировой тренд развития биотехнологий, временами переходя в стадию застоя. Также не сразу возникло и определение СБ. Сегодня принято считать, что СБ — это область, в которой применяются методы и техники молекулярной биологии для формирования заданного поведения клеток на основе теоретически сконструированных регуляторных сетей с применением инженерных подходов (следует отметить, что это не единственное определение, однако, с точки зрения авторов, наиболее емко отражающее происходящее в данном направлении). Под «инженерными подходами» понимается конструирование сложных генетических сетей из простых функциональных элементов (блоков), взаимодействующих друг с другом в зависимости от внешних условий. Именно инженеризация, представленная на начальных этапах дизайном и конструированием таких элементарных блоков, а на более поздних — построением из них комплексных генетических сетей с обратной связью, отличает СБ от других способов получения организмов с заданными свойствами. Например, в отличие от классического использования молекулярных биосенсоров для измерения физического, механического или химического стресса в биореакторах синтетико-биологический подход предполагает конструирование регуляторных сетей на основе этих биосенсоров, интегрирующих ответы сразу от нескольких сигналов, причем с возможностью варьировать минимальный порог обнаружения целевой молекулы и без взаимодействия компонентов сети с нормальной внутри- и межклеточной средой и другими сетями.

Истоком СБ можно считать работу Ф. Жакоба и Ж. Моно 1961 г., в которой впервые было продемонстрировано наличие генной сети в клетках бактерий, состоящей из нескольких функциональных блоков, способной отвечать на определенные факторы внешней следы [1].

В период с 1961 по 2000 г. происходило накопление знаний в области структурной и функциональной молекулярной биологии, появлялись новые технологии и методы. Особым этапом в аспекте развития СБ можно считать разработку технологий рекомбинантных ДНК и следующее за ней бурное развитие методов генной инженерии, положивших основу технологиям практической реализации инженерных принципов в синтетической биологии [2].

О первой синтетической регуляторной сети было сообщено в 2000 г. Работа представляла результаты искусственной генетической сети (ИГС), в которой несколько генов репрессировали друг друга [3]. Это была первая бистабильная, зависимая от амплифицируемого внешнего фактора, ИГС.

В это же время М. Эловитц и С. Лейблер представили результаты работы по созданию осциллирующей искусственной цепи на основе репрессии, которую авторы назвали репрессилятором [4].

Важными вехами в развитии СБ стали работы, в которых продемонстрирована межклеточная ИГС, блоки которой находятся в различных клетках, образуя при этом единый функционал за счет обмена продуктами экспрессии этих блоков [5]. Межклеточные сети у бактерий в дальнейшим стали более тонко настраивать за счет использования «чувства кворума», что позволило создавать еще более сложные ИГС [6]. Работы по управлению поведением клеток млекопитающих начали появляться лишь в середине 2000-х годов, в то время как дрожжи применялись для этих целей с начала нулевых, хоть и значительно уступали бактериям по количеству сконструированных для них сетей.

Инженеризация биологических сетей

Схемотехника в синтетической биологии

Клетку можно рассматривать как устройство, выполняющее несколько типов основных функций: сенсорную (восприятие входящих сигналов), обработку поступившей информации, формирование ответа. Входящими сигналами являются эндогенные и экзогенные физические или химические факторы, воздействие которых приводит к запуску каскадов обработки информации. К таковым можно отнести сигнальные и метаболические пути, изменения в которых, как правило, приводят к модификации транскрипционного профиля. Ответ заключается в перемене метаболического профиля с последующими физиологическими изменениями. Учитывая это, можно проводить прямую аналогию между клеткой и компьютером, что в свою очередь дает все основания применить принципы инженерии к естественным биологическим системам в целом и к генетическим сетям в частности.

В 1995 г. Х. МакАдамс и Л. Шапиро впервые приводят аналогию между электрическими и генетическими сетями, вводят термин «вентиль» и фактически внедряют понятие схемотехники в генетику [7]. Это позволило систематизировать и схематизировать внутриклеточные процессы, что в свою очередь привело к более техническому пониманию происходящих процессов, а также упростило процедуры дизайна ИГС и дало возможность формировать различные сложные генетические функции. Например, подход с использованием электро-схемотехнической классификации позволяет упорядочить типы используемых схем взаимодействий для применения в синтетической биологии.

В цифровых сетях уровни сигналов, которые ниже или выше фонового значения, рассматриваются как «0» или «1» соответственно. Основным понятием в них является «логический вентиль», который представляет собой абстрактное в общем понимании устройство, реагирующее определенным образом в зависимости от суммы условий. Под «суммой условий», если рассматривать клетку, понимаются структурные (качественные) или количественные характеристики определенных молекул А и В внутри клетки или во внешней среде (обозначаются «входы» А и В), являющиеся необходимыми для качественных или количественных изменений молекулы Y (обозначается «выход» Y). Существуют 3 основных логических вентиля — NOT (НЕ), OR (ИЛИ), AND (И) — и несколько их комбинаций. Принципиальным является наличие не менее, чем двух условий для получения ответа (за исключением вентиля NOT). Пример открытого Ф. Жакобом и Ж. Моно лактозного оперона с точки зрения электросхемотехники представляет собой вентиль ANDN (комбинация AND и NOT): для экспрессии бета-галактозидазы обязательно должны быть соблюдены условия одновременного наличия лактозы и отсутствия глюкозы (рис. 1) [1].

Рис. 1. Комплексный логический вентиль «ANDN» на примере лактозного оперона.

Транскрипция бета-галактозидазы происходит только в условиях наличия лактозы и одновременного отсутствия глюкозы.

Логический вентиль XOR часто представлен более сложными взаимодействиями. Выходной сигнал этого вентиля наблюдается только в случае присутствия одного из субстратов. На рис. 2 представлен пример искусственной сети, в которой экспрессия зеленого флуоресцентного белка — GFP — происходит в присутствии либо изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида — IPTG («вход А»), либо ангидротетрациклина — aTc («вход B») [8, 9].

Рис. 2. Схема перекрестной индукции/репрессии.

Сверху вниз: гены репрессоров LacI, TetR на матрице ДНК; мРНК репрессоров. Острые стрелки отражают индукцию, Т-образные пунктирные стрелки отражают репрессию. Экспрессия двух белков LacI и TetR происходит конститутивно с одного промотора. В системе присутствуют два гена, кодирующих GFP, под контролем разных промоторов. LacI и TetR являются индукторами для одного из промоторов, но репрессорами для другого. Т.е. когда оба белка находятся в активном состоянии, они ингибируют соответствующие промоторы. При добавлении IPTG он связывается с LacI, что приводит к снятию репрессии с промотора, активируемого TetR. При добавлении aTc он связывается с TetR, что приводит к снятию репрессии с промотора, активируемого LacI. Если же в среде присутствуют и IPTG, и aTc, то репрессия снимается с обоих промоторов. Но экспрессии GFP при этом не происходит, так как отсутствует индукция.

Логический вентиль NOR описывает ситуацию, при которой сигнал на выходе наблюдается, только если на входе отсутствуют определенные стимулы. В качестве примера можно рассмотреть сеть, в которой вентиль NOR создавался присоединением дополнительного индуцируемого промотора к гену, кодирующему репрессор эффекторного гена. При активации любого из промоторов данного гена или обоих промоторов сразу индуцировалась экспрессия репрессора, который связывался с промотором эффекторного гена, ингибируя его экспрессию [10].

Остальные логические вентили также находят свое применение в СБ, а их различные комбинации расширяют сферы применения ИГС, опосредуя все большую инженеризацию биологической науки [11].

Многослойные и аналоговые ИГС

Выше были приведены примеры простых ИГС, однако для реализации систем более тонкой регуляции приходится конструировать более сложные. Как правило, в таких сетях выходы одних вентилей являются входами для других. Такие ИГС принято называть многослойными. Как и простые ИГС, многослойные также направлены на единый результат, выражающийся в активации или репрессии экспрессии какого-либо гена либо же регуляции работы конкретного фермента.

Усложнение многослойных ИГС происходит через увеличение количества входов (больше, чем 2 на первый слой) и выходов (больше, чем 1 у первого или последнего слоя ИГС). Конструирование подобных ИГС долгое время оставалось затруднительным из-за большого количества перекрестных взаимодействий компонентов при одновременной их аппликации. В 2017 г. был предложен принцип конструирования монослойных ИГС в клетках млекопитающих, в основе которого лежат механизмы сайт-специфической рекомбинации. При этом тирозиновые рекомбиназы использовали для эксцизии сайтов, окружающих регуляторные последовательности, сериновые — для инверсии этих фрагментов, что в итоге приводило к активации промотора или терминатора. Таким способом были сконструированы все 16 логических вентилей [11].

Следует отметить, что основная масса ИГС строится на основе принципа дискретности, т.е. по аналогии с электрическими сетями, в которых существуют два состояния: присутствие сигнала — 1, его отсутствие — 0. Однако биологические системы не могут быть полностью дискретными и в массе своей являются аналоговыми. При конструировании дискретных сетей обычно пренебрегают незначительными фоновыми значениями и амплитудой сигнала, если они не сказываются на общем функционале сети. Вследствие этого конструирование аналоговых ИГС является одним из основных векторов развития синтетической биологии. По мнению ряда авторов, именно они позволят создать так называемые «клеточные электронно-вычислительные машины» [12]. В 2013 г. были предложены ИГС, реализующие математические функции, цифровая репрезентация которых потребовала бы построения сложнейшей многослойной сети с большим количеством вентилей. Аналоговая же реализация включала всего 2 фактора транскрипции, функции которых модулировались широким диапазоном концентраций их индукторов. В основе модуляции находились петли положительной обратной связи. При этом активация обеих петель обратной связи интерпретировалась клеткой как отношение между ними [13].

Таким образом, вызовы современной биологической науки требуют конструирования как аналоговых ИГС, потенциал которых может быть успешно применен, например, в области биосенсоров, о чем подробнее сообщается в разделе «Применение», так и сложных, многослойных сетей, позволяющих реализовывать более сложные функции внутри клеток.

Полусумматоры

Примерами таких многослойных сетей являются, в частности, полусумматоры и полувычитатели. Два соединенных полусумматора представляют собой сумматор. В цифровых вычислениях сумматоры являются ключевыми компонентами сдвиговых регистров, двоичных счетчиков и последовательно-параллельных преобразователей. Полусумматор — это многослойная логическая схема, состоящая из базовых вентилей, но имеющая два выхода: первый отражает сумму значений входов (SUM), второй также отражает ее и заодно переносит результат суммы к следующему полусумматору (CARRY) в качестве входа. Разработка подобных систем в прокариотах дает возможность улучшения контроля и принятия решений клеткой при производстве лекарств и биотоплива, биосенсоров, пробиотиков и т.д., в то время как полусумматоры в эукариотах могут играть роли в терапевтических приложениях. Так, используя в качестве входов арабинозу и рамнозу (наличие каждой равно 1, отсутствие равно 0), в качестве выхода SUM — красный флуоресцентный белок (его появление в системе соответствует сумме равной 1), выхода CARRY — зеленый флуоресцентный белок (появление его в системе равно 2), удалось реализовать ортогональный полусумматор в E. coli [14]. Ортогональностью в контексте СБ принято называть отсутствие влияния искусственных регуляторных элементов на нативные компоненты клетки. Работа по конструированию этих сетей неожиданно для самих авторов позволила определить оптимальную топологию элементов сети для более эффективного ее функционирования [14].

Возможность реализации фундаментальных арифметических операций с использованием полусумматоров и полувычитателей на культуре клеток млекопитающих была показана еще в 2012 г. [15]. В качестве входов системы использовались антибиотики, в качестве выходов — флуоресцентные белки, а «ядром» многослойной сети выступали так называемые контроллеры РНК, то есть белки или нуклеиновые кислоты, влияющие на трансляцию, связываясь с конкретными мотивами мРНК. Например, белок оболочки фага MS2, связывающий РНК-мотив MS2-бокс, и рибосомальный белок архей ингибируют трансляцию содержащих соответствующие боксы мРНК. Используя эти свойства, а также антибиотик-зависимые трансактиваторы транскрипции, возможно конструировать комплексные сети с заданными свойствами. Важным результатом серии работ, посвященных полусумматорам, является реализация полного сумматора на примере 3D-культуры клеток млекопитающих [16]. Благодаря практически неограниченной суммарной вычислительной мощности клеточных культур, а также детерминированному ответу на различные эндогенные и экзогенные стимулы, ИГС на основе полных сумматоров открывают новые возможности в тканевой инженерии, а также могут привести к значительному упрощению скрининга потенциальных лекарственных препаратов на 3D-культурах в дальнейшем.

Инженеризация биологических сетей, как было сказано выше, обусловлена идеей прямой аналогии между клеткой и компьютером. В рамках подобной инженерной логики должен быть сформирован молекулярный инструментарий, используемый для конструирования ИГС и функционирующий в широком диапазоне возможностей. Так как инженерный взгляд предполагает формирование сетей из взаимодействующих элементарных блоков (функциональных частей), необходимо определить подходы к получению этих блоков.

Элементарные блоки и уровни регуляции

На сегодняшний день применяются два подхода получения новых функциональных частей генетических сетей:

1) включает поиск естественных функциональных элементов в базах данных генетических последовательностей (part mining);

2) основан на конструировании направленных регуляторов, таких как химерные транскрипционные факторы, сшитые с нуклеазным белком системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR/Cas) или с транскрипционными активатор-подобными эффекторами TALEN. Подобные регуляторы могут быть также представлены рибопереключателями типа «toehold» и т.п.

При этом первый подход осложняется требованием ортогональности при выборе регуляторных частей ИГС. Специфичность же второго подхода обусловливается изначальными требованиями ортогональности к конструируемым частям. Результатом применения любого из этих подходов является молекула или набор молекул, осуществляющих свою функцию на одном из возможных уровней регуляции: генетическом, транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном или посттрансляционном.

Генетическая регуляция

Регуляция на генетическом уровне происходит за счет модификации последовательности ДНК регуляторного элемента или его окружения. Рекомбиназы представляют собой один из наиболее часто используемых инструментов для создания искусственных генетических сетей с заданными свойствами. Удобство использования рекомбиназ обусловлено их ортогональностью, с одной стороны, и большим их разнообразием, с другой [17]. Преимуществом рекомбиназ также являются их автономность и многообразие функций: делеция, интеграция, инверсия фрагментов ДНК. Также нельзя не отметить и тот факт, что сегодня существуют технологии получения искусственных рекомбиназ, специфичных к заданным последовательностям, что создает еще больше возможностей для конструирования ИГС. Рекомбиназы могут применяться для построения как простых сетей, в которых часто используется инверсия части промотора для обратимого ингибирования транскрипции, так и комплексных, через каскадную активацию или многослойные алгоритмы активации элементов ИГС. В то же время использование рекомбиназ позволяет избежать конструирования многослойных сетей на основе логических вентилей. Например, недавно была протестирована регуляторная сеть с формированием генетической памяти, работы по разработке которой тоже являются примерами инженеризации биологических сетей. В описанной сети химические стимулы использовались для индукции экспрессии рекомбиназ (для каждой рекомбиназы отдельный стимул). В зависимости от экспрессии конкретной рекомбиназы последняя осуществляла либо инверсию, либо эксцизию определенного сайта, что приводило к изменению регистра и формированию памяти для последнего состояния [18].

К другому подтипу регуляции на генетическом уровне можно отнести системы направленного редактирования геномов. Зарекомендовавшие себя системы на основе белков-цинковых пальцев (ZFN) TALEN и CRISPR/Cas получили широкое распространение при конструировании генетических сетей [19]. Модули, распознающие целевые последовательности в ZFN и TALEN, представлены белками. Для большинства случаев конструирования генетических сетей это не совсем удобно, так как любые изменения дизайна сети требуют полной «пересборки» направляющих белков. В то же время системы на основе CRISPR гораздо удобнее, так как направляющим элементом в них является РНК. Дизайн и получение последней сегодня является рутинной процедурой [20, 21].

Транскрипционная регуляция

Транскрипционный уровень регуляции можно считать важнейшим в аспекте как пространственной, так и временной организации функционала генетических регуляторных сетей. В отличие от генного уровня транскрипционный позволяет не только качественно, но и количественно регулировать экспрессию отдельных блоков сети. Большинство ИГС построено на взаимодействии между блоками посредством пространственно-временной регуляции транскрипции.

Наиболее часто используемыми в конструировании искусственных сетей являются транскрипционные факторы белковой природы, представленные активаторами или репрессорами транскрипции. Между тем не любой транскрипционный фактор может стать элементом синтетической регуляторной сети. В контексте СБ значение имеют лишь ортогональные транскрипционные факторы, что отражается на их разнообразии при конструировании ИГС. В случае прокариот наиболее часто используемыми являются LacI, TetR и cI, а в случае эукариот VP16, Gal4, KRAB, tTA. В этой связи фокус исследований многих групп сосредоточен на получении искусственных ортогональных пар промотор — транскрипционный фактор. Ряд таких работ привел к значительным успехам. В частности, были получены 12 вариантов транскрипционного фактора cI бактериофага λ, которые могут проявлять как репрессорную, так и активаторную активность по отношению к подконтрольным генам с бинаправленными промоторами. Помимо этого также было предложено 270 различных последовательностей искусственных промоторов для этого транскрипционного фактора, что позволяет создать комплексную сеть, используя лишь различные варианты cI с комбинациями промоторов в качестве элементарных блоков [22].

Посттранскрипционная регуляция

Белковые регуляторы представляют собой большой, но не единственный класс регуляторных макромолекул, позволяющих модулировать экспрессию генов в зависимости от внешних условий. Другим классом являются регуляторные РНК, разнообразие которых позволяет конструировать как «цифровые», так и «аналоговые» ИГС. Например, интеграция в 5’-нетранслируемую область эукариотической мРНК белок-связывающего аптамера позволяет регулировать ее трансляцию [23]. В СБ нашли применение так называемые автокаталитические рибозимы, которые представлены относительно короткими РНК-мотивами, способными катализировать расщепление РНК при изменении конформации. Было, в частности, показано, что искусственная интеграция рибозима в различные области эукариотической РНК приводит к расщеплению последней и снижению экспрессии соответствующего гена [24]. Активность рибозима можно контролировать посредством интеграции в часть его структуры аптамера, позволяющего индуцировать активность получившегося аптазима специфическими лигандами. В свою очередь, интеграция аптазима в структуру мРНК дает возможность контролировать экспрессию заданного гена этими лигандами [25]. Большинство ИГС, функционирующих как логические устройства, конструируются на основе белковых регуляторов, взаимодействующих, как правило, с низкомолекулярными соединениями, определяющими их активность. Однако РНК также могут выполнять роль всех элементов систем передачи сигналов: сенсоров, процессоров и актуаторов. В подтверждение этого была представлена работа, в которой основные логические вентили были сконструированы на основе РНК: вентиль AND был сконструирован посредством интеграции в 3’-нетранслируемую область мРНК двух аптазимов, каждый из которых взаимодействовал со своим лигандом. Аналогичного эффекта удалось добиться формированием аптазима, контролируемого двумя аптамерами, специфичным к разным лигандам [26].

Трансляционная регуляция

Создание искусственных функциональных элементов клетки сфокусировано и на трансляционной машинерии. Работы, ведущиеся в этой области, включают как создание ортогональных рибосом, взаимодействующих с определенными мРНК [27], так и конструирование трансляционного аппарата, ориентированного на искусственный генетический код [28]. В частности, было продемонстрировано, что естественные рибосомы могут встраивать в синтезируемые белки более 150 неканонических аминокислот [29—31], катализировать полимеризацию непептидных полимеров (например, полиэстеров) [32]. Возможность использования стратегии мультиплексной автоматизированной инженерии геномов (MAGE) в создании высокоселективных и ортогональных ааРС-тРНК пар способствует включению неканонических аминокислот в полипептидную цепь in vivo [33].

Посттрансляционная регуляция

Принципы инженеризации используются также для перенастройки нативных биологических сетей, например, было продемонстрировано искусственное переключение путей активации MAPK [34] (рис. 3). Такое переключение возможно при наличии в сигнальных путях общего звена, связывающегося со скаффолдными белками. Позднее этой же группой была предложена концепция искусственных скаффолдных белков, специфичность связывания разных звеньев каскада которыми может быть изначально задана посредством «пришивания» к целевым белкам аминокислотной последовательности, аффинной к домену скаффолда. При этом, задавая силу связывания аминокислотной последовательности со скаффолдом, удавалось добиться более тонкой регуляции данного сигнального пути, например, через введение в него дополнительных звеньев или, наоборот, через их делецию [35].

Рис. 3. Переключение MAPK пути.

Два различных сигнальных каскада в дрожжах осуществляются посредством работы белка Ste11: 1) передача сигнала о повышении осмолярности и 2) феромон-зависимое размножение. Используя этот факт, был создан гибридный путь, начало сигнального каскада в котором проходило по феромон-зависимому пути до звена Ste11, а далее сигнал передавался по пути ответа на высокую осмолярность, то есть клетки реагировали на феромон аналогично гиперосмотическому ответу. Сверху слева показан путь при клеточном ответе на феромон, справа сверху — при ответе на гиперосмотические условия. Снизу показан объединенный путь благодаря общему звену — Ste11.

Еще одним важным белковым инструментом СБ являются интеины, цис- или транссплайсинг которых используется, например, для доставки больших конструкций в клетки млекопитающих [36], детектирования белок-белковых взаимодействий in vivo [37], лиганд-зависимой активации белков [38], редокс-зависимой активации [39] и т.д. На примере транскрипционных факторов на основе цинковых пальцев (ZF-TF) транс-сплайсинг интеинов использовали для конструирования NAND и AND логических сетей [40]. По подобной схеме создали простейшую AND сеть с тремя ВВОДами, но на примере TALE. Для этого использовали транс-сплайсинг трех частей мини-интеина dnaB [41]. Чуть позже была показана возможность использования интеинов для конструирования полосового фильтра (band-pass filter), широко используемого в СБ для экспрессии продукта только при средних уровнях концентрации ВВОДа. Такой фильтр зачастую требует наличия AND вентиля, которым послужила уже созданная система [42].

Применение

Наибольшее количество ожиданий применения технологий синтетической биологии связано с медициной. Созданные и разрабатываемые концепции СБ дают возможность оптимистичных прогнозов формирования новых классов диагностических и терапевтических решений. В ряде случаев такие решения уже внедряются в практическую медицину. Свое применение находят как молекулярные компоненты генетических сетей, так и модифицированные клетки. Так, в настоящий момент проходят регистрационные процедуры для новых типов тест-систем, основанных на РНК-переключателях типа toehold, особенностью которых является возможность точного обнаружения заданной последовательности РНК. В частности, подобные тест-системы были предложены для быстрого обнаружения вирусов Зика и Эбола [43, 44]. Эта же технология с небольшими модификациями была предложена для оценки профиля микробиоты и выявления связанных с ней биомаркеров заболеваний [45].

Сегодня рассматриваются различные аспекты применения принципов и инструментов СБ, начиная от более глубокого понимания клеточных функций, заканчивая диагностическими и терапевтическими системами. В отличие от ранних подходов «слепого» конструирования, при котором изменения, вносимые в клетки, часто приводили к непредсказуемым результатам, принцип направленного конструирования позволил прогнозировать поведение клетки при применении тех или иных инструментов изменения генома и фенотипа клеток. Это позволило повысить эффективность разработок, главным образом, за счет снижения издержек, возникающего по причине большого количества ошибок при «слепом» конструировании. Так, например, ортогональность продуктов искусственных генетических сетей значительно снижает их влияние на внутриклеточное окружение. С другой стороны, такие инструменты, как язык булевой логики, обеспечили повышение эффективности теоретического этапа конструирования, благодаря чему искусственные генетические сети стали более комплексными по структуре и многофункциональными по сути.

При создании молекулярных инструментов, таких как РНК-переключатели, эффекторные гены, рекомбиназы, искусственные промоторы и т.п., также стал учитываться принцип ортогональности.

Одним из главных достижений СБ можно смело назвать уход от дискретности при внесении каких-либо модификаций генома. Сегодня мы можем с большой точностью прогнозировать количественные характеристики вносимых изменений, что крайне важно для медицинских и биотехнологических приложений продуктов, созданных с применением подходов модификации генома. Создаваемые сегодня ИГС становятся все более «аналоговыми», степень выраженности отдельных частей которых можно регулировать как внешними факторами, так и через петли обратной связи.

Микробиота также является объектом пристального внимания при разработке новых терапевтических подходов, что объясняется относительной простотой конструирования бактерий с заданными свойствами и сниженными по сравнению с вмешательством в клетки человека рисками. А именно были предложены несколько подходов терапии воспалительных заболеваний кишечника, основанных на секреции представителями кишечной микробиоты (Lactococcus lactis) противовоспалительных цитокинов, в том числе IL-10 [46], или антител, направленных на провоспалительные цитокины [47]. Подходы, основанные на использовании способностей бактерий продуцировать заданные, в том числе терапевтические соединения, рассматриваются и в противоопухолевых стратегиях. Было предложено решение, в основе которого лежит модификация E. coli с целью переноса в клетки человека плазмидного вектора, кодирующего короткие шпилечные РНК (shRNA), ингибирующие продукцию катенина бета-1, гиперэкспрессия которого наблюдается при некоторых типах рака [48]. Терапевтический потенциал бактериальных клеток заключается не только в их способности продуцировать заданные соединения, но и в возможности таргетной доставки этих соединений непосредственно к очагам заболевания с помощью модификаций клеточной стенки бактерий, направленных на способность узнавать специфические антигены на поверхности эукариотических клеток. В итоге была продемонстрирована способность модифицированных клеток E. coli колонизировать очаг пролиферации опухоли [49].

Использование технологий СБ для модификации бактериальных представителей микробиоты человека открывает большие возможности для терапии не только локальных заболеваний кишечника. Инфекционные и метаболические болезни также находятся в поле внимания исследователей. Разрабатывается терапия с использованием внедренных в микробиотические консорциумы искусственных генетических сетей. Например, на животных моделях была продемонстрирована стратегия репрограммирования клеток кишечника в инсулин-продуцирующие клетки посредством конструирования GLP-1 секретирующего штамма Lactobacillus gasseri [50]. Подход с использованием микробиоты представил эффективную стратегию превентивной анти-ВИЧ-терапии: модификация представителя микробиоты влагалища — Lactobacillus jensenii, направленная на формирование штамма, продуцирующего циановирин (обладающий определенной активностью против ВИЧ), снижала обсемененность ВИЧ у подопытных макак на 63% [51].

Одним из важнейших примеров внедрения в клиническую практику технологий СБ для современного мирового здравоохранения является CAR-T терапия. В ее основе лежит искусственно-конструируемый антигенный рецептор, индукция которого приводит к противоопухолевой активации Т-клеток [52]. В настоящий момент проводится большое количество исследований, направленных на повышение эффективности CAR-T и создание альтернативных, в том числе лиганд-индуцируемых вариантов данного метода. В качестве одного из вариантов рассматривается применение синтетических Notch-рецепторов (SynNotch), активация которых поверхностными антигенами позволяет создавать более точные системы, активируемые свободными лигандами или поверхностными антигенами и приводящие в конечном итоге к индукции экспрессии трансгена [53]. Развитие концепций СБ как терапевтических стратегий наиболее активно происходит в направлении модификации иммунных клеток посредством комбинации различных растворимых и трансмембранных рецепторов и, главным образом, направлено на достижение ортогональности искусственных каскадов повышенной специфичности. Одновременно с этим ведутся работы по конструированию тераностических подходов для диагностики и терапии метаболических нарушений. Так, была создана генетическая сеть, продуцирующая инсулин в ответ на понижение pH [54]. Наряду с этим существует апробированная на животных моделях стратегия регуляции уровня глюкозы в крови, основанная на генетических сетях с оптогенетическими сенсорами [55], а также ИГС, функционирующая по принципу петли обратной связи для поддержания в крови баланса жирных кислот [56].

Основной причиной метаболических эндокринных и воспалительных болезней принято считать дисбаланс соответственно метаболитов, гормонов и цитокинов [57]. Подавляющее большинство из этих соединений крайне важны для нормального функционирования организма, в связи с чем возможной терапевтической стратегией является восстановление их баланса посредством ИГС, функционирующих по принципу петли обратной связи. Применение данной стратегии позволило создать систему контроля уровня глюкозы в крови посредством конструирования ИГС, в которой экспрессия инсулина активировалась глюкозным сенсором, в качестве которого выступал глюкозо-чувствительный кальциевый канал [58].

Благодаря конвергенции СБ с другими направлениями науки и технологий, разрабатываются подходы к диагностике острых состояний. Например, был разработан комбинированный сенсор, состоящий из бактерий, несущих гем-чувствительную ИГС, и электронной части, которая посылает радиосигнал в случае активации генетической сети гемом [59]. Разработанный сенсор предназначен для обнаружения кровотечений в желудочно-кишечном тракте и является прорывом в диагностике данного состояния. Несмотря на уже имеющиеся успехи, применение решений СБ в медицине находится в начале своего пути, что демонстрируется концепциями, реализация которых происходит в настоящее время [60].

Но применение СБ не ограничивается медицинскими приложениями. Международные коммерческие компании также используют достижения СБ, например, для разработки биоизопрена, получаемого из возобновляемого сырья и используемого для изготовления автомобильных покрышек без материалов нефтепереработки. Для этого используют модифицированные бактерии, эффективно перерабатывающие сахара, получаемые из сахарного тростника, кукурузы, проса и другой биомассы в изопрен. Важнейшим этапом этого процесса является настройка метаболических путей для получения 3,3-диметилаллилпирофосфата (DMAPP), из которого уже получается конечный продукт с помощью фермента изопренсинтазы.

Принципы и методы синтетической биологии позволяют воссоздать процессы клеточной дифференциации, управляя дальнейшей судьбой клеток. Подход, продемонстрированный в [61], показывает возможность модификации транскрипционных факторов с помощью трансактиваторных доменов, пришитых к концам белков, на примере OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, чья принципиальная роль в репрограммировании фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) широко известна.

Еще одним примером может служить работа по получению глюкозо-чувствительных инсулин-секретирующих бета-клеток из ИПСК путем построения синтетической регуляторной сети [62].

Одно из самых ранних применений СБ нашла в сенсорах токсичных веществ в воде, почве, пище. Для детектирования тяжелых металлов и антибиотиков используются простые схемы с репортерным белком и чувствительным элементом, передающим сигнал на репортер. Например, была предложена концепция бактериального биосенсора с осциллирующей флуоресценцией, интенсивность и частота которой сообщала о концентрации мышьяка в среде [63].

В то же время возможно запрограммировать микроорганизмы на удаление вредных органических веществ и тяжелых металлов из среды. Интродукция металл-связывающего пептида в ризобактерий, деградирующих трихлорэтилен (ТХЭ), приводит одновременно к захвату металлов и уничтожению ТХЭ [64].

Широкое применение СБ также нашла в биотопливной сфере. Различные виды микроводорослей успешно программируются, используя достижения метаболической инженерии для получения биотоплива [65].

Массачусетский технологический институт в сотрудничестве с несколькими другими университетами участвовали в разработке Cyberplasm — микроробота, работающего на принципах СБ. Это комплексная система, состоящая из мышечных клеток млекопитающих, получающая энергию за счет бактерий. Оптогенетически модифицированные мышечные клетки необходимы для перемещения микроробота в воде, имитируя ундулирующее движение. Координацию сокращений обеспечивает электронный биоподражаемый центральный генератор паттерна (central pattern generator, CPG). В природе центральный генератор паттерна — это нейронный ансамбль, члены которого совместно порождают (генерируют) упорядоченную по времени и мишеням выходную активность ансамбля, которая служит командой для мышц [66]. Электронный аналог посылает сигналы мышечным клеткам через органический светодиод (organic light-emitting diode, OLED), получаемый методом 3D-печати из каптона — полиимидной пленки. OLED отвечает за сопряжение процессов возбуждения/сокращения. Электронное устройство работает благодаря «микробному топливному элементу», интегрированному в «тело» робота. Вся система находится в гидрогеле, что обособляет ее от внешней среды [67]. По задумке исполнителей проекта микроробот должен имитировать поведение морской миноги.

Заключение и перспективы

Таким образом, современный этап развития синтетической биологии характеризуется формированием инженерных принципов конструирования регуляторных сетей, а также развитием инструментов, включающих все известные типы биологических макромолекул и надмолекулярных структур. Главной задачей в этом аспекте является поиск или создание ортогональных систем, функционирование которых внутри клеток не будет затрагивать нативные метаболические и биогенетические пути. Тенденция к инженеризации СБ будет развиваться и дальше и, по мнению авторов данного обзора, в конечном итоге должна привести к формированию общей базы элементарных блоков, комбинации которых смогут реализовывать потенциально любой функционал, а задача исследователей будет сведена к правильному подбору элементов разрабатываемой сети.

Обилие возможностей синтетических сетей, даже минимально проиллюстрированных в данном обзоре, показывает широкое их применение в различных областях, несмотря на тот факт, что СБ как наука зародилась относительно недавно и находится на начальном этапе своего развития. Поэтому можно предположить, что в среднесрочной перспективе ожидаются дальнейшие крупные успехи СБ в медицине, экологии, биотехнологической и других отраслях.

Финансирование работы

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №18-29-07046.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.