In silico анализ SSR-маркеров у хлопчатника, специфичных по 4-й хромосоме от вида G. barbadense L.

Ш.С. Абдукаримов¹, А.Х. Макамов¹, Ш.У. Бобохужаев², М.Ф. Санамьян², З.Т. Буриев¹

¹Центр Геномики и биоинформатики АН РУз, 111215, Ташкентская область, Узбекистан;

²Национальный университет Узбекистана им. М. Улугбека, 100174, Ташкент, Узбекистан; e-mail: sharofiddinabdukarimov@gmail.com

In silico analysis of ssr markers specific for chromosome 4 from the cotton G. barbadense L.

Sh.S. Abdukarimov¹, A.Kh. Makamov¹, Sh.U. Bobokhuzhaev², M.F. Sanamyan², Z.T. Buriev¹

¹Center of Genomics and Bioinformatics of the Academy of Sciences the Republic of Uzbekistan, 111215, Tashkent region, Uzbekistan;

²National University of Uzbekistan named after M. Ulugbek, 100174, Tashkent, Uzbekistan; e-mail: sharofiddinabdukarimov@gmail.com

Проведен in silico анализ SSR-маркеров BNL2572, Gh107 и Gh117, молекулярно подтверждающих замещение 4-й хромосомы моносомных гибридов F₁, полученных межвидовой гибридизацией (Mo10xPima 3-79, Mo60xPima 3-79, Mo75xPima 3-79). Для ПЦР-анализа in silico использованы биоинформатическая программа Unipro UGENE 1.21.0, а также файлы FASTA генома G. barbadense L. и соответствующих маркеров. Геном хлопчатника был скачан по ссылке https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10770. Для определения последовательностей генов (белков) в области расположения маркера использовано веб-приложение AUGUSTUS. При прогнозировании важных генов (белков) на основе нуклеотидной последовательности этих генов (белков) применен алгоритм Protein BLAST базы данных NCBI BLAST.

В результате анализа в области маркера BNL2572 были идентифицированы 9 генов и 10 транскриптов. Из них семейство генов SAUR (малых РНК, активируемых ауксином) было определено на основе ампликона, состоящего из 318 пар нуклеотидов. Эти гены у хлопчатника слабо изучены, но известно, что гены SAUR регулируют пролиферацию клеток и рост гипокотилей растений. У хлопчатника они участвуют в удлинении волокна.

В области маркера Gh107 обнаружены 6 генов и 7 транскриптов. Из них тиоредоксиноподобный 3-1 белок был обнаружен на основе ампликона, состоящего из 564 пар нуклеотидов. Они выполняют важные функции, начиная от фотосинтеза, цветения, развития семян, прорастания и до общего роста. Y.-B. Li и соавт. (2016) определили ответ гена тиоредоксина gbNRX1 G. barbadense на Verticillium dahliae.

В области маркера Gh117 идентифицированы 16 генов и 17 транскриптов, из которых полипротеин Gag/Pol был обнаружен на основе ампликона, состоящего из 2553 пар нуклеотидов. Этот белок синтезируется генами gag и pol. Ген gag (orf1) кодирует основные белки, ген pol (orf2) кодирует домены протеазы, обратной транскриптазы, РНКазы H и интегразы.

* * *

Перспективы применения гормонов для видов винограда in vitro

А.Н. Абдуллаев, Х.А. Убайдуллайева, С.А. Абдуллаев, Ш.А. Султонова, А.А Болкиев, Ж.Б. Эшмурзаев

Центр геномики и биоинформатики АН РУз, 111215, Ташкентская обл., Республика Узбекистан; e-mail: adhamabdullaev1994@mail.com

Prospects for application of hormones for grape species in vitro

A.N. Abdullaev, Kh.A. Ubaidullaeva, S.A. Abdullaev, Sh.A. Sultonova, A.A. Bolkiev, J.B. Eshmurzaev

Center of Genomics and Bioinformatics of the Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan, 111215, Tashkent region, Republic of Uzbekistan; e-mail: adhamabdullaev1994@mail.com

Виноградарство — одна из самых прибыльных отраслей сельского хозяйства. В связи с растущим спросом на высокоурожайные, устойчивые к болезням и вредителям сорта, одними из наиболее актуальных проблем в сельском хозяйстве являются обогащение генофонда сельскохозяйственных культур с использованием биотехнологических методов, повышение урожайности и выращивание качественной продукции для мирового рынка. В частности, искусственные регуляторы или фиторегуляторы, контролирующие рост и развитие растений, являются мощными инструментами контроля онтогенеза растений. Поэтому они широко используются в биотехнологии сельскохозяйственных культур и прикладной ботанике. В настоящее время существует множество типов питательных сред, которые различаются в основном минеральным содержанием. Примерами являются Готре, Уайт, Хеллер, Морель и другие среды. Питательная среда по рецепту Мурасига—Скуга (МС) особенно распространена, ее отличительной особенностью является высокое содержание азота и калия по сравнению с другими средами. Следовательно, одним из наиболее важных этапов культивирования in vitro является укоренение микробиотов — процесс, который зависит от многих факторов, включая характеристики сорта, количество субкультур и концентрацию фитогормонов. В нашем исследовании 6-бензиламинопурин МС был добавлен в питательную среду в дозе 0,5, 1,0, 2,0—0,4 мг на литр, что свидетельствует о развитии корней (2,0 мг/л) на просторах. Жирные кислоты в помещении с эффектом ауксина для укоренения в микросреде также наблюдались и в кормах с концентрацией 2,0 мг/л лучших (ИМК). При этом количество корней за 15 дней составило 2,8, длина корня — 18 мм, а к 30-м суткам укоренение увеличилось на 95%. Вещества с ауксиновой природой (2,4 Д, ИУК, ИМК) используются в имплантатах для стимуляции образования корней. Ауксин особенно важен на ранних стадиях образования корней. Создан метод бесполого размножения растений (in vitro в пробирке), генетически идентичных исходной копии. В настоящее время центр адаптирует корневые саженцы к почвенной среде путем выращивания in vitro местных сортов изюма, тойфи, ризамата.

* * *

Продуцирующие Cry-токсины эндофитные бактерии как альтернатива трансгенным растениям для защиты от насекомых-вредителей

В.Ю. Алексеев, А.В. Сорокань, Д.К. Благова

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054, Уфа, Россия; e-mail: fourtyanns@gmail.com

Producing Cry-toxins endophytic bacteria as an alternative to transgenic plants to protect against insect pests

V.Yu. Alekseev, A.V. Sorokan, D.K. Blagova

Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Center, RAS, 450054, Ufa, Russia; e-mail: fourtyanns@gmail.com

С середины 90-х годов XX века до настоящего времени большинство трансгенных культур со встроенной системой защиты от вредителей представлено сортами, несущими гены Cry- и Vip-токсинов Bacillus thuringiensis. Их использование имеет ряд проблем: неустойчивость наследования признака и содержания продукта генов, развитие устойчивости вредителей к инсектотоксинам. Зачастую B. thuringiensis и Cry-токсины рассматриваются в том же ключе, что и химические пестициды. При этом их экологическая роль и их связь с растениями уходят на задний план.

Однако обнаруживаются эндофитные штаммы B. thuringiensis, способные продуцировать свои метаболиты во внутренних тканях растений, а также праймировать их защитные механизмы. Нами было показано, что штамм B. thuringiensis В-5351 проникает во внутренние ткани растений пшеницы и картофеля и его инсектицидный эффект против злаковой тли и колорадского жука (соответственно) обусловлен как синтезом токсинов, так и стимуляцией транскрипции PR генов растений-хозяев.

Другой подход связан с получением продуцирующих Cry-белки рекомбинантных линий на основе известных эндофитных штаммов, обладающих комплексным действием на растения. Так, на основе штамма B. subtilis 26Д (основа биопрепарата «Фитоспорин»), нами получен штамм B. subtilis 26ДCryChS⁻, несущий в хромосоме ген инсектотоксина из штамма B. thuringiensis В-5351. Помимо характерной для материнского штамма высокой эндофитности (2·10⁵ клеток/г) и фунгистатической активности, штамм проявляет инсектицидную активность.

Исследование генов бактерий, кодирующих токсины, и генов, определяющих способность бактерий к симбиозу с растениями, необходимо для разработки высокоэффективных биопрепартов.

Работа выполнена в рамках проекта РНФ №20-76-00003.

* * *

Поиск геномных маркеров локальной адаптации в популяциях россии с использованием метода главных компонент

А.М. Алиев, А.В. Хрунин

ФГБУ «Институт молекулярной генетики» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», 123182, Москва, Россия; e-mail: aidaraliev@gmail.com

Principal component analysis of genomic markers of local adaptation in populations from russia

A.M. Aliev, A.V. Khrunin

Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», 123182, Moscow, Russia; e-mail: aidaraliev@gmail.com

Метод главных компонент распределяет всю генетическую вариацию вдоль нескольких осей — главных компонент (ГК). В популяционной геномике они могут соответствовать отдельным эволюционным событиям, например фактам расхождения популяций, а наиболее ассоциированные с ними маркеры — находиться под действием естественного отбора. Используя программу PCAdapt, мы провели поиск следов отбора в полногеномных данных популяций из европейской части России (русские, вепсы, коми) и западной Сибири (ханты, манси, ненцы). По результатам анализа было выявлено более 700 локусов-кандидатов (FDR<0,05). Далее все полиморфизмы были соотнесены с отдельными ГК и была проведена их генная аннотация. Локусы, ассоциированные с первой ГК, маркировали дифференциацию западносибирских и европейских популяций, локусы второй — отделение от всех остальных ижемских коми и т.д. Среди генов, вклад которых в дифференциацию европейских и сибирских популяций мог быть сопряжен с действием отбора, были: GALNT13, CDRT4, NIP7P1, XRCC6P1, ZSCAN12, ARHGAP22 и MCPH1. Для популяции ижемских коми таковыми были CDKAL1 и LINC00390, для северных русских — KSR2, PKHD1 и WWOX, для вепсов — APC. Функциональная оценка отобранных генов не выявила групп, сверхпредставленных в составе тех или иных биологических процессов. Последнее позволяет предполагать, что в большинстве случаев локальная адаптация осуществляется через подстройку отдельных элементов (генов) сразу нескольких (многих) метаболических путей к особенностям среды обитания.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №20-04-00824.

* * *

Генетическая паспортизация ясеня с использованием ssr-маркеров

Е.Ю. Аминева, С.Г. Ржевский, Т.А. Гродецкая

ФГБУ «Всероссийский НИИ лесной генетики, селекции и биотехнологии», 394087, Воронеж, Россия; e-mail: elena.pardaeva@mail.ru

Genetic passportization of ash using ssr-markers

E.Yu. Amineva, S.G. Rzhevsky, T.A. Grodetskaya

All-Russian Research institute of Forest Genetics, Breeding and Biotechnology, 394087, Voronezh, Russia; e-mail: elena.pardaeva@mail.ru

В настоящее время для паспортизации древесных растений часто применяют методы молекулярной генетики, в том числе микросателлитные маркеры (SSR).

Для проведения генетической паспортизация ясеня ДНК экстрагировали из молодых листьев модифицированным СТАБ-методом. Для визуализации полученной ДНК и определения степени ее деградации проводили электрофорез в 0,7% агарозном геле с добавлением SYBRGreen. Протестировано 10 пар праймеров к специфическим микросателлитным локусам [1]. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 2% агарозном геле.

У всех исследованных локусов наблюдали полиморфизм по количеству продуктов и их размеру. В локусах FEMSATL_1, FEMSATL_2, FEMSATL_5, FEMSATL_8, FEMSATL_11, FEMSATL_19, FEMSATL_10, FEMSATL_12 выявлены разделившиеся двойные и тройные продукты. У остальных локусов (FEMSATL_4, FEMSATL_16), давших в рамках чувствительности метода одиночные продукты амплификации, выявили полиморфизм размера продуктов, близкий к пределу разрешающей способности метода гель-электрофореза.

Подводя итог, следует заключить: все использованные полиморфные локусы, кроме FEMSATL_4 и FEMSATL_16, стоит рекомендовать в качестве маркеров для генетической паспортизации ясеня.

Литература

1. Lefort F, Brachet S, Frascaria Lacoste N, Edwards KJ, Douglas GC. Identification and characterization of microsatellite loci in ash (Fraxinus excelsior L.) and their conservation in the olive family (Oleaceae). Molecular Ecology. 1999;8:6:1088-1089.

* * *

Роль полиморфизма A1166C гена AGT2R1 в развитии факторов сердечно-сосудистого риска

М.О. Астрейко, Н.А. Бебякова, О.А. Первухина, Ю.М. Никонова

ФГБОУ ВО «Северный государственный медицинский университет» Минздрава России, 163000, Архангельск, Россия; e-mail: astreiko.mo@gmail.com

A role of gene AGT2R1’s polymorphism A1166C in the development of cardiovascular risk’s factors

M.O. Astreiko, N.A. Bebyakova, O.A. Pervukhina, Yu.M. Nikonova

Northern State Medical University, 163000, Arkhangelsk, Russia, e-mail: astreiko.mo@gmail.com

Лидирующие позиции в структуре хронических неинфекционных заболеваний занимает артериальная гипертензия (АГ). Известно, что генетические факторы риска играют значимую роль в инициации данного заболевания. Среди генов-кандидатов одним из основных считается ген рецептора 1-го типа ангиотензина II (AGT2R1), а также его полиморфизм А1166С (rs5186).

В исследование были включены 246 молодых людей (130 девушек и 116 юношей) без выявленной кардиоваскулярной патологии. Средний возраст — 19,2 года (95% ДИ 18,5—19,8). У всех было проведено генотипирование полиморфизма А1166С гена AGT2R1 методом пиросеквенирования. Оценивали факторы риска формирования вазоконстрикции до и после дозированной физической нагрузки по Мартине—Кушелевскому. Определяли уровень вазоактивных эндотелиальных факторов: оксида азота, эндотелина-1 и ангиотензина II. Оценивали тип гемодинамической реакции на физическую нагрузку.

У молодых людей с генотипом 1166СС в гене AGT2R1 значительно чаще, чем у гетерозигот и гомозигот по дикому аллелю А, выявлены факторы риска формирования вазоконстрикции. Данный генотип ассоциирован с такими факторами сердечно-сосудистого риска, как гипертоническая реакция на нагрузку, нестабильность СДД, уровень адаптационного потенциала, свидетельствующий о функциональном напряжении сердечно-сосудистой системы, и с дисбалансом вазоактивных эндотелиальных факторов в сторону вазоконстрикции.

* * *

Идентификация и анализ генов семейства метакаспаз у Fragilaria radians

Э.М. Байрамова, А.М. Марченков, А.А. Морозов, Е.Д. Бедошвили

Лимнологический институт СО РАН, 664033, Иркутск, Россия; e-mail: bairamovaelvira@gmail.com

Identification and analysis of the metacaspase gene family in Fragilaria radians

E.M. Bayramova, A.M. Marchenkov, A.A. Morozov, Ye.D. Bedoshvili

Limnological Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 664 033, Irkutsk, Russia; e-mail: bairamovaelvira@gmail.com

Метакаспазы относятся к семейству цистеиновых протеаз C14, участвующих в программируемой клеточной гибели, и являются аналогами каспаз животных. У диатомовых водорослей эта группа ферментов представлена метакаспазами класса III, характеризующимися наличием двух доменов — p10 на N-конце и p20 на C-конце.

Раннее в геноме пресноводной диатомеи Fragilaria radians с помощью полногеномного секвенирования были обнаружены 8 предполагаемых генов метакаспаз. Цель настоящей работы — определение с помощью секвенирования по методу Сэнгера точной нуклеотидной последовательности, кодирующей части этих генов и специфических мотивов метакаспаз класса III.

В ходе работы была исследована интрон-экзонная организация генов. Также мы обнаружили, что из 8 предполагаемых метакаспазных генов F. radians неповрежденный домен p10 (с аминокислотным мотивом QTSAD) кодируют только три гена (14822, 18835, 10107). Полноразмерный домен p20 (определяемый с помощью консервативных мотивов DLP, SGHG, DCC) кодируют пять генов (14822, 18835, 10107, 23175, 22059), в то время как три гена (5582, 7884, 12375) кодируют лишь два консервативных мотива DLP и DCC домена p20. Важно отметить, что мотивы SGHG и DCC составляют каталитическую диаду активного центра протеазы и их отсутствие может указывать на то, что данные гены кодируют функционально неактивные белки.

* * *

Оценка эффективности трансфекции кардиомиоцитов крысы Н9с2 комплексом CRISPR/Cas9 при получении клеток с мутациями генов, ассоциированными с гипертрофической кардиомиопатией

Э.Ц. Барадиева¹, Д.И. Смирнова^{1, 2}, А.Л. Класс¹, Е.В. Филатова¹, С.И. Шрам¹

¹Институт молекулярной генетики Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», 123182, Москва, Россия;

²Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, 125047, Москва, Россия; e-mail: dasha-sm98@mail.ru

Evaluation of the efficiency of transfection of H9c2 rat cardiomyocytes by the CRISPR/Cas complex in the deriving of cells with gene mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy

E.C. Baradieva¹, D.I. Smirnova^{1, 2}, A.L. Klass¹, E.V. Filatova¹, S.I. Shram¹

¹Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», 123182, Moscow, Russia;

²D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, 125047, Moscow, Russia; e-mail: dasha-sm98@mail.ru

В настоящее время считают, что в большинстве случаев за развитие гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП) отвечают различные мутации в генах, кодирующих белки саркомера сердечной мышцы. Применение клеточных моделей может быть адекватным и удобным инструментом для выяснения патогенетической значимости той или иной мутации. В связи с этим нами развивается подход, основанный на внесении ГКМП-ассоциированных мутаций в геном клеток постоянной линии кардиомиоцитов крысы Н9с2 с применением технологии CRISPR/Cas9. В данном исследовании на примере редактирования гена Mybpc3 (внесение мутации Q1233X, rs397516037) нами была произведена оценка эффективности трансфекции клеток Н9с2 компонентами комплекса CRISPR/Cas9, упакованными в липосомы липофектамина. Для визуализации комплекса использовали флуоресцентно-меченную цианином 5 ssDNA (ssDNA-cy5). Согласно данным сканирующей лазерной микроскопии, через 24 ч после трансфекции в клетках (преимущественно в цитоплазме) обнаруживаются множественные включения диаметром 0,5—5,0 мкм, содержащие ssDNA-cy5. Данные проточной цитофлуорометрии указывают на то, что все клетки в культуре содержат значительное количество ssDNA-cy5. В дальнейшем с использованием методов FACS и секвенирования ДНК планируется получение клонов клеток, содержащих гетеро- и гомозиготные ГКМП-ассоциированные мутации в целевых генах, и дальнейшее всестороннее изучение их фенотипа.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект №19-015-00343).

* * *

Изучение роли гена BARD1 в канцерогенезе яичников

Я.А. Барлыбаева¹, Э.Т. Мингажева^{1, 2}, Я.В. Валова^{1, 3}, Д.С. Прокофьева¹, А.Х. Нургалиева¹, Р.Р. Фаисханова⁴, Э.К. Хуснутдинова^{1, 2}

¹Башкирский государственный университет, кафедра генетики и фундаментальной медицины, 450076, Уфа, Россия;

²Институт биохимии и генетики — обособленное структурное подразделение ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр» РАН, 450054, Уфа, Россия;

³ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека», 450106, Уфа, Россия;

⁴ГБУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер», 450054, Уфа, Россия; e-mail: kiramova.yanguzel@mail.ru

Study of the role of the BARD1 gene in ovarian carcinogenesis

Ya.A. Barlybaeva¹, E.T. Mingazheva^{1, 2}, Ya.V. Valova^{1, 3}, A.Kh. Nurgaleeva¹, D.S. Prokofiev¹, R.R. Faiskhanova⁴, E.K. Khusnutdinova^{1, 2}

¹Bashkir State University, Department of Genetics and Fundamental Medicine, 450076, Ufa, Russia;

²Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences, 450054, Ufa, Russia;

³Federal Institution of Science «Ufa Research Institute of Occupational Health and Human Ecology», 450106, Ufa, Russia;

⁴State Autonomous Institution of Health Republican Clinical Oncology Center of the Ministry of Health of the Republic of Bashkortostan, 450054, Ufa, Russia; e-mail: kiramova.yanguzel@mail.ru

Рак яичников (РЯ) занимает одно из лидирующих мест в структуре онкологических заболеваний репродуктивной сферы у женщин. РЯ — это сложное многофакторное заболевание. Генетическая предрасположенность является одним из основных факторов риска. В последние годы широко используемыми методами поиска новых генов, вовлеченных в патогенез заболеваний, стали технологии секвенирования нового поколения (NGS).

В результате ранее проведенного таргетного секвенирования образцов ДНК больных наследственным РЯ у 1 пациентки в 10 экзоне гена BARD1 нами был впервые обнаружен вероятно патогенный нонсенс-вариант c.1967_1969dupGTC (p.Gly656_Pro657insArg) в гетерозиготном состоянии. Ген BARD1 кодирует белок, который взаимодействует с N-концевой областью белка BRCA1 и необходим для формирования стабильной структуры последнего.

С учетом важной роли гена BARD1 в репарации, а также функциональной значимости обнаруженного варианта c.1967_1969dupGTC, данный ген выступает в качестве важного гена-кандидата РЯ. Дальнейшие исследования на расширенных выборках больных РЯ и здоровых доноров из Республики Башкортостан позволят определить частоту встречаемости инсерции c.1967_1969dupGTC/BARD1 и дать оценку его вклада в патогенез РЯ у жителей исследуемого региона.

Исследование поддержано программой развития биоресурсных коллекций ФАНО. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №182909129 «Спектр и частота патогенных мутаций в генах, ассоциированных с наследственным раком яичников у женщин разного этнического происхождения»; №20-34-90003 «Анализ новых генов-кандидатов развития рака яичников у женщин из Республики Башкортостан. Аспиранты».

* * *

In silico обнаружение взаимодействия димера холестерина со свободным от липида апобелком A-I

В.Б. Басерова, А.Д. Дергунов

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины» Минздрава России, 101990, Москва, Россия; e-mail: veron1996@rambler.ru

In silico study reveals cholesterol dimerization drives interaction with lipid-free apolipoprotein a-i

V.B. Baserova, A.D. Dergunov

National Medical Research Center for Therapy and Preventive Medicine, 101990, Moscow, Russia; e-mail: veron1996@rambler.ru

Связывание мономера мицеллообразующего липида с белком эффективно при превышении связывания над мицеллообразованием. Требуется сопоставление известных экспериментальных данных о взаимодействии свободного от липида апобелка A-I человека (апоA-I) с холестерином (ХС) с низкой концентрацией мицеллообразования ХС (30 нМ). Нами проведено молекулярное моделирование взаимодействия мономера и димера апоA-I с мономером и четырьмя конформерами димера ХС при димеризации холестерина в структуре апобелка аналогично димеризации в органических растворителях. Использованы кристаллические структуры укороченного с N-конца Δ(1-43) тетрамера апоA-I (PDB ID: 1AV1, структура B) и укороченного с С-конца Δ(185-243) димера апоA-I (PDB ID: 3R2P, структура M). Энергия связывания мономера ХС с мономером, димером и тетрамером апобелка, возраставшая от −10 до −28 кДж/моль при увеличении самоассоциации, была недостаточной для снятия термодинамического ограничения связывания вследствие мицеллообразования ХС (−52,8 кДж/моль). Участки связывания частично перекрывались с постулированными ХС-связывающими мотивами. Термодинамическое ограничение снималось в модели совместного связывания димера ХС с мономером и димерами апоA-I. Неперекрывающиеся и невзаимодействующие участки связывания ХС в мономере и димере апоA-I в структурах В и М могут связывать до 14 и 6 молекул ХС соответственно. Соответствующие значения энергий взаимодействия −64,5 и −67,0 кДж/моль превышают свободную энергию мицеллообразования ХС.

Предположено, что димеры ХС могут одновременно взаимодействовать с мономером и димером свободного от липида апоA-I, накапливающимся вследствие локального ацидоза в атероме. Экстраклеточное связывание ХС с апобелком может явиться новым механизмом транспорта ХС апобелком, помимо участия апоA-I в ABCA1-опосредованном эффлюксе ХС из макрофага.

* * *

Оценка репродуктивной стратегии морского окуня Sebastes taczanowskii на основе микросателлитных локусов

Н.М. Батищева, В.Д. Ягодина, В.А. Брыков

Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Приморский край, 690041, Владивосток, Россия; e-mail: batishchevanata@gmail.com

Microsatellite dna assessment of the reproductive strategy of the white-edged rockfish, Sebastes taczanowskii

N.M. Batishcheva, V.D. Iagodina, V.A. Brykov

Zhirmunsky Institute of Marine Biology, National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Primorsky region, 690041, Vladivostok, Russia, e-mail: batishchevanata@gmail.com

Полиандрия — широко распространенное явление в животном мире. Данные о количестве половых партнеров позволяют пролить свет не только на эволюцию моделей полового отбора и поведения, но и на скорость генетического дрейфа, видообразования и поддержания генетического разнообразия в популяции. Виды рода Sebastes характеризуются внутренним оплодотворением, живорождением и наличием полиандрии у некоторых из них. Биология Sebastes taczanowskii относительно хорошо изучена, но генетические аспекты репродуктивной системы до сих пор полностью не исследованы. Пять микросателлитных локусов ДНК были использованы для предварительной оценки уровня полиандрии у S. taczanowskii. Десять самок и выборки их потомства были статистически проанализированы. Более половины самок спаривались более чем с одним самцом. Вероятно, полиандрия является весьма распространенной стратегией у морского окуня, обитающего на территории Дальнего Востока, а также важным фактором в регулировании генетического разнообразия и продуктивности. Полученные данные важны для понимания полового поведения дальневосточных окуней. Эти данные позволят провести сравнение уровней полиандрии у различных видов в пределах одного рода и проследить эволюцию механизмов полового отбора.

* * *

Молекулярная диагностика фитоплазмы в растениях томата, вьюнка и в насекомых

А.Г. Бахшиев

Институт генетики, физиологии и защиты растений, Кишинев, Республика Молдова; email: aighiuni93@mail.ru

Molecular diagnosis of phytoplasma in tomato and bindweed plants and insects

A.G. Bahsiev

Institute of Genetics, Physiology and Plant Protection, Chisinau, Republic of Moldova; email: aighiuni93@mail.ru

Столбур — это широко распространенная болезнь, вызванная патогеном ‘Candidatus Phytoplasma solani’, который поражает преимущественно флоэму растений разных видов, в том числе многих экономически важных сельскохозяйственных культур. На распространение инфекции влияет ряд факторов, таких как применение неверных агротехнических приемов, обилие сорняков, на которых зимуют насекомые-векторы, неблагоприятные метеорологические условия. Одним из известных резервуаров инфекции ‘Ca. P. Solani’ является вьюнок. Изучение цепи «культурное растение—насекомое—сорняк» — один из ключевых способов оценки эпидемиологической ситуации в регионе для успешной борьбы с распространением инфекции. Цель исследования заключалась в идентификации патогена в растениях томата, насекомых-векторах, а также в растениях вьюнка. Исследования проводились в течение двух лет. Сбор образцов томата и насекомых осуществлялся в течение всего сезона вегетации, а образцов вьюнка — в начале и в конце сезона вегетации томата. ДНК была выделена из плодоножек томата с помощью щелочного экспресс-метода, разработанного Guo и соавт. (2003), а из растений вьюнка и насекомых — с использованием DNAzol. Для нестед-ПЦР использовались специфичные праймеры cpn421F/R и cpn200F/R, созданные на основе нуклеотидной последовательности шаперонинового гена ‘Ca. P. solani’. Молекулярная диагностика выявила присутствие инфекции ‘Ca. P. solani’ приблизительно у 70% проанализированных растений томата. Уровень заражения фитоплазмой насекомых был значительно ниже, составляя 15,5%. Патоген ‘Ca. P. solani’ в растениях вьюнка не был обнаружен ни в начале, ни в конце сезона вегетации. Таким образом, полученные данные показывают, что ‘Ca. P. solani’ присутствует в томатах и насекомых, но вьюнок не является промежуточным хозяином при передаче инфекции. В дальнейшем будут исследованы другие дикорастущие растения для определения вида сорняков, способствующих распространению фитоплазмы в регионе.

* * *

Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы как векторы доставки трансгенов в эпителиальные клетки трахеи больного муковисцидозом

Л.Л. Белова, К.С. Кочергин-Никитский, С.А. Смирнихина

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова», 115478, Москва, Россия; e-mail: lubavushko@gmail.com

Recombinant adeno-associated viruses as vectors for delivery of transgenes into tracheal epithelial cells of a patient with cystic fibrosis

L.L. Belova, K.S. Kochergin-Nikitsky, S.A. Smirnikhina

Research Center for Medical Genetics, 115478 Moscow, Russia; e-mail: lubavushko@gmail.com

Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (рААВ) применяются в качестве векторов для коррекция генетических патологий, таких как муковисцидоз. рААВ обладают рядом достоинств: простота системы, низкая иммуногенность, длительное персистирование ДНК в клетках без встраивания в геном клетки-хозяина и пр. Важной особенностью является разнообразие серотипов ААВ, благодаря тропным свойствам подходящих, для трансдукции широкого диапазона типов клеток и тканей. Для работы были выбраны три серотипа ААВ — 5, 6 и 9, имеющие тропность к тканям легких, в том числе к эпителиальным клеткам трахеи и альвеол.

Цель исследования — разработка методик сборки и очистки рААВ 5, 6 и 9 серотипов с репортерным геном GFP и трансдукция ими эпителиальных клеток трахеи больного муковисцидозом (CFTE29o-).

Получение выбранных серотипов рААВ проводили методом трансфекции клеточной линии HEK293T трехплазмидной системой, состоящей из упаковочной плазмиды, несущей гены rep и cap; плазмиды, несущей вспомогательные гены; плазмиды, содержащей трансген GFP. Сбор вируса осуществляли спустя 72 ч после трансфекции. Для очистки использовали преципитацию вирионов в 40% растворе PEG 8000 с последующим ультрацентрифугированием при 160 тыс. g в градиенте сахарозы. Полученные рААВ имели физический титр более 1E+12 вг/мл, определенный методом количественной ПЦР. После 48 ч инкубации клетки CFTE29o- анализировали методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Определили наиболее высокоэффективные серотипы — рААВ 9 эффективность 50% трансдукции 3E+04 MOI, а максимальная (~100%) — 1,25E+05 MOI, рААВ 6 эффективность 50% — 4E+05 MOI, а максимальная (~73%) — 1E+06 MOI.

В работе была оптимизирована методика сборки и очистки рААВ. Отобраны наиболее эффективные серотипы для трансдукции эпителиальных клеток трахеи, которые в дальнейшем будут использованы для доставки компонентов CRISPR-Cas9 для коррекции мутации F508del в гене CFTR.

* * *

Эмфорин — сильный конкурентный медленносвязывающийся ингибитор протеализина

И.М. Бердышев, К.Н. Чухонцева, М.А. Карасева, И.В. Демидюк

ФГБУ «Институт молекулярной генетики» НИЦ «Курчатовский институт», 123182, Москва, Россия; e-mail: igorqetu@mail.ru

Emphorin — strong competitive slow-binding proteolysin inhibitor

I.M. Berdyshev, K.N. Chukhontseva, M.A. Karaseva, I.V. Demidyuk

Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», 123182, Moscow, Russia; e-mail: igorqetu@mail.ru

Эмфорин (M4in) — недавно обнаруженный у бактерии Serratia proteamaculans белковый ингибитор металлопротеаз, прототип нового, неохарактеризованного семейства. Гены эмфориноподобных ингибиторов (ЭПИ) у бактерий колокализованы с генами протеализинподобных протеаз (ППП), которые, вероятно, вовлечены во взаимодействие бактерий с животными и растениями, а также в патогенез и в межбактериальную конкуренцию. Таким образом, действие ЭПИ на ППП, по-видимому, является элементом регуляции взаимодействия бактерий с широким кругом живых организмов.

Нами были получены препараты рекомбинантного M4in и протеализина (PLN) — ППП из S. proteamaculans, что позволило исследовать влияние M4in на кинетику катализируемого PLN гидролиза пептидного субстрата с внутренним тушением флуоресценции 2-аминобензоил-Arg-Ser-Val-Ile-Lys(2,4-динитрофенила). Анализ кинетических зависимостей показал, что M4in является медленносвязывающимся обратимым ингибитором, образование комплекса фермент—ингибитор происходит в одну медленную стадию, а константа ингибирования (K_i) составляет 52±14 пМ.

Проведенная методом иммуноблоттинга оценка содержания M4in в S. proteamaculans показала, что концентрация ингибитора в бактериальной клетке значительно (более чем в 1000 раз) превышает K_i. Это указывает на способность M4in эффективно подавлять активность соответствующих протеаз в цитоплазме, где он локализован согласно полученным ранее данным иммуноэлектронной микроскопии.

Таким образом, нами впервые показано, что M4in является сильным конкурентным медленносвязывающимся и действующим по одностадийному механизму ингибитором, способным защитить бактериальную клетку от нежелательной активности собственных или экзогенных металлопротеаз.

* * *

Использование множественных форм супероксиддисмутазы сои — результат экспрессии гена

А.А. Блинова¹, Л.Е. Иваченко^{1, 2}

¹ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский институт сои», 675027, Благовещенск, Россия;

²ФГБОУ ВО Благовещенский государственный педагогический университет, 675000, Благовещенск, Россия; e-mail: baa@vniisoi.ru

The usage of multiple forms of soybean superoxide dismutase — the result of gene expression

A.A. Blinova¹, L.E. Ivachenko^{1, 2}

¹All-Russian Scientific Research Institute of Soybeans, 675027, Blagoveshchensk, Russia;

²Blagoveshchensk State Pedagogical University, 675000, Blagoveshchensk, Russia; e-mail: baa@vniisoi.ru

Внутривидовое разнообразие отражает взаимодействие между генетическим потенциалом вида и факторами окружающей среды. Ведущую роль в поддержании внутриклеточного гомеостаза в адаптации к стрессорам играют ферменты. Белки-ферменты — это результат экспрессии генов. Многие ферменты функционируют в виде множественных форм (МФ). По уровню изменению МФ ферментов можно глубже понять функционирование генов в ответ на разнообразные воздействия факторы окружающей среды.

Важным ферментом антиоксидантной системы является супероксиддисмутаза (СОД), в которой функционируют в виде нескольких изоформ, имеющих различную локализацию: Mn-СОД (митохондрии, пероксисомы), Cu-Zn-СОД (цитозоль, хлоропласт, пероксисомы) и Fe-СОД (хлоропласт).

В семенах сои ((Glycine max (L.) Merrill) в сортах селекции ФНЦ ВНИИ сои при воздействии различных факторов было выявлено 21 МФ СОД (СОД1—СОД21). Так, при влиянии низких температур было обнаружено 15 МФ, а при высоких — 12 МФ. При заражении грибковой инфекцией Cercospora sojina Hara было обнаружено 12 форм, а при Septoria glycines Hemmi — 11 МФ, имеющих различную электрофоретическую подвижность.

Таким образом, изучение МФ ферментов позволяет выявить реализацию информации, записанную в геноме.

* * *

Neochlorella semenenkoi IPPAS C-1210 — взгляд на оптимизацию культивирования и биотехнологический потенциал

Л.А. Бобровникова^{1, 3}, М.С. Пахолкова², Р.А. Сидоров³, М.А. Синетова³

¹Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

²Северный Арктический федеральный университет им. М.В. Ломоносова, Архангельск, Россия;

³Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, Россия; e-mail: lidia.bo@yahoo.com

Neochlorella semenenkoi ippas C-1210 — insight into cultivation optimisation and biotechnological potential

L.A. Bobrovnikova^{1, 3}, M.S. Pakholkova², R.A. Sidorov³, M.A. Sinetova³

¹Lomonosov Moscow State university, Moscow, Russia;

²Northern (Arctic) Federal University, Arkhangelsk, Russia;

³Timiryazev Institute of Plant Physiology of RAS, Moscow, Russia; e-mail: lidia.bo@yahoo.com

Микроводоросли имеют огромный потенциал в таких областях промышленности, как пищевая, энергетическая, фармацевтическая и сельскохозяйственная, благодаря их способности синтезировать многочисленные ценные органические соединения.

В нашем исследовании были исследованы экофизиологические и биохимические характеристики нового Chlorella-подобного вида Neochlorella semenenkoi штамма IPPAS C-1210. Штамм был выделен из пресноводного озера Иссык в Казахстане.

Нами была исследована реакция культуры на изменение параметров культивирования (pH, температура, засоление, наличие разных источников азота и углерода в среде, азотное, фосфорное, серное, магниевое и железное голодание). Нами были измерены темпы роста, продуктивность и изменение биохимичекого состава (содержание крахмала, белка, липидов и пигментов) в клетках IPPAS C-1210.

Нами были подобраны оптимальные условия культивирования с целью достижения максимальных показателей продуктивности биомассы. Оптимум температур находится около 30 °C, оптимальный pH — слабощелочной, в пределах 8—9. Наибольший прирост биомассы наблюдался при росте на среде с добавлением мочевины в качестве источника азота. Штамм способен к росту в миксотрофных и гетеротрофных условиях на средах с добавлением глюкозы или ацетата в качестве источника углерода. Более того, было обнаружено, что клетки штамма IPPAS C-1210 переключают свой метаболизм при азотном голодании с аккумуляции крахмала на накопление липидов. При магниевом голодании штамм, наоборот, начинал в больших количествах аккумулировать крахмал, при этом содержание липидов оставалось на низком уровне.

Основываясь на полученных нами результатах, мы можем заключить, что Neochlorella semenenkoi IPPAS C-1210 может быть хорошим штаммом-продуцентом липидов, пригодным для последующего масштабирования в биотехнологической промышленности.

Работа выполнена на базе «Научно-производственного биотехнологического комплекса для проведения работ по изучению, сохранению и практическому применению культивируемых клеток и органов высших растений и микроводорослей» при финансовой поддержке Мегагранта Правительства Российской Федерации (Соглашение №075-15-2019-1882).

* * *

Теломерная роль рнк-связывающего белка Ars2 в герминальных тканях Drosophila

Е.Е. Борисов^{1 ,2}, П.А. Комаров¹, А.И. Калмыкова¹

¹НИЦ «Курчатовский институт» — Институт молекулярной генетики, 123182, Москва, Россия;

²Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики, 119192, Москва, Россия; e-mail: borisovevgenij5@gmail.com

Telomere role of Ars2 rna-binding protein in the drosophila germline

E.E. Borisov^{1, 2}, P.A. Komarov¹, A.I. Kalmykova¹

¹Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», 123182, Moscow, Russia;

²Faculty of Bioengineering and Bioinformatics Lomonosov Moscow State University, 119192, Moscow, Russia; e-mail: borisovevgenij5@gmail.com

Теломеры Drosophila поддерживаются за счет транспозиций специализированных ретротранспозонов без участия теломеразы, что является примером возникновения функциональных аналогий в природе. Контроль гомеостаза теломер в герминальных тканях особенно важен для поддержания стабильности генома. Известен ряд путей, контролирующих экспрессию теломерных повторов и состояние хроматина в клетках зародышевого пути D. melanogaster: Piwi-interacting RNA (piRNA), ряд транскрипционных факторов, деаденилазный комплекс. РНК-связывающий белок Ars2 (Arsenic Resistance Protein 2) был идентифицирован как негативный регулятор экспрессии основного теломерного повтора HeT-A (Healing Transposon) у дрозофилы и TERRA (telomeric repeat-containing RNA) у человека, что указывает на его консервативную роль в биологии теломер. Данная работа направлена на изучение роли белка Ars2 в функционировании теломер в герминальных тканях дрозофилы. При дисфункции Ars2 наблюдается накопление транскриптов HeT-A в яичниках, часть которых накапливается в ядре рядом с теломерами. Полногеномный анализ хроматин-ассоциированных РНК говорит об уникальной теломер-специфичной роли Ars2 в регуляции экспрессии теломерных повторов в процессе оогенеза. Анализ хроматина указывает на участие Ars2 в транскрипционном сайленсинге теломерных повторов. Мы предполагаем, что Ars2 участвует в котранскрипционном узнавании теломерных транскриптов и передаче сигнала к хроматиновым комплексам, что приводит к подавлению транскрипции теломерных повторов в процессе оогенеза.

Работа поддержана грантом РФФИ 19-04-00254.

* * *

Филогения и дифференциальная экспрессия генов у симпатрических морфотипов гольца Salvelinus cf. Malma из озера Кроноцкое (Восточная Камчатка)

Е.С. Бочарова¹, Д.Г. Селезнев^{2, 3}, Г.Н. Маркевич⁴ Е.В. Есин^3—5

¹ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, 119334, Москва, Россия;

²ФГБУН «Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина» РАН, 152742, Борок, Россия;

³ФГБУН «Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова» РАН, 119071, Москва, Россия;

⁴ФГБУ «Кроноцкий государственный заповедник», 684000, Елизово, Россия;

⁵ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии», 107140, Москва, Россия; e-mail: bocharova.ekaterina@gmail.com

Phylogeny and gene diffential expression in sympathric morphotypes of charr Salvelinus cf. Malma from the Kronotskoye lake (East Kamchatka)

E.S. Bocharova¹, D.G. Seleznev^{2, 3}, G.N. Markevich⁴, E.V. Esin^3—5

¹FGBUN IDB RAS, 119334, Moscow, Russia;

²FGBUN IBIW RAS, 152742, Borok, Russia;

³FGBUN IPEE RAS, 119071, Moscow, Russia;

⁴FGBU Kronotsky Reserve, 684000, Elizovo, Russia;

⁵FGBNU VNIRO, 107140, Moscow, Russia; e-mail: bocharova.ekaterina@gmail.com

Гольцы рода Salvelinus способны давать начало целому «пучку» морфотипов при заселении новых озер изначально мономорфным предком. Наибольшее разнообразие симпатрических морф описано для гольца Salvelinus cf. malma из бассейна озера Кроноцкое. Каждый адаптивный морфотип кроноцких гольцов обладает своими экологическими особенностями: типом питания и местообитания, продолжительностью жизни и скоростью роста, местом и сроком нереста. Наиболее контрастные морфологические различия связаны с размером и положением рта. В наших исследованиях экспрессии генов в кранио-фациальной области головы были использованы пять морфотипов и предковая форма (мальма) в момент перехода на внешнее питание. Основные различия дифференциальной экспрессии генов наблюдаются по факторам скорости остеогенеза и дифференциации обонятельных отделов ЦНС, медиаторам транскрипции/трансляции, регуляторам скорости межклеточного и внутриклеточного транспорта, факторам метаболизма АТФ. Метод многомерного шкалирования показал отделение предковой формы и двух рыбоядных кроноцких форм от литоральных бентосоядных, а также вторичное разделение трех бентосоядных морфотипов. Филогенетический анализ, проведенный на основе попарного сравнения сайтов SNP, полученных при RAD-секвенировании как консервативной, так и неконсервативной ДНК, показал, что кроноцкие формы разделяются на три клады с поддержкой более 96%: рыбоядных, бентосоядных литоральных и глубоководных морфотипов.

Проект выполнен при финансовой поддержке РНФ, проект №18-74-10085.

* * *

Эффект штамма pseudomonas mendocina 9-40/pacd на засухоустойчивость томатов

А.Н. Брагинец, С.С. Жардецкий

Белорусский государственный университет, кафедра генетики, 220030, Минск, Беларусь; e-mail: braginets_anastasiya@mail.ru

Effect of strain pseudomonas mendocina 9-40/pacd on the dry resistance of tomatoes

A.N. Braginets, S.S. Zhardzetski

BSU, department of genetics, 220030, Minsk, Belarus; e-mail: braginets_anastasiya@mail.ru

Цель данной работы — изучение эффекта от обработки штаммом бактерий P. mendocina 9-40/pACD растений в плане повышения их устойчивости к отсутствию влаги в почве. Плазмида pACD содержит ген acdS, продукт которого (фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминаза) снижает уровень стрессового этилена у растений. Для эксперимента использовали растения томатов (сорт «БУМ»). Семена проращивали в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге. Через 7 дней проростки были высеяны в грунт (стаканчики объемом 150 мл). Полив осуществлялся строго одинаковым количеством водопроводной отстоявшейся воды. Через 14 дней вегетации растения были разделены на 2 части — опытные и контрольные. Опытные растения были обработаны 20 мл бактериальной суспензии P. mendocina 9-40/pACD (концентрация клеток — 10⁶), контрольная часть — 20 мл водопроводной воды. Затем все растения подвергли засухе (полив не проводился). Уже по истечении 6 дней после обработки наблюдали разницу в росте и развитии исследуемых растений. Часть из них была изъята для измерения длины корней. Растения, обработанные суспензией исследуемых бактерий, имели в 1,2 раза больше длину стебля и в 1,3 раза больше длину корней по сравнению с растениями, которые поливались водопроводной водой. При этом отмечался более здоровый внешний вид опытных растений. На 10-е сутки у контрольных растений наблюдались признаки увядания, в то время как у опытных продолжили рост и развитие надземной части (увеличение высоты в 1,4 раза). В результате эксперимента достоверно показано, что среднее время гибели у контрольных растений составило 14 сут, у опытных — 20 сут (увеличение в 1,4 раза).

* * *

Родственные отношения и происхождение нейвы Salvelinus neiva

Е.А. Бугаева¹, Е.И. Бондарь^{1, 2}, А.Г. Олейник²

¹Дальневосточный федеральный университет, 690922, Владивосток, Россия;

²Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, 690041, Владивосток, Россия; e-mail: bugaeva-ea@yandex.ru

Relationships and origin of neiva charr Salvelinus neiva

Е.A. Bugaeva¹, Е.I. Bondar^{1, 2}, А.G. Oleinik²

¹Far Eastern Federal University, 690922, Vladivostok, Russia;

²A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, 690041, Vladivostok, Russia; e-mail: bugaeva-ea@yandex.ru

Дивергенция фенотипически разных и часто географически изолированных форм представляет существенную проблему для таксономии и филогении гольцов рода Salvelinus. Происхождение, родственные отношения и таксономический статус озерных гольцов Северо-Восточной Азии, многие из которых описаны как отдельные виды, активно дискутируются. На основе анализа девяти микросателлитных локусов (мсДНК) и нуклеотидных последовательностей контрольного региона митохондриальной ДНК (CR мтДНК) были оценены родственные связи нейвы Salvelinus neiva, узкоареального вида из озер бассейна реки Охота. Тестировались гипотезы о принадлежности S. neiva к: (1) Арктической филогенетической группе гольца Таранца; (2) Берингийской группе северной мальмы S. malma malma; (3) Евразийской группе арктического гольца. По данным анализа CR мтДНК S. neiva относится к Берингийской группе, однако мсДНК подтверждают филогенетическую близость S. neiva с Арктической группой. Несоответствие между мтДНК и мсДНК свидетельствует об исторической интрогрессии мтДНК от S. malma malma к S. taranetzi. Настоящее исследование представляет собой пример исторической гибридизации и интрогрессии на самых южных границах распространения Арктической группы S. taranetzi.

Исследование частично поддержано Российским фондом фундаментальных исследований (проект 20-04-00205).

* * *

Различия в профиле метилирования генов метаботропных рецепторов глутамата в головном мозге крыс

Н.А. Бугаев-Макаровский

ФГБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики» РАН, 142290, Пущино, Россия; e-mail: bugaevmakarovskiy0.0@gmail.com

Differences in gene methylation profile of metabotropic glutamate receptors in rat’s brain

N.A. Bugaev-Makarovskiy

Institute of theoretical and experimental biophysics RAS, 142290, Puschino, Russia; e-mail: bugaevmakarovskiy0.0@gmail.com

В головном мозге крыс экспрессируются метаботропные рецепторы глутамата (мГлуР) 3 групп: мГлуР1-5, мГлуР7, мГлуР8. Характер распространения мГлуР по структурам головного мозга и колебания уровня их экспрессии при нейродегенеративных явлениях позволяют ожидать существенных изменений профиля метилирования генов, особенно в промотерном регионе. Однако биоинформатический анализ с помощью программы Promoter 2.0 Prediction Server и алгоритмов для поиска CpG-островков базы данных UCSC Genome Browser дал неожиданный результат. В 1-й группе у мГлуР1 предсказаны 2 сайта метилирования в промоторном регионе и 3 в области экзона 1, а у мГлуР5 — только 1 CpG-островок в области промотора. Во 2-й группе у мГлуР2 и мГлуР3 практически совпадают сайты метилирования в экзоне 1, однако у мГлуР3 нет сайтов метилирования в промоторе, а у мГлуР2 их 2. В 3-й группе у мГлуР4 предсказаны 14 сайтов метилирования в экзонах (в том числе на экзонах 2 и 3) и 2 сайта метилирования в промоторной области, однако у мГлуР7 предсказано только 2 CpG-островка на экзоне 1 и не выявлено сайтов метилирования в промоторном регионе. Выделяется мГлуР8, у которого отсутствуют CpG-островки как в промоторе, так и в экзонах, несмотря на достаточно высокое содержение GC-пар (38,86%). При этом не обнаружено корреляции между обогащенностью генов сайтами метилирования и количеством возможных сплайс-вариантов. Не обнаружено корреляции и между количеством CpG-островков и распределением консервативных доменов в белках мГлуР. Можно предположить, что нормальная регуляция уровня экспресии генов мГлуР не зависит от профиля их метилирования, в то время как метилирование CpG-островков может играть важную роль при «экстренной» регуляции уровня экспрессии — например, при развитии нейродегенерации. Вероятно, наиболее важно метилирование для мГлуР4, затем — для мГлуР1 и мГлуР2, а для мГлуР8 метилирование не играет никакой роли вовсе.

* * *

Генетическая близость растений Hyssopus officinalis L., культивируемых ex situ и in vitro

И.В. Булавин

ФГБУН «Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад — Национальный научный центр РАН», 298648, Ялта, Россия; e-mail: labgennbs@yandex.ru

Genetic similarity of Hyssopus officinalis L. Plants grown ex situ and in vitro

I.V. Bulavin

The Labour Red Banner Order Nikita Botanical Gardens — National Scientific Center of the RAS, 298648, Yalta, Russia; e-mail: labgennbs@yandex.ru

Биотехнологические методы являются важным компонентом управления генетическими ресурсами растений, которые позволяют сохранить как редкие природные виды, так и полезные селекционные генотипы, в том числе эфиромасличных растений, используемых в медицине, парфюмерии, кулинарии и т.д. Для клонального микроразмножения in vitro ключевым моментом является поддержание генетической стабильности материала. Считается, что регенерация in vitro из меристемы или почек дает идентичные клоны, при этом обсуждается влияние регуляторов роста питательной среды на генетическую сферу введенного в культуру in vitro материала. Поэтому целью нашей работы являлось определение генетической близости между растениями Hyssopus officinalis L. (сорт Никитский белый), культивируемыми ex situ на коллекционных участках НБС-ННЦ, и регенерантами, полученными in vitro из сегментов побега с узлом на модифицированной среде Мурасиге—Скуга (МС), дополненной 6-бензиламинопурином (БАП). Для скрининга использовали 6 праймеров ISSR (UBC807, 818, 836, GR215, HB12, X10), которые формировали воспроизводимые полосы с количественной вариацией от 2 (UBC807) до 8 (GR215). Размер образованных ампликонов находился в пределах от 250 по (HB12) до 1750 по (X10). Согласно нашим результатам праймеры продуцировали мономорфные полосы для всех исследованных образцов растений H. officinalis ex situ и in vitro, полиморфизм между ними не обнаружен.

* * *

Молекулярно-генетические эффекты АКТГ(6-9)PGP в ранние часы после обратимой церебральной ишемии в дорсовентральной области лобной коры у крыс

Л.В. Валиева¹, И.Б. Филиппенков¹, В.В. Ставчанский¹, А.Е. Денисова², Ю.А. Ремизова^{1, 2}, Л.В. Губский², Н.Ф. Мясоедов¹, С.А. Лимборская¹, Л.В. Дергунова¹

¹ФГБУ «Институт молекулярной генетики» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», 123182, Москва, Россия;

²ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, 117997, Москва, Россия; e-mail: lia97@mail.ru

Molecular-genetic effects of ACTH(6-9)PGP in the early hours after transient cerebral ischemia in rat dorsolateral prefrontal cortex

L.V. Valieva¹, I.B. Filippenkov¹, V.V. Stavchansky¹, A.E. Denisova², Yu.A. Remizova^{1, 2}, L.V. Gubsky², N.F. Myasoedov¹, S.A. Limborska¹, L.V. Dergunova¹

¹Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», 123182, Moscow, Russia;

²Pirogov Russian National Research Medical University (RNRMU), 117997, Moscow, Russia; e-mail: lia97@mail.ru

Ишемический инсульт является одной из основных причин инвалидизации и смертности взрослого населения в мире. Известно, что наибольший эффект лечения инсульта достигается в ранние часы (до 6 ч) после окклюзии сосуда, когда восстановление клеток мозга еще возможно. Применение современных молекулярно-генетических подходов позволяет существенно детализировать механизмы нейропротективного действия различных физиологически активных веществ для данного временно́го промежутка. В условиях модели обратимой церебральной ишемии (tMCAO), выполненной под контролем магнитно-резонансной томографии, нами были получены результаты полногеномного RNA-Seq-анализа действия синтетического производного меланокортинов — АКТГ(6-9)PGP. Этот пептид обладает рядом протективных физиологических эффектов и имеет перспективы применения в терапии инсульта. Инъекции 100 мкг/кг АКТГ(6-9)PGP приводили к модуляции экспрессии 322 генов (>1,5 раза; padj<0,05) в дорсовентральной области лобной коры, содержащей зону ишемической пенумбры, через 4,5 ч после tMCAO. Более 70% этих генов (RT1-Ba, C1s, Map3k1, Ptprc, Egfr и др.) снизили свою экспрессию под действием пептида и были главным образом связаны с сигнальными путями иммунного ответа (Focal adhesion-PI3K-Akt-mTOR, Complement system и др.). В это время действие ишемии, наоборот, преимущественно активировало экспрессию генов данных сигнальных каскадов. Таким образом, нейропротективные эффекты АКТГ(6-9)PGP могут быть следствием корректирующего воздействия пептида на профиль экспрессии генов иммунной системы в ранние часы после ишемии.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ №19-14-00268.

* * *

Роль герминального варианта c.1486G>C в гене PALB2 в патогенезе рака яичников

Я.В. Валова^{1, 2}, Д.С. Прокофьева¹, Э.Т. Мингажева^{1, 3}, Я.А. Барлыбаева¹, Э.К. Хуснутдинова^{1, 3}

¹Башкирский государственный университет, кафедра генетики и фундаментальной медицины, 450076, Уфа, Россия;

²ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека», 450054, Уфа, Россия;

³Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450106, Уфа, Россия; e-mail: q.juk@ yandex.ru

The role of the germline variant c.1486G>C in the PALB2 gene in the pathogenesis of ovarian cancer

Ya.V. Valova^{1, 3}, D.S. Prokofieva¹, E.T. Mingazheva^{1, 2}, Ya.A. Barlybaeva¹, E.K. Khusnutdinova^{1, 2}

¹Bashkir State University, Department of Genetics and Fundamental Medicine, 450076, Ufa, Russia;

²Institute of Biochemistry and Genetics, 450054, Ufa, Russia;

³Ufa Research Institute of Occupational Health and Human Ecology, 450106, Ufa, Russia; e-mail: q.juk@ya.ru

Рак яичников (РЯ) занимает шестое место в структуре онкологических заболеваний у женщин и имеет один из самых высоких показателей смертности среди новообразований женских половых органов. Этиология и патогенез РЯ окончательно не изучены, однако, по оценкам, 25% всех случаев РЯ могут быть вызваны наследственными генетическими мутациями.

PALB2 считается одним из генов-кандидатов развития наследственного и спорадического рака молочной железы и яичников с умеренной пенетрантностью. Патогенные варианты PALB2 были связаны с 3-кратным увеличением риска развития РЯ.

Цель данной работы — поиск варианта c.1486G>C в гене PALB2, ранее обнаруженный нами в результате таргетного секвенирования образцов ДНК больных наследственным РЯ (НРЯ). Материалом для исследования послужили образцы ДНК, выделенные из венозной крови 264 пациенток с РЯ и 332 здоровых женщин. Поиск мутации проводили методом анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM).

В ходе проведенного исследования мутация c.1486G>C в гене PALB2 была обнаружена только у пациентки с НРЯ, но не выявлена в общей выборке больных РЯ (n=264) и в контроле (n=332). По функциональной роли обнаруженный вариант представляет собой миссенс-мутацию и на уровне белка приводит к замене аспарагиновой кислоты на гистидин. По этнической принадлежности носительница мутации татарка. Начало заболевания произошло в период постменопаузы.

Таким образом, наши данные указывают на низкую частоту встречаемости варианта c.1486G>C в гене PALB2 среди женщин из Республики Башкортостан.

Исследование поддержано программой развития биоресурсных коллекций ФАНО. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №182909129 «Спектр и частота патогенных мутаций в генах, ассоциированных с наследственным раком яичников у женщин разного этнического происхождения»; №20-34-90003 «Анализ новых генов кандидатов развития рака яичников у женщин из Республики Башкортостан. Аспиранты».

* * *

Исследование биологического материала летучих мышей на наличие вирусов семейства Coronaviridae

У.С. Веселкина¹, А.П. Луч², Е.А. Гончарова³

¹Национальный исследовательский университет ИТМО, 197101, Санкт-Петерург, Россия;

²Санкт-Петербургский государственный технологический институт (Технический университет), 190013, Санкт-Петербург, Россия;

³Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, 197101, Санкт-Петербург, Россия;

Examination of Coronaviridae family members presence in bats

U.S. Veselkina¹, A.P. Luch², E.A. Goncharova³

¹St. Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics, 197101, Saint Petersburg, Russia;

²SPSIT (St. Petersburg State Institute of Technology), 190013, Saint Petersburg, Russia;

³St. Petersburg Pasteur Institute, 197101, Saint Petersburg, Russia

В 2020—2021 гг. существенное влияние на все страны мира оказала пандемия, вызванная вирусом SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus), относящегося к семейству Coronaviridae. Резервуаром для вирусов семейства Coronaviridae являются летучие мыши, которые также, возможно, стали источником вируса SARS-CoV-2. Следовательно, в настоящий момент актуальна проблема распространенности среди летучих мышей возбудителей коронавирусной инфекции, в том числе вирусов представителей родов альфа- и бета-коронавирусов, которые являются вирулентными для людей.

Цель работы — выявление наличия в образцах тканей летучих мышей Дальнего Востока и Маньчжурии возбудителей альфа-, бета- и гамма-коронавирусной инфекции.

Были получены гомогенизированные образцы тканей органов летучих мышей, обитающих на территориях Дальнего Востока и Маньчжурии. Из образцов были выделены нуклеиновые кислоты (НК), проведена реакция обратной транскрипции с целью получения комплементарной ДНК. Поиск участков нуклеотидных последовательностей геномов коронавирусов родов альфа, бета или гамма в нативном материале проводился путем постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) с родовыми праймерами (парные короткие одноцепочечные, искусственно синтезированные последовательности НК коронавирусов, соответствующие началу участка генома, специфичного для конкретного рода). Для установления наличия в образцах таргетных ампликонов проводился электрофорез в агарозном геле, далее отбирались образцы, содержащие ампликоны длиной 500 пар нуклеотидов.

Было исследовано 100 образцов тканей летучих мышей. Альфа-коронавирусы были обнаружены в 27 образцах, бета-коронавирусы — в 32 и гамма-коронавирусы — в 12, что свидетельствует о том, что дикие летучие мыши, обитающие на территории Дальнего Востока и Маньчжурии, являются переносчиками альфа-, бета- и гамма-коронавирусов, которые потенциально опасны для человека. Следующим этапом работы планируется проведение высокопроизводительного секвенирования для определения нуклеотидных последовательностей полученных ампликонов и дальнейшего поиска новых коронавирусов с внесением данных в GenBank, NCBI.

* * *

Экспрессия паралогов CENH3 в процессе онтогенеза гибридов секалотритикум

С.С. Гацкая, Е.В. Евтушенко

Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: jait@mail.ru

Expression patterns of CENH3 paralogs during ontogenesis of secalotriticum hybrids

S.S. Gatzkaya, E.V. Evtushenko

Institute of Molecular and Cellular Biology SB RAS, 630090, Novosibirsk, Russia; e-mail: jait@mail.ru

Центромерный вариант гистона H3 (CENH3) играет ключевую роль в правильном функционировании центромер. У злаков трибы Triticeae обнаружено два варианта гена: αCENH3 и βCENH3. Они отличаются размером, гетерогенностью аминокислотного состава в NTT-домене и различной экзон-интронной структурой. В настоящей работе мы определяли тканеспецифичные профили транскрипции паралогов CENH3 в процессе онтогенеза в двух сортах, «Imperial» и «Короткостебельная 69», культивируемой ржи S. cereale, а также у ржано-пшеничных гибридов секалотритикум (Secalotriticum Верасень×Михась и Верасень×Дубрава) и их родительских видов (ржи S. cereale ‘Верасень’ и Triticale ‘Михась’ и ‘Дубрава’). Использование гибридных форм позволяет сравнить работу генов CENH3 в условиях собственной родительской и гибридной цитоплазматической среды. Выявлено, что оба гена экспрессируются на всех стадиях индивидуального развития, и профили экспрессии у родительских видов и гибридов секалотритикум идентичны. Уровни экспрессии αCENH3, как правило, на порядок превышают соответствующие значения βCENH3. После прорастания уровни транскрипции генов CENH3 значительно снижаются (в среднем в 8 раз ниже в ткани листьев, чем в ткани колеоптилей), и многократно увеличиваются в генеративных тканях по сравнению с вегетативными (в 2—3 раза выше в пыльниках, чем в колеоптилях). Сохранение активности генов CENH3 у секалотритикум на одном уровне с родительскими видами свидетельствует о том, что гибридная цитоплазма не оказывает влияния на данный показатель. Аналогичные профили транскрипции получены для сортов культивируемой ржи, причем в отношениях уровней транскрипции α и β CENH3 выявлены тканеспецифичные колебания.

Поддержано грантом РФФИ 20-04-00699 А.

* * *

Генетическая идентификация триплоидных гибридов Darevskia unisexualis x D. valentini из симпатрических популяций Армении

А.Е. Гирнык¹, А.А. Вергун^{1, 2}

¹ФГБУН «Институт биологии гена» РАН, 119334, Москва, Россия;

²ФГБОУ ВО «Московский педагогический государственный университет» (МПГУ), 119991, Москва, Россия; e-mail: nasstenochka@mail.ru

Genetic identification of Darevskia unisexualis x D. valentini triploid hybrids from sympatric populations of Armenia

A.E. Girnyk¹, А.A. Vergun^{1 ,2}

¹Institute of Gene Biology of the Russian Academy of Sciences, 119334, Moscow, Russia;

²Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Moscow Pedagogical State University», 119991, Moscow, Russia; e-mail: nasstenochka@mail.ru

Полиплоидные виды составляют большинство однополых видов рептилий. Однако партеногенетические ящерицы рода Darevskia в большинстве своем являются диплоидами, возникшими в результате межвидовой гибридизации генетически близких двуполых видов. Триплоидные гибриды скальных ящериц появляются вследствие обратного скрещивания партеногенетических самок с самцами двуполых видов в зоне частичного перекрытия их ареалов. При этом морфологическая идентификация полиплоидов Darevskia затруднена, поскольку они обладают сложным промежуточным фенотипом. В данной работе проведено микросателлитное генотипирование предполагаемых гибридов D. unisexualis x D. valentini из популяции Кучак Армении. В результате, пять особей были идентифицированы как триплоиды и две — как диплоиды. Секвенирование выявленных аллелей подтвердило гибридную природу исследованных особей. Все аллели содержали микросателлитные кластеры и однонуклеотидные замены во фланкирующих микросателлит областях, которые позволяли дифференцировать аллели согласно их происхождению от родительских видов. Было установлено, что триплоидные гибриды в исследованных локусах содержали два аллеля партеновида D. unisexualis и один аллель двуполого вида D. valentini, а диплоидные особи содержали два аллеля D. valentini. Изучение полиплоидных видов имеет большое значение для характеристики прогрессивных этапов сетчатой эволюции скальных ящериц, а идентификация и дифференциация гибридных особей необходима при популяционно-генетических исследованиях смешанных популяций.

Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ №19-14-00083.

* * *

Изменение каталитических свойств цитохромов CYP74 методом сайт-направленного мутагенеза

С.С. Горина, Е.О. Смирнова, Л.Ш. Мухтарова, Я.Ю. Топоркова, А.Н. Гречкин

Казанский институт биохимии и биофизики — обособленное структурное подразделение ФИЦ КазНЦ РАН, 420111, Казань, Россия; e-mail: gsvetlana87@gmail.com

Conversion of the catalytic properties of cytochromes CYP74 by site-directed mutagenesis

S.S. Gorina, E.O. Smirnova, L.S. Mukhtarova, Ya.Yu. Toporkova, A.N. Grechkin

Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center, Russian Academy of Sciences, 420111, Kazan, Russia; e-mail: gsvetlana87@gmail.com

Ферменты CYP74 принадлежат к атипичным цитохромам Р450, которым для каталитической активности не требуются молекулярный кислород и окислительно-восстановительные партнеры. Донором кислорода и электронов выступают субстраты — гидроперекиси полиеновых жирных кислот. К ферментам CYP74 относятся две дегидратазы (алленоксидсинтаза (АОС) и дивинилэфирсинтаза (ДЭС)) и две изомеразы (гидропероксидлиаза (ГПЛ) и эпоксиалкогольсинтаза (ДЭС)), при участии которых в растениях синтезируется обширный спектр биологически активных метаболитов. Поскольку ферментам CYP74 для катализа не требуется кислород, то аминокислотные остатки, формирующие каталитический центр, отличаются от таковых характерных для моноооксигеназ Р450. За последние годы в ходе наших работ были получены мутантные формы ферментов CYP74 огурца (CsHPL/EAS L93F/G283A, CsHPL/EAS/AOS L98F/A287G), кукурузы (ZmAOS1 F95L), томата (LeAOS3 F108L), льна (LuAOS F155L, LuDES F291V, LuDES A287G), мха фискомитреллы (PpAOS2 F93L), спаржи (AoDES L98F) и др. с частичной или полной конверсией каталитической активности. Таким образом, полученные данные указывают, что на изменение типа катализа в большей степени влияют замены в сайте «F/L toggle» и гидропероксид-связывающем домене.

Работы по культивированию мха P. patens и его молекулярно-биологические исследования проводились при финансовой поддержке гранта МК-903.2020.4. Изучение катализа мутантных форм проводилось при финансовой поддержке гранта РНФ 20-14-00338. Биоинформационный анализ ферментов CYP74 проводился при финансовой поддержке государственного задания Федерального исследовательского центра «Казанский научный центр Российской академии наук».

* * *

Снижение агрегативности суспензионной клеточной культуры arabidopsis thaliana за счет нарушения экспрессии генов GAUT1 и GAUT7

Е.И. Григорьева¹, Ю.В. Сидорчук², Е.В. Дейнеко²

¹ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», 630090, Новосибирск, Россия;

²ФГБУН «ФИЦ Институт цитологии и генетики» СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: grigoreva.eln@mail.ru

Reduction of aggregation properties of arabidopsis thaliana’s suspension cell cultures’ by impairing expression of GAUT1 and GAUT7 genes

E.I. Grigoryeva¹, Yu.V. Sidorchuk², E.V. Deineko²

¹Novosibirsk State University, 630090, Novosibirsk, Russia;

²Institute of Cytology and Genetics Siberian Branch of Russian Academy of Science, 630090, Novosibirsk, Russia; e-mail: grigoreva.eln@mail.ru

Растительные суспензионные клеточные культуры обладают обширным рядом преимуществ, что делает их перспективными продуцентами рекомбинантных белков. Однако существенный их недостаток — низкий выход целевого продукта. Причиной этого, предположительно, является склонность растительных клеток образовывать агрегаты. Поэтому снижение агрегативности суспензионных культур может привести к повышению их продуктивности.

Ранее уже предпринимались попытки снизить агрегативность суспензий химическим и механическим способами, однако эти методы оказались неэффективными за счет неуниверсальности или непродолжительного эффекта. На сегодняшний день причины склонности растительных клеток образовывать агрегаты остаются не до конца изученными, однако известно, что немалое участие в этом процессе принимают пектины клеточных стенок. Для решения проблемы мы предлагаем нарушить экспрессию генов GAUT1 и GAUT7, чьи белковые продукты играют ведущую роль в синтезе пектиновых полимеров.

Нами получена трансгенная линия A. thaliana экотипа Columbia-0 с геном зеленого флуоресцентного белка (GFP), которая будет служить исходной линией для геномного редактирования. А также выбраны таргетные последовательности в геноме, к которым подобраны gRNA для сайт-направленного нокаутирования целевых генов с использованием системы CRISPR/Cas-9.

* * *

Молекулярная организация центромерного хроматина ржи

Е.О. Гришко, Е.В. Евтушенко

ФГБУН «Институт молекулярной и клеточной биологии» СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: gr33151@yandex.ru

Molecular organization of rye centromeric chromatin

E.O. Grishko, E.V. Evtushenko

Institute of molecular and cellular biology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (IMCB RAS), 630090, Novosibirsk, Russia; e-mail: gr33151@yandex.ru

Центромероспецифичный гистон H3 (CENH3) замещает канонический гистон H3, являясь универсальным маркером центромеры на уровне нуклеосом и хроматина. В большинстве диплоидных геномов растений этот вариант гистона кодируется одним геном, включая виды, подвергшиеся полногеномной дупликации в ходе эволюции. Тем не менее у ряда диплоидных растений имеются два гена CENH3. Геномы многих видов семейства Poaceae — пшеницы Triticum urartu, ячменя Hordeum vulgare, ржи Secale cereale, эгилопсов Aegilops tauschii, Aegilops speltoides, содержат два гена CENH3. Анализ данных секвенирования генома ржи подтвердил наличие генов-паралогов (αCENH3 и βCENH3) и дал возможность выяснить молекулярную структуру геномного локуса CENH3. Непрямое иммуноокрашивание хромосом ржи сорта Империал с использованием антител, специфичных к αCENH3 и βCENH3, и последующая визуализация сигналов методами широкопольной и конфокальной микроскопии показали, что αCENH3 и βCENH3 локализуются на центромерах интерфазных ядер и хромосом на различных стадиях митоза. Таким образом, обе копии CENH3 ржи, возникшие вследствие дупликации, сохраняют свои первоначальные функции, а белки, кодируемые ими, включаются в центромеры.

Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект №20-04-00699а).

* * *

Оптимизация методики выделения ДНК из листьев дуба

О.Ю. Гусева, С.Г. Ржевский

ФГБУ «Всероссийский НИИ лесной генетики, селекции и биотехнологии», 394087, Воронеж, Россия; e-mail: ilgis@lesgen.vrn.ru

Optimization of the technique for DNA isolation from oak leaves

O.Yu. Guseva, S.G. Rzhevsky

All-Russian Research institute of Forest Genetics, Breeding and Biotechnology, 394087, Voronezh, Russia; e-mail: ilgis@lesgen.vrn.ru

В связи с проблемой усыхания дубрав, в данный момент активно разрабатываются меры по восстановлению насаждений дуба. Сохранение желаемых хозяйственно-ценных признаков растения происходит только при вегетативном размножении, однако традиционное черенкование дуба практически невозможно уже в раннем возрасте. Во Всероссийском НИИ лесной генетики, селекции и биотехнологии проводятся исследования по оптимизации клонального микроразмножения дуба черешчатого. Введение образцов в культуру in vitro сопровождается их генетической паспортизацией, что необходимо для дальнейшей оценки устойчивости генотипа.

Однако при работе с дубом возникают сложности на стадии выделения ДНК, так как его листья богаты смолянистыми и дубильными веществами. Для работ по генотипированию дуба была проведена оптимизация методики выделения ДНК. В качестве основы использовалась методика c СTAB-буфером [1]. Установлено, что получить качественный препарат ДНК помогают следующие модификации: 1) использование как можно более молодых листьев; 2) гомогенизация малой навески листовой ткани (5—10 мг); 3) для гомогенизации помимо 500 мл буфера выделения с СTAB прибавляется равный объем 5% раствора поливинилпирролидона; 4) после гомогенизации образцы подвергаются более длительному инкубированию (50—60 мин при 60 °С). Данные меры позволяют добиться повышения выхода качественной ДНК для дальнейшего проведения молекулярно-генетических анализов.

Литература

1. Doyle JJ. A Rapid DNA Isolation Procedure for Small Quantities of Fresh Leaf Tissue. Phytochemistry Bull. 1987;19:11-15.

* * *

Вовлеченность генов MRAS и MIR135A2 в развитие депрессивности

Ю.Д. Давыдова, А.В. Казанцева, Р.Ф. Еникеева, Э.К. Хуснутдинова

Институт биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра РАН, 450054, Уфа, Россия; e-mail: julia.dmitrievna@list.ru

The involvement of MRAS and MIR135A2 genes in depression level

Yu.D. Davydova, A.V. Kazantseva, R.F. Enikeeva, E.K. Khusnutdinova

Institute of Biochemistry and Genetics of the Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Sciences, 450054, Ufa, Russia; e-mail: julia.dmitrievna@list.ru

Для изучения основного эффекта полиморфных локусов генов MRAS (rs9818870) и MIR135A2 (rs10459194), участвующих в микроРНК-опосредованной регуляции экспрессии генов, и ген-средовых взаимодействий в развитии депрессивности у 1052 здоровых индивидов (80,23% женщин, средний возраст 19,98±1,80 года) нами было проведено определение уровня депрессивности по шкале депрессии Бека, генотипирование полиморфных локусов (Real-Time PCR) и статистическая обработка данных (PLINK v.1.9). В результате линейного регрессионного анализа была выявлена ассоциация аллеля rs10459194*C с повышенной депрессивностью в общей выборке (β=0,71, p=0,03). При анализе ген-средовых взаимодействий было установлено, что такие факторы, как «число детей в семье» (β=1,69, p=0,03), «порядок рождения» (β=1,12, p=0,02) и «недоношенность» (β=2,73, p=0,04) модулируют ассоциацию аллеля rs10459194*C, тогда как «неполная семья» (β=2,70, p=0,02) и «недоношенность» (β=4,29, p=0,01) — ассоциацию аллеля rs9818870*T с повышенным уровнем депрессивности. Таким образом, в работе продемонстрирована вовлеченность генов MRAS и MIR135A2 в развитие депрессивности под действием особенностей пренатального развития и детско-родительских отношений, которые могут выступать в качестве триггеров для изменения эпигенетической регуляции.

* * *

Генетическое наследие скифской эпохи

М.А. Джаубермезов^{1, 2}, Н.В. Екомасова^{1, 2}, Л.Р. Габидуллина¹, Э.К. Хуснутдинова^{1, 2}

¹Башкирский государственный университет, кафедра генетики и фундаментальной медицины, 450076, Уфа, Россия;

²Институт биохимии и генетики — обособленное структурное подразделение ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр» РАН, 450054, Уфа, Россия; e-mail: murat-kbr@mail.ru

Scythian era genetic heritage

M.A. Dzhaubermezov^{1, 2}, N.V. Ekomasova^{1, 2}, L.R. Gabidullina¹, E.K. Khusnutdinova^{1, 2}

¹Department of Genetics and Fundamental Medicine, Bashkir State University, 450076, Ufa, Russia;

²Institute of Biochemistry and Genetics — Subdivision of the Ufa Federal Research Centre of Russian Academy of Sciences, 450054, Ufa, Russia

Скифы — древние кочевники евразийских степей железного века (VIII век до н.э. — IV век н.э.). Модель полиэтнического населения популяции скифов была поддержана в современных работах, посвященных генетической структуре данных исторических культур (Unterlander и соавт., 2017; Damgaard и соавт., 2018).

В ходе выполнения работы нами были отобраны костные останки (зубы) 9 индивидов из скифской и сарматской культуры, была выделена ДНК и проведено полное секвенирование Y-хромосомы в 5 мужских образцах. Было показано, что образцы ДНК из скифской и сарматской культуры принадлежали к четырем различным гаплогруппам Y-хромосомы: Q1c-L332 (MJ-38), R1a1e-CTS1123 (LS-13), R1a-Z645 (MJ-39 и MJ-42), E2b1-PF6746 (MJ-40). Проведенный скрининг с использованием 2646 образцов из современных популяция Северной Евразии показал, что гаплогруппа R1a1e-CTS1123 встречается только в субпопуляции казанских татар с частотой 1,9%; гаплогруппа E2b1-PF6746 была обнаружена в популяцииях балкарцев (0,8%), кабардинцев (0,7%) и коми (4%); гаплогруппа Q1c-L332 не была нами обнаружена ни в одной из исследованных популяций.

Исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования РФ (FZWU-2020-0027).

* * *

Экспрессия сигнальных белков и нейропротективная роль вальпроата натрия в спинномозговых ганглиях крысы после перерезки седалищного нерва

В.А. Дзреян, С.В. Родькин, М.А. Питинова

Южный федеральный университет, лаборатория молекулярной нейробиологии, 344090, Ростов-на-Дону, Россия; e-mail: dzreyan2016@mail.ru

The expression of signaling proteins and protective role of sodium valproate in the rat dorsal root ganglia after sciatic nerve transection

V.A. Dzreyan, S.V. Rodkin, M.A. Pitinova

Southern Federal University, Laboratory of Molecular Neurobiology, 344090, Rostov-on-Don, Russia; e-mail: dzreyan2016@mail.ru

Иммуноблоттинг показал, что в аксотомированных ганглиях дорзальных корешков спинного мозга крысы (dorsal root ganglia — DRG) экспрессия гистондеацетилазы HDAC1 возрастает через 1 ч после перерезки седалищного нерва (аксотомии), фактора транскрипции E2F1 — через 4 ч, проапоптотического белка р53 — через 24 ч. Вероятно, эти белки готовят последующие изменения других белков и общую реакцию клеток DRG ганглиев на перерезку седалищного нерва. Через 7 сут повышается уровень маркеров дегенерации и регенерации аксона АРР и GAP-43. Ингибирование гистондеацетилаз HDAC1 и HDAC2 вальпроатом натрия защищает глиальные клетки DRG ганглиев крыс от апоптоза, вызванного аксотомией. Инъекции вальпроата в течение 7 сут снижают уровень проапоптотических белков E2F1, p53 и caspase 3 в DRG крыс, а также накопление АРР в нейронах, повышают уровень GAP-43 и предотвращают вызванное аксотомией снижение уровня ацетилирования гистонов H3 и H4, которое может привести к снижению белкового синтеза в клетке. Метод двойной иммунофлуоресцентной микроскопии показал, что перерезка седалищного нерва вызывает транслокацию HDAC1 и белка р53 из ядра в цитоплазму в первые 24 ч после аксотомии. Таким образом, наши данные свидетельствуют о вовлеченности HDAC1 в вызванное аксотомией повреждение нейронов DRG и глиальных клеток, а ингибитор HDAC вальпроат натрия демонстрирует нейропротективную активность в аксотомированных DRG. Исследуемые белки могут служить в качестве потенциальных молекулярных мишеней при разработке нейропротективных фармакологических агентов.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Минобрнауки РФ №0852-2020-0028 и стипендии Президента Российской Федерации для молодых ученых.

* * *

Полногеномный поиск следов естественного отбора с использованием статистики популяционных ветвей

И.А. Дубинкин^{1, 2}, Г.В. Хворых¹, А.В. Хрунин¹

¹ФГБУ «Институт молекулярной генетики» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», 123182, Москва, Россия;

²ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», 125047, Москва, Россия

Genome-wide study of signatures of natural selection using population branch statistic

I.A. Dubinkin^{1, 2}, G.V. Khvorykh¹, A.V. Khrunin¹

¹Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», 123182, Moscow, Russia;

²D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, 125047, Moscow, Russia

В работе осуществлен поиск следов естественного отбора в геномных данных популяций хантов, манси и ненцев. К исходным данным, представленным комбинациями аллельных вариантов однонуклеотидных полиморфных локусов (ОНП), полученным с помощью ДНК-микрочипов Omni, была применена статистика популяционных ветвей (PBS). Она использует попарные значения Fst между фокусной и двумя референсными популяциями, чтобы оценить степень эволюционного своеобразия фокусной популяции. В качестве референсных популяций выступили европейцы и китайцы из проекта HapMаp. 50 ОНП с наибольшим значением PBS были отобраны; гены, в которых они расположены, приняты в качестве генов-кандидатов. Количество генов-кандидатов составило 22, 22, 25 для хантов, манси и ненцев соответственно. При этом 17 из них были общими для всех трех популяций, а суммарное количество всех генов-кандидатов составило 32. Также, с целью включения в анализ протяженных участков повышенных значений PBS, был проведен расчет методом скользящего среднего. Анализ генов, содержащих ОНП из верхних 0,1 и 1% распределения PBS, на сверхпредставленность в биологических процессах выявил группы, связанные с метаболизмом липидов, функционированием аппарата Гольджи и развитием речи.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №20-04-00824.

* * *

Генетические аспекты механочувствительности альфа-протеобактерий со смешанным жгутикованием Azospirillum baldaniorum

С.С. Евстигнеева, Е.М. Телешева, Д.И. Мокеев, И.В. Борисов, Л.П. Петрова, А.В. Шелудько

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049, Саратов, Россия; e-mail: stels20295@yandex.ru

Genetic aspects of mechanosensitivity in the alphaproteobacteria with mixed flagellation Azospirillum baldaniorum

S.S. Evstigneeva, E.M. Telesheva, D.I. Mokeev, I.V. Borisov, L.P. Petrova, A.V. Shelud’ko

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 410049, Saratov, Russia; e-mail: stels20295@yandex.ru

Стимулирующие рост растений бактерии Azospirillum baldaniorum Sp245 отвечают на смену плотности среды изменениями характера жгутикования (синтез полярного [Fla] или латеральных [Laf] жгутиков) и образа жизни (образование колоний и биопленок). Однако механизмы восприятия механических сигналов у азоспирилл изучены недостаточно. Целью работы являлась проверка гипотезы о том, что предполагаемая мультисенсорная гибридная гистидинкиназа — регулятор ответа (HSHK—RR) и компонент FlhB системы сборки Fla, кодируемые A. baldaniorum Sp245 смежными хромосомными генами, задействованы в механосенсинге и механотрансдукции. Были получены производные штамма Sp245 и его Fla^-Laf^- мутанта Sp245.1063 (flhB1::Omegon-Km) с увеличенной дозой HSHK—RR. Оказалось, что мутация в гене, кодирующем белок FlhB, или увеличение числа копий гена, кодирующего HSHK—RR, влияют на подвижность и ультраструктуру клеток, динамику изменения размера клеток и характера жгутикования при смене механических свойств среды. Получены флуоресцентно-меченные производные исследованных штаммов азоспирилл, подобраны условия для исследования формирования и микроструктуры биопленок in planta.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 20-04-00006_а).

* * *

Использование в космической радиобиологии одноклеточных эукариот в качестве модельного организма

В.С. Елизарова¹, Н.А. Бебякова¹, Н.А. Колтовая²

¹ФГБОУ ВО «Северный государственный медицинский университет» Минздрава России, 163000, Архангельск, Россия;

²Объединенный институт ядерных исследований, ЛРБ, 141980, Дубна, Россия; e-mail: nika-elizarova@yandex.ru

Using single-celled eucaryotes as a model organism in space radiation biology

V.S. Elizarova¹, N.A. Bebyakova¹, N.A. Koltovaya²

¹Northern State Medical University, 163000, Arkhangelsk, Russia;

²Joint Institute for Nuclear Research, 141980, Dubna, Russia; e-mail: nika-elizarova@yandex.ru

В связи с длительными космическими экспедициями на Международную космическую станцию, с появлением в ближайшем будущем пилотируемых миссий на Луну и Марс возникает вопрос о медицинской подготовке космонавтов. Установлено, что во время космических путешествий воздействие микрогравитации, радиации и стресса иного рода может изменить микробиом и привести к нарушению иммунорегуляторных механизмов человека. Поэтому необходимо проведение микробиологических исследований на моделях для того, чтобы выявить степень влияния космических факторов на микроорганизмы. Было проведено исследование чувствительности лабораторного штамма дрожжей к мутагенному действию ускоренных ионов азота. Показано, что ускоренные ионы азота имеют более высокий биологический эффект по сравнению с редко ионизирующим γ-излучением. Это касается как летального, так и мутагенного эффектов. Относительная биологическая эффективность летального действия — 3,5±0,7, мутагенного действия — 4,4±0,6. Секвенирование генома показало, что подавляющую долю мутаций составляют однонуклеотидные делеции как в случае спонтанного возникновения, так и при облучении. Однако с увеличением дозы облучения возрастает доля протяженных делеций.

* * *

Краткая геномная характеристика возбудителя инфекционного аборта пушных животных

С.С. Зайцев¹, М.А. Хижнякова¹, В.В. Евстифеев², Ф.М. Хусаинов², Р.Х. Равилов³, Д.Д. Морозова³, В.А. Федорова¹

¹СарНИВИ-филиал ФГБНУ ФИЦВиМ, 410028, Саратов, Россия;

²ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 420075, Казань, Россия;

³ФГБОУ ВО Казанская ГАВМ, 420029, Казань, Россия; e-mail: zaytsev-sergey@inbox.ru

Brief genomic characteristic for infectious abortion agent of fur animals

S.S. Zaytsev¹, M.A. Khizhnyakova¹, V.V. Evstifeev², F.M. Khusainov², R.Kh. Ravilov², D.D. Morozova³, V.A. Feodorova¹

¹Federal Research Center for Virology and Microbiology, Branch in Saratov, 410028, Saratov, Russia;

²FSBSI «FCTRBS-ARRVI», 420075, Kazan, Russia;

³Kazan State Academy of Veterinary Medicine by N.E. Bauman, 420029, Kazan, Russia; e-mail: zaytsev-sergey@inbox.ru

Цель нашей работы — молекулярно-генетическая характеристика и филогенетический анализ этиологического фактора хламидийной инфекции во время вспышки, зарегистрированной на территории звероводческого хозяйства у пушных зверей. Биоматериал от абортировавших животных (лисицы) пассировали на куриных эмбрионах с последующим полногеномным секвенированием на платформах MinlON (Oxford Nanopore Technologies) и lllumina HiSeq 2500. В результате гибридной сборки был получен контиг размером 1171449 bp, замкнутый в кольцевую хромосому и обладающий наибольшей гомологией с геномами штаммов Chlamydia psittaci Rostinovo-70, GR9, WS/RT/E30 и GIMC2004:CpsAP23, доступных в базе NCBl GenBank. Однако, в отличие от последних, анализируемый геном не содержал криптической плазмиды. Выравнивание семи генов «домашнего хозяйства» (gatA/oppA/hflX, gidA/enoA/hemN/fumC) с референсными последовательностями из базы данных PubMLST не выявило полиморфизма в указанных локусах при сопоставлении аллельного профиля. В результате мы определили принадлежность изучаемого генома к клональному комплексу, соответствующему 28 сиквенс-типу (ST28). Таким образом, мы впервые сообщаем о случае обнаружения C. psittaci у представителей вида Vulpes vulpes с клиническими проявлениями генитальной хламидийной инфекции.

Работа выполнена при поддержке проекта РНФ №17-16-01099.

* * *

Ассоциация генов факторов свертываемости крови с ишемическими инсультами в украине

Я.С. Заплатников², В.В. Башинская¹, Е.В. Мурланова¹, В.В. Мосейко¹, О.А. Загородня², Ю.Г. Борисович², A.К. Коляда¹

¹Молекулярно-диагностическая лаборатория ТОВ «Диаген»;

²УНЦ «Институт биологии и медицины» КНУ им. Т. Шевченко, Киев, Украина

Association of coagulation factors genes polymorphisms with ischemic stroke in ukraine

Ya.S. Zaplatnikov², V.V. Bashinskaya¹, E.V. Murlanova¹, V.V. Moseiko¹, O.A. Zagorodnya², Yu.G. Borisovich², A.K. Koliada¹

¹Molecular Diagnostic Laboratory LTD, «Diagen»;

²ESC «Institute of Biology and Medicine» of the Taras Shevchenko National University, Kiev,Ukraine

В данной работе проанализирована ассоциация полиморфных вариантов генов коагуляционных факторов (F2, F5, F7 и F13A1) с возникновением ишемических инсультов у населения Украины.

Всего исследованы образцы крови 161 человека. В том числе 73 неродственных пациентов с ишемическим атеротромботическим инсультом (37 мужчин и 36 женщин, средний возраст 66,1±10,3 года) и 88 здоровых добровольцев (19 мужчин, 67 женщин, средний возраст 64,4±11,6 года). Методами ПЦР в реальном времени исследовали полиморфизмы генов F5 (rs6025), F7 (rs6046) и F13A1 (rs5985).

Результаты. Анализ частот генотипов в контрольной выборке исследуемой популяции выявил, что все изученные аллели распределены по закону Харди—Вайнберга, за исключением полиморфизма в гене фактора V Лейдена (F5). Все частоты генотипов, кроме F5, соответствуют европейскому населению согласно базе данных 1000 Genomes. Ассоциации и отношение шансов (OR) между генами факторов свертываемости крови и ишемическими инсультами рассчитывались с использованием полиномиальной логистической регрессии (Mgl). Модель Mgl выявила статистически значимую связь между полиморфизмами в генах факторов свертывания крови и ишемическими инсультами: F5 rs6025 (OR=0,52, 95% CI 0,49—0,55; p=0,035), F7 rs6046 (OR=0,92, 95% CI 0,97—0,87; p=0,049), F13A1 rs5985 (OR=1,26, 95% CI 1,32—1,2; p=0,034). Анализ связи между негенетическими факторами и заболеванием с использованием линейной регрессии выявил значимую взаимосвязь между ишемическими инсультами, злоупотреблением алкоголя (OR=0,4, 95% CI 0,42—0,38; p=0,013) и курением (OR=0,37, 95% CI 0,39—0,35; p=0,0097).

* * *

Применение массового параллельного секвенирования для диагностики лекарственно-устойчивой эпилепсии у детей

А.С. Иванова¹, Л.Н. Сивицкая¹, О.Д. Левданский¹, С.Л. Куликова²

¹Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, 220072, Минск, Беларусь;

²РНПЦ Неврологии и нейрохирургии, 220014, Минск, Беларусь; e-mail: a.s.ivanova97@gmail.com

Massive parallel sequencing for the diagnosis of drug-resistant epilepsy in children

A.S. Ivanova¹, L.N. Sivitskaya¹, A.D. Liaudanski¹, S.L. Kulikova²

¹Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus, 220072, Minsk, Belarus;

²Republican Research and Clinical Center of Neurology and Neurosurgery; 220014, Minsk, Belarus; e-mail: a.s.ivanova97@gmail.com

Эпилепсия — распространенное неврологическое заболевание, характеризующееся предрасположенностью к возникновению эпилептических приступов. Наиболее высокая заболеваемость наблюдается в детском возрасте, при этом примерно у 20—30% детей эпилепсия протекает в лекарственно-устойчивой форме. В таких случаях для подбора адекватной терапии особую важность имеет уточненный диагноз, основанный на установлении конкретного генетического дефекта, который вызывает эпилептическую активность.

Цель работы — проведение секвенирования клинического экзома пациентов с лекарственно-устойчивой эпилепсией для обнаружения патогенных вариантов, обусловливающих развитие этого заболевания.

Секвенирование клинического экзома проводилось с использованием панели генов TruSight One Sequencing Panel (Illumina Inc., США) на приборе NextSeq (Illumina Inc., США).

На данный момент исследованы 11 пациентов в возрасте от 3 до 8 лет. В 4 (36,4%) случаях установлена вероятная причина заболевания. Все верифицированные варианты имеют статус de novo. Среди них — однонуклеотидные варианты, приводящие к замене аминокислотных остатков (в генах CACNA1A и GABRA1) или к обрыву синтеза белка (STXBP1), а также делеция, ведущая к сдвигу рамки считывания (MECP2).

В 3 (27,3%) случаях предполагается возможная причина, требующая верификации альтернативным методом и проведения функционального анализа.

Таким образом, был подтвержден диагноз и найдена причина лекарственно-устойчивой эпилепсии в более чем 1/3 случаев. Считаем актуальным продолжать исследование с целью расширения исследуемой группы и улучшения алгоритма поиска патогенных вариантов.

* * *

Мониторинг активности системы CRISPR/Cas13а методом атомно-силовой микроскопии

И.А. Иванова, Т.О. Плешакова, Ю.Д. Иванов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича», Москва, Россия; e-mail: i.a.ivanova@bk.ru

MONITORING SYSTEM ACTIVITY CRISPR / CAS13А BY ATOMIC-FORCE METHOD MICROSCOPIES

I.A. Ivanova, T.O. Pleshakova, Yu.D. Ivanov

Institute of Biomedical Chemistry (IBMC) Moscow, Russia; e-mail: i.a.ivanova@bk.ru

Визуализация функционирующих систем с высоким пространственно-временным разрешением является важной целью структурной биологии и биофизики. Динамическое поведение белков может быть изучено с помощью флуоресцентной микроскопии одиночных молекул и нанометрии оптических ловушек, но сами молекулы белка при наблюдениях не видимы [1]. Исследования с использованием метода атомно-силовой микроскопии позволяют проводить визуализацию отдельных молекул как нуклеиновых кислот, так и белков. Уже показана визуализация процесса расщепления ДНК, опосредованного Cas9 [2]. АСМ данные предоставили сведения о функциях комплекса CRISPR-Cas9, включая сложную сборку, поиск целевой ДНК, расщепление цепи и выпуск продукта, что существенно улучшило понимание механизма инструмента генетического редактирования [2].

В нашей работе предложен подход для мониторинга активности в системе CRISPR-Cas13a на основе измерений амплитуды флуктуаций высот молекулярного комплекса в процессе каталитического цикла. Для реализации подхода предлагается схема, включающая следующие этапы по визуализации: единичной молекулы Cas13a; предварительно собранной системы Cas13-РНК; процесса связывания Cas13-РНК с целевой ДНК в отсутствии Mg ²⁺ (во избежание Mg²⁺-зависимого расщепления ДНК); процесса расщепления целевой ДНК с помощью Cas13-РНК (инициация реакции путем добавления Mg²⁺).

Литература

1. Uchihashi T, Kodera N, Ando T. Guide to video recording of structure dynamics and dynamic processes of proteins by high-speed atomic force microscopy. Nat Protoc. 2012;7:1193-1206.

2. Shibata M, Nishimasu H, Kodera N, et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nat Commun. 2017;8:1430.

* * *

Анализ транскриптома проростков чернобыльского экотипа arabidopsis thaliana после воздействия условий моделируемого космического полета

Е.А. Казакова¹, М.С. Подлуцкий¹, М.Ю. Подобед¹, Д.Д. Бабина¹, В.О. Сабуров², Е.И. Казаков², И.В. Горбатова¹, П.Ю. Волкова¹

¹ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии», 249032, Обнинск, Россия;

²МРНЦ им. А.Ф. Цыба — филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 249031, Обнинск, Россия; e-mail: elisabethafeb19@gmail.com

The transcriptome analysis of arabidopsis thaliana seedlings of the chernobyl ecotype after exposure to simulated space flight conditions

E.A. Kazakova¹, M.S. Podlutskii¹, M.Yu. Podobed¹, D.D. Babina¹, V.O. Saburov², E.I. Kazakov², I.V. Gorbatova¹, P.Yu. Volkova¹

¹Russian Institute of Radiology and Agroecology, 249032, Obninsk, Russia;

²A. Tsyb MRRC — branch of the National Medical Research Radiological Center of the Ministry of Health of the Russian Federation, 249031, Obninsk, Russia; e-mail: elisabethafeb19@gmail.com

Для освоения космического пространства и его использования в рамках межпланетных миссий важен поиск возможностей увеличения устойчивости растений к условиям космоса. В рамках данного исследования предпринята попытка оценить возможность увеличения стрессоустойчивости к моделируемым космическим условиям проростков A. thaliana, выросших из семян растений, хронически облученных в зоне отчуждения Чернобыльской АЭС. Для этого в декабре 2020 г. проростки A. thaliana Чернобыльского экотипа и дикого типа Col-8 на 13-й день прорастания подвергали сочетанному действию излучения (протоны с энергией 100 МэВ, суммарная поглощенная доза для каждого образца 10 Гр) и моделируемой микрогравитации (3D-клиностатирование, скорость вращения прибора 60 об/мин). Далее образцы растений немедленно замораживали для дальнейшего анализа транскриптома методом высокопроизводительного секвенирования РНК на платформе Illumina NovaSeq 6000. На настоящий момент образцы были успешно секвенированы, данные обработаны методами биоинформатики и определены дифференциально экспрессирующиеся гены (log₂FC>2, FDR adjusted p-value <0,05). Результаты работы помогут выявить молекулярные пути, отвечающие на действие моделируемого космического пространства, в проростках Чернобыльского экотипа A. thaliana и найти детерминанты радиоадаптации для получения устойчивых к космическим условиям растений.

При поддержке гранта РНФ (проект №20-74-00101).

* * *

Роль alu-инсерций в выживаемости и долголетии человека

Д.Д. Каримов^{1 ,2}, И.А. Туктарова¹, Т.Р. Насибуллин¹, Я.Р. Тимашева¹, В.В. Эрдман¹

¹Институт биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук, 450054, Уфа, Россия;

²ФБУН УфНИИ медицины труда и экологии человека, 450106, Уфа, Россия; e-mail: lich-tsar@mail.ru

Role of alu-insertions in human survival and longevity

D.D. Karimov^{1, 2}, I.A. Tuktarova¹, T.R. Nasibullin¹, Ya.R. Timasheva¹, V.V. Erdman¹

¹Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Branch of the Russian Academy of Sciences, 450054, Ufa, Russia;

²Ufa Research Institute of Occupational Health and Human Ecology, 450106, Ufa, Russia, e-mail: lich-tsar@mail.ru

Увеличение с возрастом нестабильности генома рассматривается в рамках изучения причин старения организма. Одним из пусковых механизмов такой нестабильности выступает активация Alu-ретроэлементов (Alu-РЭ). С целью выявления роли Alu-РЭ в выживаемости и долголетии человека проведен анализ ассоциаций с возрастом полиморфизма по типу инсерция-делеция в генах-кандидатах старения и долголетия, участвующих в ключевых клеточных процессах. Материалом для исследования послужили образцы ДНК, собранных у 2000 индивидов в возрасте от 1 до 113 лет, сохранных физически и принадлежащих к этнической группе татар. Результаты генотипирования 15 локусов анализировали с помощью попарного сравнения в контрастных возрастных группах, вероятность достижения возраста и выживаемость в старческой группе и среди долгожителей оценивали путем построения логит-модели. Установлено, что риск умереть в возрасте долголетия выше у носителей генотипа HECW1*I/D. Наиболее выраженным протективным эффектом в отношении достижения возраста долголетия обладают генотипы LAMA2*I/D, CDH4*D/D и аллель CDH4*D. Таким образом, можно предположить, что гетерозиготное состояние гена HECW1, участвующего в контроле клеточного цикла путем усиления проапоптотической активности белка р53, способствует повышению вероятности смерти среди долгожителей ввиду эффекта «дозы аллеля». Alu-делеция в генах белков клеточной адгезии может способствовать сохранению стабильности в системе межклеточных взаимодействий на поздних этапах онтогенеза и повышать шансы достижения возраста долголетия.

Работа выполнена при поддержке мегагранта Правительства Российской Федерации (№2020-220-08-2197).

* * *

Секвенирование генов 18S и 28S рибосомной РНК карельской березы

П.С. Кирьянов

ГНУ «Институт леса НАН Беларуси», 246050, Гомель, Беларусь; e-mail: PKirjanov@yandex.ru

Sequencing of 18S and 28S genes of curly birch ribosomal RNA

P.S. Kiryanov

Forest research institute, 246050, Homel, Belarus; e-mail: PKirjanov@yandex.ru

Гены рибосомной ДНК являются одним из наиболее изученных участков генома у различных живых организмов. До настоящего времени изучение локусов рДНК карельской березы, в качестве баркодингового маркера, было выполнена только на основании секвенирования внутренних транскрибируемых спейсеров и гена 5,8S РНК, составляющих менее 10% от размера всего повторяющегося мотива тандемных повторов (О.Ю. Баранов, 2017 г.).

Таким образом, целью данной работы явилось на основании данных высокопроизводительного секвенирования охарактеризовать структурную организацию генов 18S и 28S рибосомной РНК карельской березы.

Пробоподготовку образцов проводили по стандартным методикам, используемым в отношении древесных растений. Высокопроизводительное секвенирование кДНК библиотек выполняли на базе Ion PGM Torrent System (Thermo Fisher Scientific, США).

По результатам de novo сборки прочтений для каждой из кДНК-библиотек было получено от 28 до 32 тыс. последовательностей разной длины и уровня прочтения, в которых были идентифицированы транскрипты 18S и 28S РНК. Их консенсусные последовательности были задепонированы в международной базе данных GeneBank NCBI (номера записей MT122805 (18S) и MT122799 (28S)).

Ген 18S рРНК. Общий размер гена для карельской березы составил 1809 н.о. Долевое участие нуклеотидных оснований (плюсовая цепь) составило: А — 24,8%, Ц — 22,2%, Г — 27,6%, Т — 25,5%, ГЦ — 49,8%.

Ген 28S рРНК. Общий размер гена для карельской березы составил 3397 н.о. Долевое участие нуклеотидных оснований (плюсовая цепь) составило: А — 23,2%, Ц — 25,1%, Г — 31,9%, Т — 19,8%, ГЦ — 56,9%.

Исследование выполнено при поддержке гранта БРФФИ Б20М-060.

* * *

Нокаут гена cbhI, кодирующего целлобиогидролазу I мицелиального гриба Penicillium verruculosum

В.Ю. Кислицин, А.М. Чулкин, А.М. Рожкова

ФИЦ Биотехнологии РАН, 119071, Москва, Россия; e-mail: kislitsin.val@gmail.com

The knockout of cellobiogidrolase 1 gene of filamentous fungus Penicillium verruculosum

V.Yu. Kislitsin, A.M. Chulkin, A.M. Rozhkova

Research Center of Biotechnology RAS, 119071, Moscow, Russia; e-mail: kislitsin.val@gmail.com

Мицелиальный гриб Penicillium verruculosum является продуцентом гликозил-гидролаз, с преобладанием в комплексе целлобиогидролазы (ЦБГ) I. С использованием сильного промотора гена cbh1 была разработана система для экспрессии рекомбинантных белков. Однако ряд промышленных задач предполагает создание реципиентного штамма, в котором, с одной стороны, будут использованы генетические элементы экспрессии гена cbh1, а с другой — будет элиминирована базовая активность ЦБГI.

Был проведен нокаут гена cbh1 в штамме P. verruculosum B1-221-6 (niaD⁺) методом CRISPR-Cas. Трансформация протопластов штамма 221-6 осуществлялась двумя плазмидами одновременно. Плазмида 1 содержала ген нуклеазы Cas9 и ген направляющей РНК со спейсером на ген cbh1. Плазмида 2 несла последовательность направляющей РНК со спейсером на ген niaD для селекции трансформантов.

После котрансформации из 8 колоний была выделена геномная ДНК для амплификации фрагментов генов cbh1 и niaD. У всех клонов в гене niaD наблюдалась мутация в предполагаемом сайте. Ген cbh1 был амплифицирован в 3 колониях из 8. Во всех вариантах амплификатов наблюдались мутации в заданной позиции.

Трансформанты были ферментированы в колбах на стандартной ферментационной среде с 4% микрокристаллической целлюлозы. Проведенные анализы культуральной жидкости показали отсутствие белка ЦБГI. Однако авицелазная активность у большинства клонов не уменьшилась, что вероятно связано с увеличением содержания ЦБГII.

Таким образом, при применении адаптированного метода CRISPR-Cas к редактированию генома гриба P. verruculosum был получен штамм P. verruculosum DniaDDcbh1, с одновременным нокаутом генов niaD и cbh 1, кодирующих нитратредуктазу и ЦБГI соответственно.

Работа поддержана грантом РФФИ №18-29-07070.

* * *

Гентические маркеры несовершенного остеогенеза у белорусских пациентов

Е.В. Кобец¹, П.М. Морозик¹, А.С. Почкайло², Э.В. Руденко²

¹Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, 220072, Минск, Беларусь;

²Белорусская медицинская академия последипломного образования (БелМАПО), 220013, Минск, Беларусь

Genetic markers of osteogenesis imperfecta in belarusian patients

¹K.V. Kobets¹, P.M. Marozik¹, A.S. Pachkaila², E.V. Rudenka²

Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus, 220072, Minsk, Belarus;

²Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education (BelMAPO), 220013, Minsk, Belarus

Несовершенный остеогенез (НО) — это редкое наследственное заболевание (1:10 000—20 000 человек) соединительной ткани, которое проявляется нарушением минерализации, искривлением и укорочением костей.

Показано, что изменение в последовательности кодирующей части генов COL1A1 и COL1A2 негативно сказывается на формировании четвертичной структуры коллагена, приводит к искажению структуры витков альфа-спиралей или укорочению его фибрилл, ухудшая прочность и последующую минерализацию в составе костной ткани, вследствие чего развивается НО.

Для определения патогенных мутаций генов COL1A1 и COL1A2 было проведено NGS 92 образцов пациентов с НО на кастомной панели.

Всего в белок-кодирующей последовательности генов коллагена COL1A1 и COL1A2 выявлено 34 мутации у 58 пациентов.

В последовательности гена COL1A1 выявлены: у 29 пациентов ранее описанные 16 мутаций (c.G4321C, c.3532-2T>C, c.G3505A, c.C3433T, c.C3421T, c.3162delT, c.C2644T, c.1920dupC, c.G1588A, c.1354-12 G>A, c.C1081T, c.G752T, c.750+1G>A, c.C613G, c.386delC, c.370-1G>A) и у 12 пациентов 9 ранее неописанных мутаций (c.G4123A, c.A4103G, c.C3982A, c.2550delA, c.2238delT, c.2114delA, c.G868C, c.G662A, c.G3653A).

В белок-кодирующей последовательности гена COL1A2 выявлены: у 8 пациентов 4 описанных (c.G1478T, c.G1892A, c.G2314A, c.C2687T) и у 9 пациентов 5 ранее неизвестных мутаций (c.1036-2A>G, c.G1856A, c.G2359A, c.G2387C, c.G2809T).

* * *

Оценка внутривидовой изменчивости гидробионтов по данным высокопроизводительного секвенирования ДНК из водной среды: промежуточные результаты эксперимента

М.А. Кольцова¹, С.В. Туранов^{2, 3}

¹Дальневосточный федеральный университет, 690922, Владивосток, Россия;

²ФГБУН «Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского» ДО РАН, 690041, Владивосток, Россия;

³ФГБОУ ВО «Дальрыбвтуз», 690087, Владивосток, Россия; e-mail: satinneck@gmail.com

Estimation of the intraspecific variability in aquatic organisms according to high-throughput DNA sequencing data: preliminary experimental results

M.A. Koltsova¹, S.V. Turanov^{2, 3}

¹Far Eastern Federal University, 690922, Vladivostok, Russia;

²A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, 690041, Vladivostok, Russia;

³Far Eastern State Technical Fisheries University, 690087, Vladivostok, Russia; e-mail: satinneck@gmail.com

ДНК из водной среды все чаще используется для мониторинга морских сообществ, имея в сравнении с традиционными методами ряд преимуществ, обеспечивающих снижение затрат и повышенную чувствительность. Метод перспективен для оценки внутривидовой изменчивости. Его также можно использовать для одновременного обнаружения множества таксонов. В данной работе с целью оценки внутривидовой изменчивости гидробионтов на основе данных высокопроизводительного секвенирования был поставлен эксперимент с привлечением ДНК из водной среды и проведено индивидуальное генотипирование гидробионтов с использованием участка митохондриального гена COI. Объекты исследования — три вида гидробионтов, собранных из двух точек зал. Петра Великого Японского моря: б. Восток (3 особи Hexagrammos octogrammus, 8 Pholidapus dybowskii, 16 Pandalus latirostris) и б. Витязь (4, 6 и 22 особи соответственно). Гидробионты были рассажены в соответствии с локальностью поимки в два отдельных аквариума объемом 150 л. Взята проба воды (900 мл). Затем выполнен сбор средовой ДНК от гидробионтов путем экспонирования их в отдельных аквариумах объемом 1,2 л. От каждого животного после усыпления брали ткань для генетического анализа с последующим выделением из нее тотальной ДНК. На ее основе проводили генотипирование образцов по фрагменту COI длиной 320 п.о. Последовательности вида H. octogrammus содержали 3 гаплотипа в трех изменчивых сайтах. Матрица последовательностей вида P. dybowskii содержала один изменчивый сайт с двумя гаплотипами. У представителей вида P. latirostris обнаружено два гаплотипа с одним изменчивым сайтом. Географическая компонента в распределении гаплотипов по выборкам присутствует у H. octogrammus и P. latirostris. На следующем этапе работы планируется выяснить, способен ли фрагмент COI длиной 320 п.о, давать адекватные оценки внутривидовой изменчивости, сопоставимые с данными более длинного стандартизированного участка 650 п.о.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ (MK-305.2019.4).

* * *

Молекулярно-генетический анализ размноженных in vitro клонов тополя белого (Populus alba L., 1753)

А.М. Кондратьева, Т.А. Гродецкая, Т.П. Федулова

ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лесной генетики, селекции и биотехнологии», 394087, Воронеж, Россия; e-mail: kondratyeva_anya@mail.ru

Molecular genetic analysis of in vitro propagated poplar clones (Populus alba l., 1753)

A.M. Kondratyeva, T.A. Grodetskaya, T.P. Fedulova

All-Russian Research Institute of Forest Genetics, Breeding and Biotechnology, 394087, Voronezh, Russia; e-mail: kondratyeva_anya@mail.ru

Выращивание растений in vitro имеет значительные преимущества перед традиционными методами и является перспективным для использования в лесовосстановлении. Тополь белый (Populus alba L., 1753) является многообещающим древесными растениями, так как характеризуется высоким регенерационным потенциалом. Объектом исследования являлись размноженные in vitro клоны тополя белого, произрастающие в Семилукском лесопитомнике ВНИИЛГИСбиотех. Анализ образцов был проведен по девяти микросателлитным локусам, на основании которого были составлены генетические формулы и паспорта исследованных образцов. У одного из образцов выявлены три аллеля с молекулярной массой от 165 до 220 пар нуклеотидов в локусе ORPM30, что может свидетельствовать о его триплоидной природе. Локусы PMGC2060 и WPMS5 у исследованных образцов характеризуются одним аллелем (140 и 310 пар нуклеотидов соответственно). Остальные изученные локусы показали наличие двух ПЦР-продуктов для каждого. Выявлено, что все исследованные образцы тополя белого характеризуются уникальными генотипами.

* * *

Изучение влияния состава раствора для агроинфильтрации на уровень Agrobacterium-опосредованной транзиторной экспрессии иммуноцитокина

К.М. Коноплина, Е.Н. Кособокова, А.А. Мальченкова, В.С. Косоруков

ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478, Москва, Россия; e-mail: k.konoplina@ronc.ru

Study on effect of agroinfiltration solution composition on the level of Agrobacterium-mediated transient expression of an immunocytokine

K.M. Konoplina, E.N. Kosobokova, A.A. Malchenkova, V.S. Kosorukov

N.N. Blokhin NMRCO, 115478, Moscow, Russia; e-mail: k.konoplina@ronc.ru

Транзиторная трансформация целых растений табака Nicotiana benthamiana с помощью Agrobacterium tumefaciens методом агроинъекции в последние годы приобрела большую популярность как способ получения сложных гликозилированных белков. Одним из способов повышения эффективности продукции целевого белка в растениях с использованием данного метода является оптимизация состава раствора для агроинфильтрации.

В настоящей работе изучали влияние некоторых химических добавок к среде для агроинфильтрации на продукцию в N. benthamiana потенциального терапевтического иммуноцитокина (ИЦ) на основе интерферона-α2b человека и антитела против опухолевого антигена HER2.

Агробактерии A. tumefaciens, трансформированные плазмидами тяжелой и легкой цепей ИЦ, а также плазмидой с геном белка p19 из вируса карликовой кустистости томатов для подавления посттранскрипционного сайленсинга трансгена, вводили методом агроинъекции в листья N. benthamiana. Влияние химических добавок к среде для агроинфильтрации: ацетосирингона, сурфактанта Pluronic F-68, липоевой кислоты, аскорбиновой кислоты, повидона, — на уровень продукции ИЦ исследовали методом статистического планирования эксперимента. Эффективность продукции ИЦ определяли методом ИФА.

Показано, что значимо повышали выход ИЦ ацетосирингон (600 мкМ) и сурфактант Pluronic F-68 (0,2%), тогда как липоевая кислота (0—5 мкМ) и повидон (0—0,5 г/л) не оказывали значимого влияния на выход в данных диапазонах концентраций, а аскорбиновая кислота в концентрации 25 — 50 мМ значимо снижала выход. При использовании полученного в результате работы состава раствора для агроинфильтрации выход ИЦ составил более 500 мкг/г, что является достаточным технологическим уровнем для практической продукции рекомбинантных белков в растениях.

Работа выполнялась в рамках программы исследований, запланированных в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (тема НИР: «Разработка технологий дизайна, получения и применения персонализированных противоопухолевых терапевтических вакцин», рег. №АААА-А18-118032290146-5).

* * *

Получение клеточной линии с инактивированным геном, кодирующим IP3R2-рецептор человека

Е.Е. Копылова, Е.А. Соколова, Н.В. Кабанова, О.А. Рогачевская, М.Ф. Быстрова

ФГБУН ФИЦ ПНЦБИ ИБК РАН, 142290, Пущино, Россия; e-mail: ikopylov76@gmail.com

Generation of the cell line with inactivated human IP3R2-receptor

E.E. Kopylova, E.A. Sokolova, N.V. Kabanova, O.A. Rogachevskay, M. F. Bystrova

Institute of Cell Biophisics of the Federal Research Center «Pushchino Scientific Center for Biological Research RAS», 142290, Pushchino, Russia; e-mail: ikopylov76@gmail.com

Для редактирования гена, кодирующего IP3R2-рецептор, вовлеченный в сигнальные каскады, использовалась система CRISPR/Cas9. В ходе работы была создана экспрессионная кассета, кодирующая элементы системы CRISPR/Cas9, для внесения двунитевых разрывов в локус IP3R2. Она конструировалась на основе вектора pGuide-it-tdTomato, кодирующего sgRNA под управлением U6 промотора, нуклеазу Cas9 и красный флуоресцентный белок tdTomato. Полученной конструкцией трансфецировались клетки линии HEK293, по красной флуоресценции отбирались отдельные клетки, из которых селектировались клеточные моноклоны. Для выявления мутаций в индивидуальных моноклонах был использован анализ, основанный на специфическом гидролизе in vitro амплифицированных фрагментов геномной ДНК, содержащих выбранный протоспейсер, комплексом Cas9-sgRNA. Из 42 проанализированных рекомбинантных клеточных моноклонов в 9 было обнаружено наличие биаллельных мутаций IP3R2. Для идентификации клеток со значащими биаллельными мутациями были секвенированы клонотеки фрагментов геномной ДНК, содержащих предположительный сайт мутаций. Секвенирование индивидуальных ДНК-клонов клонотек выявило многообразные индели, образованные в процессе репарации двухнитевых разрывов путем негомологической рекомбинации ДНК-концов. В результате работы мы получили три рекомбинантных клеточных моноклона с различными биаллельными мутациями, приводящими к смещению открытой рамки считывания IP3R2 на обоих аллелях и инактивации кодируемого им рецептора. Полученные моноклоны с инактивированным IP3R2-рецептором используются в физиологических экспериментах для выяснения его роли в регуляции уровня внутриклеточного кальция.

Работа поддержана грантом РНФ-18-14-00347.

* * *

Оптимизация качества воздуха закрытого помещения высшими растениями

Т.М. Косогова, М.С. Дзюба

ГОУ ВО ЛНР «Луганский государственный педагогический университет», 91011, Луганск; e-mail: inbotanlit87@list.ru

Optimization of indoor air quality by higher plants

T.M. Kosogova, M.S. Dzyuba

GOU VO LPR «Lugansk State Pedagogical University», 91011, Lugansk; e-mail: inbotanlit87@list.ru

Сегодня, когда мир борется с COVID-19, проблемы качества воздуха окружающей среды особенно актуальны. Микрофлора воздуха закрытых помещений отличается от микрофлоры атмосферного воздуха, она богата различными микроорганизмами, в том числе многими условно-патогенными и патогенными.

Известно, что со времени открытия фитонцидов Б. Токиным накоплен большой фактический материал об антимикробных и противовирусных веществах высших растений.

Изучая пути оптимизации качества воздуха закрытых помещений с помощью высших растений, выяснили, что исследуемые комнатно-оранжерейные растения (Chlorophytum comosum, Dracaena cinnabari, Pelargōnium hortorum) характеризуются как неприхотливые и относительно засухоустойчивые. Анатомическое строение листьев доказывает, что структура позволяет данным растениям адаптироваться к разнообразным условиям существования (трихомы, выросты-шипики, восковой налет, кутикула, «кранц-анатомия» листа...). Исследования показали, что среди изучаемых растений, наибольшей фитонцидной активностью обладают Chlorophytum comosum, летучие выделения которого на 58,0% ингибируют развитие микрофлоры воздуха, Dracaena cinnabari — на 50,0% и Pelargōnium hortorum — на 39,0%.

Качество воздуха исследуемого помещения согласно шкале А.И. Шафира (для летнего и зимнего режимов) характеризуется как «чистый» воздух, что указывает на необходимость постоянного действия факторов оздоровления воздушной среды.

* * *

Множественные формы оксидоредуктаз сои как молекулярные маркеры температурного стресса

В.А. Кузнецова¹, К.С. Голохваст^{1, 2}

¹Федеральный исследовательский центр «Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова», 190000, Санкт-Петербург, Россия;

²ФГБУН «Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий» РАН, 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, р.п. Краснообск, Россия; e-mail: kuzvika3385@yandex.ru

Multiple forms of soybean oxidoreductases as molecular markers of temperature stress

V.A. Kuznetsova¹, K.S. Golokhvast^{1, 2}

¹Federal Research Center All-Russian «Institute of Plant Genetic Resources named after N.I. Vavilov», 190000, St. Petersburg, Russia;

²FSBSI «Siberian Federal Scientific Center of Agrobiotechnology» of the Russian Academy of Sciences, 630501, Novosibirsk region, Novosibirsk region, working village Krasnoobsk, Russia; e-mail: kuzvika3385@yandex.ru

Последние годы в России производству сои уделяется большое внимание. Во многих регионах страны наблюдаются температурные условия в период вегетации, поэтому очень важно создавать новые сорта сои, обладающие устойчивостью к воздействию температурного фактора. Гипо- и гипертермия приводит к образованию активных форм кислорода (АФК), что способствует развитию окислительного стресса в растениях сои. Антиоксидантными ферментами, участвующими в регуляции АФК, являются оксидоредуктазы. Изменение структуры этого класса энзимов приводит к появлению новых множественных форм и, соответственно, новых признаков протекания адаптации к температурным воздействиям. В результате индукции стрессовых генов при акклиматизации сои могут появиться новые формы оксидоредуктаз, обладающие разной активностью, при этом происходит активная перестройка генома. В результате воздействия гипо- и гипертермии нами выявлены 18 форм пероксидаз, 12 форм каталаз, 21 форма супероксиддисмутаз и 19 форм полифенолоксидаз, что показывает способность оксидоредуктаз к высокому полиморфизму и свидетельствует об адаптивной реакции сои на температурный стресс. Полученный высокий полиморфизм можно использовать для создания новых продуктивных сортов сои, что позволит возделывать эту ценную культуру во многих регионах России.

* * *

Взаимосвязь относительного числа копий митохондриальной ДНК и аллельной нагрузки V617F в гене JAK2

Н.А. Кузуб¹, В.В. Мосейко¹, В.В. Смялковская^{1, 2}, А.К. Коляда¹

¹Лаборатория «Диаген», 08131, Софиевская Борщаговка, Киевская область, Украина;

²Киевский национальный университет им. Т. Шевченко, 03022, Киев, Украина; e-mail: nataliiakuzub@gmail.com

Relation between relative mitochondrial dna copy number and V617F allele load in the JAK2 gene

N.O. Kuzub¹, V.V. Moseyko¹, V.V. Smialkovska^{1, 2}, O.K. Koliada¹

¹Laboratory «Diagen», 08131, Sofiivska Borschagivka, Kyiv region, Ukraine;

²Taras Shevchenko National University of Kyiv, 03022, Kyiv, Ukraine; e-mail: nataliiakuzub@gmail.com

Возникновение соматической мутации V617F в гене JAK2 является основной причиной развития миелопролиферативных заболеваний. В свою очередь, высокая аллельная нагрузка этой мутации связана с возникновением осложнений у пациентов и худшим прогнозом лечения. Предыдущие исследования показали, что наличие V617F приводит одновременно к повышению уровня окислительного фосфорилирования и уменьшения количества митохондрий в клетках. Мы исследовали изменения относительного количества копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в цельной крови носителей мутации V617F.

В исследовании принимали участие 45 носителей мутации и 66 здоровых людей. Для определения аллельной нагрузки V617F был использован метод пиросеквенирования. Относительное число копий мтДНК оценивалось с помощью метода ПЦР в реальном времени.

Мы обнаружили, что носители мутации V617F имеют меньшее количество копий мтДНК в сравнении со здоровыми людьми (mean=11,8, median=8 и mean=12,8, median=12 соответственно, p=0,02). Также было показано наличие отрицательной корреляции между аллельной нагрузкой V617F и относительным числом копий мтДНК (p=0,001). Таким образом, относительное число копий мтДНК можно рассматривать в качестве потенциального маркера при диагностике миелопролиферативных заболеваний.

* * *

Полиморфизм гена EDN1 И резевные возможности сердечно-сосудистой системы

С.Н. Левицкий, Н.А. Бебякова, Е.Л. Курочкина, И.А. Шабалина, И.С. Радушин, Д.А. Вязникова

ФГБОУ ВО «Северный государственный медицинский университет (Архангельск)» Минздрава России, 163000, Архангельск, Россия; e-mail: sergeylevitski@yandex.ru

EDN1 gene polymorphism and cardiovascular resection capabilities

S.N. Levitsky, N.A. Bebyakova, E.L. Kurochkina, I.A. Shabalina, I.S. Radusin, D.A. Vyaznikova

Northern State Medical University (Arkhangelsk, Russia) Ministry of Health of the Russian Federation, 163000, Arkhangelsk, Russia; e-mail: sergeylevitski@yandex.ru

Одним из самых изученных полиморфизмов гена EDN1 является трансверсия G>T в 5665-м нуклеотиде, приводящая к замене Lys198Asn (rs5370). Имеются данные об ассоциации данного полиморфизма с уровнем вазоконстрикции и артериального давления, индексом массы тела у европейцев.

В результате молекулярно-генетического исследования были выявлены все аллели и генотипы изучаемого полиморфизма. Преобладающим генотипом явился генотип GG, а наиболее редким является генотип TT. Распределение генотипов соответствовало закону равновесия Харди—Вайнберга.

Было установлено, что наличие полиморфного генотипа Lys198Asn гена EDN1 в обследуемой популяции приводило к незначительному нарушению баланса вазоактивных эндотелиальных факторов в сторону увеличения концентрации EDN1. Однако наличие полиморфного генотипа Lys198Asn не оказывало существенного влияния на функционирование сердечно-сосудистой системы и ее адаптационных возможностей в популяции молодого населения Европейского Севера. При этом наличие аллеля Т приводило к увеличению количества обследуемых, у которых наблюдались напряжение работы сердечно-сосудистой системы и снижение ее функциональных резервов.

Можно предположить, что ключевым механизмом в аспекте влияния EDN1 на формирование предрасположенности к сердечно-сосудистым нарушениям является его взаимодействие с рецепторами, хотя эксперименты с блокадой EDN-рецепторов также показали противоречивые результаты.

* * *

Валидация видоспецифичных систем детекции фитопатогенов картофеля

А.А. Лукьянова^{1, 2}, П.В. Евсеев¹, К.А. Мирошников¹

¹ФГБУ «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, 119234, Москва, Россия;

²МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Россия; e-mail: a.al.lukianova@gmail.com

Validation of species-specific detection assays of potato phytopatogens

A.A. Lukianova¹, P.V. Evseev², K.A. Miroshnilov¹

¹Institute Shemyakin—Ovchinnikov Institute of bioorganic chemistry, Russian Academy of Sciences, 119234, Moscow, Russia;

²Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Russia; e-mail: a.al.lukianova@gmail.com

Pectobacteriaceae — семейство фитопатогенных бактерий, способных поражать широкий спектр хозяев. В частности, ряд представителей этой группы способны инфицировать клубни и сосудистую систему картофеля, являясь возбудителями мягкой гнили и черной ножки. Требуется разработка современных методов контроля этих болезней, которые вызывают существенные потери урожая. В частности, необходима возможность быстрой видоспецифичной детекции патогена как для оценки заражения партий семенного картофеля, так и для подбора методов профилактики распространения заражения, в частности, при использовании фаготерапии.

Цель данной работы — разработка нового метода детекции на основе ПЦР в реальном времени для идентификации видов Pectobacterium в соответствии с современной таксономией. Для этого был использован алгоритм поиска локальных гомологий, позволивший найти уникальные участки в геномах P. parmentieri, P. atrosepticum, P. brasiliense и P. versatile. Для выделенных уникальных участков диагностики на наборе из 109 штаммов для каждой тест-системы была доказана специфичность, возможность проводить детекцию непосредственно в растительных образцах, а также высокая эффективность (>90%) и чувствительность реакции (10²—10³ копий/мл).

* * *

Изучение влияния мутаций в гене, кодирующем S-белок SARS-CoV-2, на спектр MHC I Т-клеточных эпитопов у представителей Canis lupus familiaris

М.С. Лаврухин¹, А.М. Ляпина¹, С.С. Зайцев¹, В.А. Федорова¹

¹СарНИВИ-филиал ФГБНУ ФИЦВиМ, 410028, Саратов, Россия; e-mail: lyapina_anna@inbox.ru

Study of the influence of mutations in the gene encoding the SARS-CoV-2 s-protein on the spectrum of MHC class I T-cell epitopes in representatives of Canis lupus familiaris

M.S. Lavrukhin¹, A.M. Lyapina¹, S.S. Zaytsev¹, V.A. Feodorova¹

¹Federal Research Center for Virology and Microbiology, Branch in Saratov, 410028, Saratov, Russia

Цель данной работы — анализ влияния несинонимичных замен в нуклеотидной последовательности S-белка SARS-CoV-2 на спектр T-клеточных эпитопов, имеющих сродство к молекулам MHC I класса животных-компаньонов. Нами были проанализированы 9 аминокислотных последовательностей таргетного белка, несущих разное число мутаций, по сравнению с референтной последовательностью штамма hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 из базы данных GisAid (Асс. ID: EPI_ISL_402124). Для всех последовательностей с помощью биоинформатических подходов были предсказаны T-клеточные эпитопы с высоким (percentile rank ≤1,0) сродством к продуктам 3 аллелей генов MHC класса I вида Canis lupus familiaris (DLA-88), от 195 до 199 потенциальных эпитопа для каждого варианта белка. Нами установлено, что появление несинонимичных замен в выбранных штаммах практически не влияло ни на количество потенциальных иммунодоминантных эпитопов S-белка, ни на процент перекрытия исследуемых аллелей. В то же время было отмечено, что замены приводили к появлению новых уникальных эпитопов по сравнению с предсказанными для референтного штамма. Максимальное число новых пептидов коррелировало с максимальным числом несинонимичных замен в нуклеотидной последовательности: в последовательности с 4 заменами было определено 13 новых эпитопов, один из которых перекрывал все 3 исследуемые аллели. Нами показано, что мутации могут приводить к возникновению более иммуногенных вариантов спайк-белка и, соответственно, более эффективному иммунному ответу, элиминирующему вирус из макроорганизма.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №20-04-60349 «Вирусы».

* * *

In silico анализ некоторых SSR-маркеров специфичных по хромосоме 6 от вида хлопчатника G. Barbadense L.

А.Х. Макамов¹, Ш.С. Абдукаримов¹, Ш.У. Бобохужаев², М.Ф. Санамьян², З.Т. Буриев¹

¹Центр Геномики и биоинформатики АН РУз, 111215, Ташкентская область, Узбекистан;

²Национальный Университет Узбекистан им. М. Улугбек, 100174, Ташкент, Узбекистан; e-mail: amakamov@gmail.com

Ключевые слова: хлопчатник, in silico PCR, BLAST, маркер SSR, геном, ген, белок.

In silico analysis of some ssr-markers specific for chromosome 6 from cotton species G. Barbadense L.

A.Kh. Makamov¹, Sh.S. Abdukarimov¹, Sh.U. Bobokhuzhaev², M.F. Sanamyan², Z.T. Buriev¹

¹Center of Genomics and Bioinformatics of the Academy of Sciences the Republic of Uzbekistan, Uzbekistan, 111215, Tashkent region, Uzbekistan;

²National University of Uzbekistan named after M. Ulugbek, 100174, Tashkent, Uzbekistan; e-mail: amakamov@gmail.com

Описаны результаты in silico анализа маркера SSR TMB1538, который подтвердил наличие замещенной хромосомы 6 в моносомных растениях поколений F1 и BC1F1, полученных межвидовой гибридизацией (Mo34 x Pima3-79, Mo92 x Pima 3-79). Длина амплифицированного маркера TMB1538 составляет 198 пар основания. Для идентификации генов и белков во фланкирующей области этого маркера 50 000 нуклеотидов были добавлены с обеих сторон маркера TMB1538 с использованием программы UGENE 1.21.0. Всего в разделе поиска веб-приложения AUGUSTUS было помещено 100 198 нуклеотидных последовательностей и были идентифицированы приблизительные белки.

Полученные результаты идентифицировали 18 генов и 20 транскриптов в этой области. Семейство генов PUB, ответственных за синтез белка, содержащего U-бокс-домен, было идентифицировано в области из 1056 пар нуклеотидов. Эти гены положительно влияют на различные абиотические стрессы (засоление, засуха, жара и холод) хлопчатника. На 6-й хромосоме хлопчатника вида G. barbadense L. обнаружены 7 представителей этого семейства генов (от GbPUB39A до GbPUB45A) (H. Lu и соавт., 2020).

Кроме того, в 708 нуклеотидной паре был обнаружен белок, подобный At5g43190, F-бокс/келч-повтор. Этот белок участвует в росте и развитии растений во время вегетативных и репродуктивных процессов. Белок синтезируется семейством генов F-бокса. У хлопчатника эти гены обнаружены S. Zhang и соавт. (2019).

* * *

Разработка микроссателитных макеров для популяционного анализа fragilaria radians

А.М. Марченков, Н.А. Волокитина, А.А. Морозов

Лимнологический институт СО РАН, 664033, Иркутск, Россия; e-mail: marchenkov.am@gmail.com

Development of fragilaria radians-specific microsatellite markers for the population genetic analysis

A.M. Marchenkov, N.A. Volokitina, A.A. Morozov

Limnological Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 66403, Irkutsk, Russia; e-mail: marchenkov.am@gmail.com

Fragilaria radians является одним из доминирующих видов в составе фитопланктона оз. Байкал. В настоящее время популяционная структура вида F. radians в оз. Байкал не исследована. Ранее нами были получены данные о невозможности использовать маркерные гены 18S рРНК, rbcL и ITS для исследования популяции F. radians.

Цель работы — выбор и тестирование микросателлитных маркеров для возможного дальнейшего их использования в исследовании популяции F. radians обитающих в оз. Байкале.

Микросателлитные маркеры были выбраны с помощью QDD Pipeline (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24785154/). Из результатов анализа были удалены пары праймеров, способные садиться на более чем один геномный локус, а также пары, предсказанные из низкокачественных контигов. Окончательный набор состоял из 20 203 пар на 1930 локусов.

Праймеры выбирали на микросателлитные локусы имеющие повторы от 2 до 5 нуклеотидов, а длина локусов составляла от 450 до 1500 п.н. Таким образом, было выбрано 16 пар праймеров, из которых успешно амплифицировалось 9.

Нами были использованы четыре моноклональных культуры F. radians выделенных из трех котловин оз. Байкала (южной, средней и северной). Один из 9 протестированных оказался вариабельным и показал, что штамм, отобранный из северной котловины оз. Байкал, отличается от штаммов южной и средней котловин. Поскольку тестирование проводилось лишь только на четырех моноклонах и использовали только один вариабельный локус, то при масштабировании с большей выборкой и при увеличении количества локусов количество популяции может увеличиться.

* * *

Скрининг варианта с.3700_3704delGTAAA в гене BRCA1

Э.Т. Мингажева^{1, 2}, Э.Ф. Муллагалеева¹, Я.В. Валова^{1, 3}, Д.С. Прокофьева¹, А.Х. Нургалиева¹, Р.Р. Фаисханова⁴, Э.К. Хуснутдинова^{1, 2}

¹Башкирский государственный университет, кафедра генетики и фундаментальной медицины, 450076, Уфа, Россия;

²Институт биохимии и генетики — обособленное структурное подразделение ФГБУН «Уфимский федеральный исследовательский центр» РАН, 450054, Уфа, Россия;

³ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека», 450106, Уфа, Россия;

⁴ГБУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер», 450054, Уфа, Россия; e-mail: elvira.f91@mail.ru

Screening of the c.3700_3704delGTAAA variant in the BRCA1 gene

E.T. Mingazheva^{1, 2}, E.F. Mullagaleeva¹, Ya.V. Valova^{1, 3}, D.S. Prokofieva¹, A.Kh. Nurgaleeva¹, R.R. Faiskhanova⁴, E.K. Khusnutdinova^{1, 2}

¹Bashkir State University, Department of Genetics and Fundamental Medicine, 450076, Ufa, Russia;

²Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences, 450054, Ufa, Russia;

³Federal Institution of Science «Ufa Research Institute of Occupational Health and Human Ecology», 450106, Ufa, Russia

⁴State Autonomous Institution of Health Republican Clinical Oncology Center of the Ministry of Health of the Republic of Bashkortostan, 450054, Ufa, Russia; e-mail: elvira.f91@mail.ru

Рак яичников (РЯ) является одним из наиболее часто встречающихся и агрессивных гинекологических опухолей у женщин. Данная патология имеет многофакторный характер. Одним из важных факторов риска РЯ выступает наследственная предрасположенность. В первую очередь, развитие РЯ связывают с мутациями в высокопенетрантных генах BRCA1 и BRCA2.

Цель данной работы — поиск варианта с.3700_3704delGTAAA (p.Val1234GlnfsTer8) в гене BRCA1, ранее обнаруженный нами в результате таргетного секвенирования образцов ДНК больных наследственным РЯ. Материалом для исследования послужили образцы ДНК 264 больных РЯ и 332 здоровых индивидов. Поиск варианта проводили методом анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM).

В результате скрининга нами была обнаружена только одна носительница варианта с.3700_3704delGTAAA/BRCA1 в группе больных РЯ 1/264 (0,4%). По этнической принадлежности пациентка русская. У данной женщины в пременопаузе диагностирована билатеральная серозная аденокарцинома высокой степени злокачественности.

Таким образом, наши данные указывают на низкую частоту встречаемости варианта с.3700_3704delGTAAA/ BRCA1 среди больных РЯ из Республики Башкортостан.

Исследование поддержано программой развития биоресурсных коллекций ФАНО. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №182909129 «Спектр и частота патогенных мутаций в генах, ассоциированных с наследственным раком яичников у женщин разного этнического происхождения»; №20-34-90003 «Анализ новых генов-кандидатов развития рака яичников у женщин из Республики Башкортостан. Аспиранты».

* * *

Разные уровни экспрессии генов PR-белков под влиянием биотических факторов в листьях винограда

А.Е. Мишко, М.А. Сундырева, Е.О. Луцкий

ФГБНУ Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия, 350901, Краснодар, Россия; e-mail: mishko-alisa@mail.ru

Different levels of PR-protein genes expression in grape leaves caused by biotic factors

A.E. Mishko, M.A. Sundyreva, E.O. Lutskiy

North Caucasian Federal Scientific Center of Horticulture, Viticulture, Wine-making, 350901, Krasnodar, Russia; e-mail: mishko-alisa@mail.ru

Синтез PR-белков является одним из механизмов системной приобретенной устойчивости растений, направленной на подавление негативного воздействия фитопатогенов. У винограда выделяют несколько семейств PR-белков, отвечающих за различные пути сдерживания заболеваний. В настоящей работе были исследованы уровни экспрессии генов трех семейств PR-белков — PR2 (бета-1,3-глюканазы), PR3 (хитиназы), PR10 (подобные рибонуклеазам) — в листьях двух сортов винограда в ответ на биотический стресс. В качестве стрессоров использовали споры патогенного гриба Plasmopara viticola (милдью) и клеточную суспензию естественного симбионта винограда Saccharomyces cerevisiae (винные дрожжи). Были выбраны высокоустойчивый к милдью сорт «Восторг» и восприимчивый сорт «Мускат белый». Полученные результаты показали, что в целом экспрессия исследуемых генов PR-белков была выше у высокоустойчивого сорта «Восторг» по сравнению с сортом «Мускат белый». Максимальные значения были выявлены у «Восторга» на 2-е сутки после инфицирования патогеном. Экспрессия генов белков семейства PR10 у «Муската белого» снижалась при заражении. После обработки листьев симбионтами S. cerevisiae уровень экспрессии генов белков PR2 и PR3 увеличился относительно контроля на 2-е сутки у двух сортов винограда, а показатели синтеза PR10-белков существенно не изменились. Таким образом, в листьях высокоустойчивого сорта «Восторг» наблюдали более интенсивную активацию иммунных процессов при воздействии биотических стрессоров, в отличие от восприимчивого сорта «Мускат белый».

* * *

PR-9 белки pinus sylvestris: структурно-функциональный анализ

Л.В. Можаровская

Институт леса НАН Беларуси, 246050, Гомель, Беларусь; e-mail: milamozh@yandex.ru

Structural and functional analysis of pinus sylvestris PR-9 proteins

L.V. Mozharovskaya

Forest Institute of the NAS of Belarus, 246050, Gomel, Belarus; e-mail: milamozh@yandex.ru

Среди белков, ассоциированных с патогенезом, к PR-9 относятся пероксидазы III класса. Целью исследования являлось изучение особенностей структурно-функциональной организации PR-9 белков P. sylvestris, в том числе, в присутствии инвазии Fusarium spp. В условиях опыта (при сохранении контроля) проводилось заражение Fusarium sp. проростков P. sylvestris. Ткани корня и гипокотиля использовали для получения препаратов мРНК, NGS транскриптомов выполняли на базе Ion Torrent.

Для транслируемого наиболее представленного PR-9 транскрипта контрольного варианта в NCBI максимальный уровень гомологии: 79,6% с PRX09 Ginkgo biloba и 77,6% с PX18 Picea abies. Изучена структурная организация белка: наличие 8 консервативных Cys-остатков, Pro-мотив PXPX представлен P¹⁴⁷-A-P-T¹⁵⁰. 3D-модель: 13 α-спиралей, формирующих дистальный (α1-α5) и проксимальный (α6,7, α10-α13) Ca²⁺-связывающие домены и 2 антипараллельных β-цепи (Β-домен с α8 и α9). Предсказаны Ca²⁺- и гем-связывающие сайты. Отмечены изменения в гидрофобности в субстрат-связывающих областях, что может влиять на сродство к субстрату.

В условиях инфицирования PR-9 локусы отличались по структурной организации от описанного выше транскрипта. Наиболее представленный транскрипт гомологичен на 85% с PX3 P. abies. 3D модель: 13 α-спиралей и 2 β-цепи, но вместо дистального Ca^2+- — Na⁺-связывающий домен. Присутствие сайтов связывания Ca²⁺ и Na⁺, вероятно, регулирует каталитическую активность фермента. Сайт связывания гема в качестве субстрата принимает IAA, для которой описано участие в защите растений от патогенов.

Исследование выполнено при финансовой поддержке БРФФИ (проект №Б20М-015).

* * *

Сложно детектируемая бактериальная контаминация в культурах Диатомей

А.А. Морозов¹, Ю.П. Галачьянц¹, А.М. Марченков¹, Ю.Р. Захарова¹

¹ФГБУН «Лимнологический институт» СО РАН, 664033, Иркутск, Россия; e-mail: morozov@lin.irk.ru

Elusive bacterial contamination in Diatom cultures

A.A. Morozov¹, Yu.P. Galachyants¹, A.M. Marchenkov¹, Yu.R. Zakharova¹

Limnological Institute Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Irkutsk, Russia; e-mail: morozov@lin.irk.ru

Ранее мы опубликовали геномную сборку для диатомеи Fragilaria radians, собранную из библиотек с разных секвенаторов (454 Roche и Illumina). Контроль чистоты использованных аксеничных культур проводился эпифлуоресцентной микроскопией с окраской DAPI. Тем не менее анализ сборки F. radians Vancaester и соавт. показал, что значительная доля последовательностей в опубликованной сборке принадлежит Sphingomonas sp. и, скорее всего, свидетельствует о контаминации культуры этой бактерией.

Анализ исходных данных позволил выделить контаминированные библиотеки, а также обнаружить контаминацию метабаркодинговым ампликоном в одной из библиотек, не содержащих геномной ДНК Sphingomonas. Был проведен метабаркодинг имеющейся в лаборатории живой культуры и показано, что она тоже контаминирована.

Если рассмотреть результаты хронологически, то из одной и той же культуры сначала были получены контаминированные библиотеки, затем неконтаминированные, а затем контаминация была обнаружена снова. В течение всего этого времени эпифлуоресцентная микроскопия не обнаруживала присутствия бактерий. Культура не подвергалась дополнительной аксенизации, что объяснило бы вымирание контаминанта; кроме того, неочевидно, почему в гипотетической вторичной контаминации участвует та же бактерия, что и в первичной. По нашей рабочей гипотезе, большую часть времени бактерии существуют в культуре в настолько низкой численности, что это не детектируется микроскопическими методами. При определенной комбинации условий бактерии размножаются до детектируемой молекулярно-генетическими методами (но все еще очень низкой) численности.

* * *

Половые различия в составе микробиоты кишечника человека на уровне типов

В.В. Мосейко^{1, 2}, А.К. Коляда^{1, 2}, Н.А. Кузуб^{1, 2}, М.С. Романенко^{1, 3}, А.М. Вайсерман¹

¹ГУ «Институт геронтологии им. Д.Ф. Чеботарева НАМН Украины», Киев, Украина;

²Генетическая лаборатория, ООО «Diagen», Киев, Украина;

³Национальная медицинская академия последипломного образования им. П.Л. Шупика, Киев, Украина; e-mail: moseykovlad@gmail.com

Sex differences in the phylum-level human gut microbiota composition

V.V. Moseiko^{1, 2}, O.K. Kolyada^{1, 2}, N.O. Kuzub^{1, 2}, M.S. Romanenko^{1, 3}, O.M. Vaiserman¹

¹D.F. Chebotarev State Institute of Gerontology, Kyiv, Ukraine;

²Genetic Laboratory, Ltd. «Diagen», Kyiv, Ukraine;

³P.L. Shupyk National Medical Academy of Postgraduate Education, Kyiv, Ukraine; e-mail: moseykovlad@gmail.com

Исследовались половые различия в составе микробиоты кишечника у взрослого населения Украины. Образцы кала были взяты у участников исследования в период с 17 марта 2017 г. по 9 декабря 2020 г. у 2301 человека (1515 женщин; 786 мужчин).

Каждый из участников исследования подписал форму информированного согласия перед включением в исследование. Критериями исключения из протокола исследования были: а) проблемы со здоровьем, включая текущие инфекционные заболевания или рак, когнитивные нарушения, диабет 1-го типа или неадекватно контролируемый диабет 2-го типа; б) текущее потребление пребиотиков, пробиотиков, антибиотиков или иммунодепрессантов; c) отказ дать информированное согласие.

Было обнаружено, что относительная численность основных бактериальных типов, таких как Actinobacteria, Bacteroidetes и Firmicutes, а также соотношение F/B значительно различаются между полами. Интересно, что эта половая разница была даже более выраженной в старшей возрастной группе (50+) по сравнению с молодыми и взрослыми. Это неожиданный результат, поскольку предполагается, что половые различия зависят от гормонального статуса, особенно у женщин.

* * *

Множественные формы малатдегидрогеназ семян Glycine max

И.Б. Огурцов, Л.Е. Иваченко

ФГБОУ ВО «Благовещенский государственный педагогический университет», 675000, Благовещенск, Россия; e-mail: ilya_borisovich.93@mail.ru

Multiple forms of malate dehydrogenases of cultivated Soybean seeds

I.B. Ogurtsov, L.E. Ivachenko¹

Blagoveshchensk State Pedagogical University, 675000, Blagoveshchensk, Russia; e-mail: ilya_borisovich.93@mail.ru

Геном и транскриптом растений относительно стабильны, тогда как протеом постоянно меняется, реагируя на воздействия экзогенных и эндогенных факторов. Идентификация белков, кодируемых генами, является важнейшим направлением современной функциональной геномики растений. Белки являются одним из первых продуктов экспрессии гена. Белками, отвечающими требованиям генетических маркеров, являются ферменты, которые присутствуют в клетках в виде множественных форм. Именно они создают пластичность биохимических процессов организма к условиям среды.

Важная роль принадлежит малатдегидрогеназе, функционирующей на последней стадии цикла Кребса.

ФГНБУ ФНЦ ВНИИ сои (Благовещенск) создана большая коллекция сортов сои. При выращивании коллекции семян новых сортов сои (МК-100, Нега-1, Грация, Персона) (Glycine max (L.) Merrill) в оптимальных условиях, выявлена высокая гетерогенность малатдегидрогеназы: от 5 форм (Персона) до 8 форм (Грация).

Выращивание в условиях водного стресса, вызванного неоднократным затоплением почвы на относительно продолжительное время в течение вегетации, привело к снижению количества множественных форм (1—3 формы), что свидетельствует о снижении энергетического обмена.

Таким образом, изучение множественных форм ферментов, в том числе малатдегидрогеназ открывает новые перспективы для дальнейшего исследования генетических и молекулярных основ устойчивости растений к стрессу.

* * *

Генетический полиморфизм и дифференциация ящериц комплекса Darevskia raddei

Д.О. Одегов^{1, 2}, В.И. Корчагин¹, И.А. Мартиросян¹

¹ФБГУН «Институт биологии гена» РАН, 119334, Москва, Россия;

²ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева», 127550, Москва, Россия; e-mail: odegov.dima@list.ru

Genetic polymorphism and differentiation of Darevskia raddei lizard complex

D.O. Odegov^{1, 2}, V.I. Korchagin¹, I.A. Martirosyan¹

¹Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences, 119334, Moscow, Russia;

²Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Russian State Agrarian University — Moscow Timiryazev Agricultural Academy», 127550, Moscow, Russia; e-mail: odegov.dima@list.ru

Комплекс Darevskia raddei распространен в Армении, Азербайджане, Грузии, Турции и Иране. D. raddei характеризуется значительным разнообразием морфологических и цитологических признаков, а также условиями обитания. Гибридизация D. raddei («материнский» вид) с D. valentini привела к образованию 4 партеновидов. В связи со значительным разнообразием комплекса, обсуждается вопрос таксономического статуса подвида D. raddei nairensis, обитающего на территории Армении. В работе проведены анализ и оценка генетического полиморфизма 5 популяций D. rad. nairensis и 6 популяций D. rad. raddei из Армении. Методом фрагментного анализа проанализировано 104 особи по 11 микросателлитным локусам. В зависимости от локуса было выявлено 7—45 аллелей, формирующих по каждому локусу 10—67 генотипов. Популяции комплекса D. raddei отличаются по количеству и частоте встречаемости единичных аллелей для каждого локуса, а также по частоте выявленных генотипов. Внутрипопуляционный уровень аллельного разнообразия и ожидаемой гетерозиготности варьирует незначительно. D. rad. raddei не имеет строгой популяционной дифференциации, в то время как для D. rad. nairensis характерна выраженная популяционная структура. Неожиданным результатом является кластеризация особей D. rad. raddei из популяции Гош с D. rad. nairensis. Изучение полиморфизма комплекса raddei позволит определить статус D. rad. nairensis, объяснить природу образования 4 партеновидов при одинаковой схеме гибридизации родительских видов.

Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ №19-14-00083.

* * *

Генотипирование NAT2 у больных туберкулезом в Восточной Сибири

Е.А. Орлова, С.Н. Жданова, О.Б. Огарков

¹ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», 664003, Иркутск, Россия; e-mail: elizaveta.a.orlova@gmail.com

NAT2 genotyping in patients with tuberculosis in Eastern Siberia

E.A. Orlova, S.N. Zhdanova, O.B. Ogarkov

Scientific Institution Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems, 664003, Irkutsk, Russia; e-mail: elizaveta.a.orlova@gmail.com

NAT2 ацетилирует изониазид — препарат первого ряда против туберкулеза (ТБ). Полиморфизм гена NAT2 влияет на скорость инактивации препарата. Для успешной терапии целесообразно определять генотип пациента (быстрый или медленный ацетилятор). С целью изучить распределение генотипов и типов ацетилирования среди больных (32 человека) и здоровых (26 человек) из Восточной Сибири, мы определили нуклеотидную последовательность гена NAT2 секвенированием по Сэнгеру. Частоты аллелей полиморфизмов G191A, T341C, A803G и G857A соответствуют глобальному распределению, а аллелей T (0,28), C (0,51), G (0,66) полиморфизмов C282T, C481T и G590A ниже, чем глобально-распространенные (0,33, 0,59 и 0,72 соответственно), однако различия не достигают статистической значимости из-за малого объема выборки. Наблюдаемые частоты аллелей 282T и 481C наиболее близки к их частотам в Северной Швеции (0,28 и 0,53), а аллеля 590G — к распределению среди азиатов (0,67). Необходимо генотипирование NAT2 в выборке большего объема, чтобы подтвердить обнаруженные для населения Восточной Сибири закономерности. Сравнение частот аллелей и генотипов между контрольной и ТБ-группами не выявило различий, однако больные ТБ значимо чаще, чем здоровые (χ²>4,2, p<0,05), имеют гетерозиготные варианты 282C/T (53% против 23%) и 590G/A (45% против 12%). С помощью веб-сервера NAT2PRED по полученным комбинациям SNP мы определили фенотип ацетилирования пациентов: большинство оказались медленными ацетиляторами (65% — контроль, 72% — ТБ), быстрый тип встречался в 8 и 3% случаев соответственно. Представленный способ определения фенотипа ацетилирования путем генотипирования NAT2 можно рекомендовать для введения в практику противотуберкулезных диспансеров для персонифицированного подхода в лечении пациентов с ТБ изониазидом.

* * *

Секвенирование митохондриального генома фитопатогенного гриба phoma sp.1

С.В. Пантелеев, Л.В. Можаровская, О.Ю. Баранов

ГНУ «Институт леса НАН Беларуси», 246001, Гомель, Беларусь, e-mail: forinstnanb@gmail.com

Sequencing of the mitochondrial genome of the phytopathogenic fungus phoma sp.1

S.V. Panteleev, L.V. Mozharovskaya, O.Yu. Baranov

Forest Institute of NAS of Belarus, 246001, Gomel, Belarus, e-mail: forinstnanb@gmail.com

Фома-подобные грибы являются хозяйственно значимыми патогенами и возбудителями фомоза широкого спектра сельскохозяйственных и лесных растений.

Геномные исследования видов рода Phoma ведутся в Китае (Институт микробиологии Китайской академии наук — Phoma sp. XZ068), Японии (RIKEN Center for Life Science Technologies — Phoma herbarum strain JCM 15942) и Австралии (Университет Кертин — Phoma sp. RAV-16-625 и Phoma betae), однако к настоящему времени результаты аннотации их геномов не завершены.

Объектами данного исследования являлись чистые культуры фитопатогенного гриба Phoma sp.1. (NCBI: KM387394.1), изолированные в 2014 г. с посадочного материала ели обыкновенной с признаками фомоза.

Секвенирование трех мтДНК-обогащенных библиотек Phoma sp.1 осуществлялось на базе геномного секвенатора Ion PGM Torrent с использованием чипов Ion 314v2 и набора реагентов Ion PGM Sequensing 200 Kit v2. Метрика качества данных, получаемых в автоматическом режиме при помощи программного обеспечения Ion Torrent Suite показала, что для трех ДНК-библиотек получено 340 275, 305 726 и 182 253 ассемблированных прочтений («ридов») с показателем качества Q>20 (вероятность ошибки секвенирования не более 1%).

Первичная сборка данных секвенирования была выполнена с использованием программного пакета Lasergene (DNASTAR, Израиль) и протокола de novo. По результатам сборки была получена закольцованная последовательность («контиг») размером порядка 31916 н.о., характеризующаяся высоким (225,3) усредненным уровнем прочтения. Сравнительный анализ полученного контига с депозитами NCBI GenBank показал, что он относится к митохондриальной ДНК.

* * *

Оптимизация филогенетического анализа на примере кластеризации нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1

М.В. Питерский, О.А. Ходаков

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора; 620030, Екатеринбург, Россия; e-mail: virus@eniivi.ru

Optimization of phylogenetic analysis on the example of clustering of HIV-1 nucleotide sequences

M.V. Piterskiy, O.A. Khodakov

ERIVI FBRI SRC VB «Vector» Rospotrebnadzor, 620030, Yekaterinburg, Russia; e-mail: virus@eniivi.ru

В настоящее время для проведения филогенетического анализа используют различные алгоритмы кластеризации. Однако эти алгоритмы недостаточно универсальны. При анализе некоторых наборов данных необходимо специально подбирать метод, наиболее адекватно способный сгруппировать данные для построения правдоподобного филогенетического дерева. Это особенно важно при изучении вирусов, геном которых имеет высокую мутационную и рекомбинационную изменчивость, например, геном вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Мы проанализировали 239 нуклеотидных последовательностей участка гена pol ВИЧ-1, кодирующего ферменты жизненного цикла вируса (обратная транскриптаза, протеаза), выделенных от пациентов Уральского федерального округа (УФО). На первом этапе мы провели типирование штаммов с использованием базы данных Стэндфордского университета (https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-mutations/). Далее для них был проведен филогенетический анализ с использованием всех доступных нам методов кластеризации. После этого было оценено количество ошибок для всех методов кластеризации относительно данных типирования. Затем, для последовательностей с субтипами А и B, взятых из узлов с наибольшей поддержкой bootstrap, выделенных в течение одного года, в одном городе, с помощью инструмента BLAST (NCBI) были найдены родственные последовательности и проведен новый филогенетический анализ с помощью метода максимального правдоподобия, совершившего наименьшее количество ошибок относительно данных типирования. Основываясь на генетических дистанциях, временных и географических критериях, положениях штаммов на филогенетическом дереве, было установлено, что некоторые штаммы, циркулировавшие на территории УФО, были занесены в Узбекистан.

* * *

Элементы Hedgehog-сигналинга в постларвальном развитии и регенерации аннелиды Pygospio elegans (Spionidae, Annelida)

С.Е. Платова¹, В.В. Старунов^{2, 3}, Е.Л. Новикова¹

¹Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра эмбриологии, Санкт-Петербург, Россия;

²Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра зоологии беспозвоночных, Санкт-Петербург, Россия;

³Зоологический институт РАН, лаборатория эволюционной морфологии Санкт-Петербург, Россия

Elements of Hedgehog-signaling in postlarval development and regeneration of annelid Pygospio elegans (Spionidae, Annelida).

S.E. Platova¹, V.V. Starunov^{2, 3}, E.L. Novikova¹

¹St. Petersburg State University, Department of Embryology, Saint Petersburg , Russia;

²St. Petersburg State University, Department of Invertebrate Zoology, Saint Petersburg, Russia;

³Institute of Zoology RAS, laboratory of evolutionary morphology, Saint Petersburg, Russia

Pygospio elegans — это небольшая, гетеромно сегментированная полихета из семейства Spionidae, обладающая прекрасными регенерационными потенциями. В рамках изучения молекулярных механизмов, контролирующих восстановительные процессы P. elegans, мы обратили внимание на консервный путь сигналинга Hedgehog — важнейший компонент межклеточной коммуникации животных. Роль этого сигнального пути в развитии аннелид является объектом изучения сравнительно недолго. Изучение паттерна экспрессии генов компонентов Hedgehog-сигналинга может дать представление об их эволюции и позволит делать предположения об их функциях в процессах роста и регенерации у аннелид.

В ходе нашей работы нам удалось выявить экспрессию генов Pel-hh и Pel-ptc в ассоциации с тканями эктодермальной части кишки и нервной системы, а также в задней зоне роста и при закладке сегментов в ходе передней регенерации. Выявленная динамика экспрессии согласуется с уже имеющими данными о работе этого сигнального пути в процессе развития животных.

Исследование поддержано бюджетной программой АААА-А19-119020690076-7.

* * *

Генетический контроль устойчивости бактерий к летучим органическим соединениям

В.А. Плюта¹, О.А. Кокшарова², А.А. Попова¹, Д.А. Падий³, Д.Е. Сидорова¹, И.А. Хмель¹

¹ФГБУ НИЦ «Курчатовский институт» — ИМГ, 123182, Москва, Россия;

²НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, 119992, Москва, Россия;

³ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», 125047, Москва, Россия

Genetic control of bacterial resistance to volatile organic compounds

V.A. Plyuta¹, O.A. Koksharova², A.A. Popova¹, D.A. Pady³, D.E. Sidorova¹, I.A. Khmel¹

¹NRC «Kurchatov Institute» — IMG, 123182, Moscow, Russia;

²A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology MSU, 119992, Moscow, Russia;

³D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, 125047, Moscow, Russia

Летучие органические соединения (ЛОС), выделяемые микроорганизмами, играют важную роль в жизнедеятельности организмов, включая их межвидовое взаимодействие.

Некоторые ЛОС почвенных бактерий, в том числе кетоны, способны оказывать ингибирующее действие на цианобактерии. Для исследования механизмов действия кетона 2-нонанона на цианобактерии Synechococcus elongatus PCC 7942 с помощью транспозонного мутагенеза были получены мутанты, устойчивых к 2-нонанону. В полученных мутантных штаммах S. elongatus были идентифицированы поврежденные гены, которые кодируют белки, участвующие в биогенезе и функционировании клеточной стенки цианобактерий (Synpcc7942_1362, Synpcc7942_0351, Synpcc7942_0732) и белок, участвующий в стрессовой реакции на уровне рестрикции-модификации ДНК (Synpcc7942_0726).

Показано, что гены, ответственные за различные системы репарации ДНК: SOS-репарацию (recA, lexA), эксцизионную репарацию (uvrA, uvrB) и репарацию окислительных повреждений (mutS, mutY и mutT), — не играют существенной роли в регуляции устойчивости клеток к действию исследуемых ЛОС с разной химической структурой.

Работа частично финансировалась грантами РФФИ №18-34-00396-мол_а, 18-04-00375-а и 19-04-00495-а.

* * *

Алгоритм подбора видоспецифических праймеров для ПЦР-диагностики бактериальных патогенов картофеля

П.М. Рассказова^{1, 2}, П.В. Евсеев², К.А. Мирошников²

¹Московский физико-технический институт, Долгопрудный, 141701, Москва, Россия;

²Институт биоогранической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, 117997, Москва, Россия; e-mail: rasskazova.pm@phystech.edu

Algorithm for the selection of species-specific primers for PCR diagnostics of bacterial pathogens of potatoes

P.M. Rasskazova^{1, 2}, P.V. Evseev², K.A. Miroshnikov²

¹Moscow Institute of Physics and Technology, Dolgoprudny, 141701, Moscow, Russia;

²Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, 117997, Moscow, Russia; e-mail: rasskazova.pm@phystech.edu

Видоспецифическая диагностика, бактериофаги, Pectobaceriaceae. Картофель (Solanum tuberosum) — сельскохозяйственная культура, имеющая большое значение для людей по всему миру. К сожалению, большая часть урожая страдает от инфекций, вызванных бактериями семейства Pectobaceriaceae.

Чтобы избежать больших потерь, плоды можно обрабатывать фаговыми препаратами. Они нетоксичные, обладают высокой эффективностью действия. Для диагностики используется метод ПЦР, для которого необходимо подобрать видоспецефические праймеры.

Для подбора этих праймеров ранее был предложен биоинформатический алгоритм из 3 этапов, позволяющий находить видоспецифические последовательности. Задачей настоящей работы стала его автоматизация.

1-й этап — подготовительный: сбор геномов, создание баз данных, нарезка целевого генома на короткие фрагменты. Для разрезания генома мы использовали скрип, написанный на языке Python.

2-й этап — поиск: проводится выравнивание целевого генома по базам данных, для того чтобы найти последовательности, общие для вида.

3-й этап — анализ: отображение набора последовательностей, оставшихся после второго этапа, в целевом геноме, выбираются отрезки для создания праймеров ПЦР.

Нами был разработан пайплайн для командной строки Linux, автоматизирующий этапы 1 и 2. С помощью него были найдены видоспецифические последовательности фитопатогена Pectobacterium parmentieri. Этап 3, сделанный в биоинформатической программе Geneious, и предварительные эксперименты показывают возможность использования найденных последовательностей для дискриминационной ПЦР-диагностики этого фитопатогена.

* * *

АКТГ(4-7)PGP (семакс) как нейропротектор клеток мозга при церебральной ишемии в период терапевтического окна: фармакотранскриптомный подход

Ю.А. Ремизова^{1, 2}, И.Б. Филиппенков¹, В.В. Ставчанский¹, А.Е. Денисова², Л.В. Валиева¹, Л.В. Губский², Н.Ф. Мясоедов¹, С.А. Лимборская¹, Л.В. Дергунова¹

¹ФГБУ «Институт молекулярной генетики» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», 123182, Москва, Россия;

²ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, 117997, Москва, Россия; e-mail: utoshkautoshka@gmail.com

ACTH(4-7)PGP (semax) as a neuroprotector of brain cells in cerebral ischemia during the therapeutic window: a pharmacotranscriptomic approach

Yu.A. Remizova^{1, 2}, I.B. Filippenkov¹, V.V. Stavchansky¹, A.E. Denisova², L.V. Valieva¹, L.V. Gubsky², N.F. Myasoedov¹, S.A. Limborska¹, L.V. Dergunova¹

¹Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», 123182, Moscow, Russia;

²Pirogov Russian National Research Medical University (RNRMU), 117997, Moscow, Russia; e-mail: utoshkautoshka@gmail.com

Ишемический инсульт является частой причиной смерти в развитых странах. Он обусловлен локальным снижением кровотока, вызванным тромбом или эмболом. Особое значение имеет изучение генетических систем, определяющих механизмы формирования и поддержания терапевтического окна — временно́го промежутка в 3—6 ч от момента окклюзии, в течение которого можно оказать наиболее эффективное лечение. В настоящем исследовании под контролем магнитно-резонансной томографии и с помощью полногеномного секвенирования РНК (RNA-Seq) были выявлены дифференциально экспрессированные гены (ДЭГ) в условиях ишемии и под действием пептида АКТГ(4-7)PGP (семакс), обладающего нейропротективными свойствами. Так, в условиях модели tMCAO через 4,5 ч после окклюзии (90 мин) правой средней мозговой артерии у крыс в образцах дорсовентральной области лобной коры было зафиксировано изменение экспрессии 1281 ДЭГ (>1,5 раза, padj<0,05) относительно ложнооперированных животных. При этом большинство генов повысили экспрессию при ишемии. Семакс (100 мкг/кг) через 4,5 ч после tMCAO модулировал активность 131 ДЭГ, 92 из которых (RT1-Ba, RT1-Db1, Cd74, C3, Map3k1, Gpsm1, Cacng5 и др.) были активированы действием ишемии. Интересно, что семакс в значительной степени снижал уровень мРНК данных генов, противодействуя их активации после tMCAO. Таким образом, в период терапевтического окна нейропротективный эффект семакса может быть связан с коррекцией профиля экспрессии генов в лобной коре, измененного воздействием ишемического повреждения.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ №19-14-00268.

* * *

Апробация молекулярных маркеров генов, отвечающих за реакцию на холодовой стресс у тополя

С.Г. Ржевский, Т.А. Гродецкая

ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лесной генетики, селекции и биотехнологии», Воронеж, Россия; e-mail: ilgis@lesgen.vrn.ru

Approbation of molecular markers of genes response to cold stress in poplars

S.G. Rzhevsky, T.A. Grodetskaya

All-Russian Research Institute of Forest Genetics, Breeding and Biotechnology, Voronezh, Russia; e-mail: ilgis@lesgen.vrn.ru

В данной работе представлено исследование реакции на охлаждение, проведенное на 8 генотипах тополя, из различных морфолого-систематических групп. В ходе исследования осуществлено искусственное охлаждение распустившихся веток (до температуры +4 °C, в течение 6 ч). Далее из листьев выделялась РНК и было проведено измерение экспрессии генов CBL1 и CBL2, зарекомендовавших себя в качестве маркеров абиотического стресса.

Электрофорез продемонстрировал наличие специфических продуктов амплификации только у 4 образцов: видов тополь волосистоплодный, тополь Максимовича, тополь китайский (из секции бальзамические тополя) и сорта тополь Ивантеевский (гибрид тополя душистого из данной секции). Гибриды, производные от тополя белого и тополя черного, с данными праймерами дали неспецифические продукты. Таким образом, подобранные праймеры являются универсальными для анализа генов CBL1 и CBL2 у представителей секции бальзамических тополей и некоторых их гибридов.

Вследствие охлаждения выявлено повышение экспрессии у опытных экземпляров тополя Максимовича и снижение у тополя волосистоплодного. Различная реакция генов семейства CBL может быть обусловлена генотипическими особенностями представителей. Для выявления общих тенденций реагирования рассматриваемых генов на стрессовое воздействие необходимо дальнейшее исследование, включающее определение изменения экспрессии в динамике.

* * *

Исследование экспрессии и локализации белка АРР в нейронах рака astacus leptodactylus при аксотомии

С.В. Родькин, В.А. Дзреян, А.М. Хайтин

Академия биологии и биотехнологии, Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия; e-mail: rodkin_stas@mail.ru

The study of APP protein expression and localization in astacus leptodactylus crayfish neurons after axotomy

S.V. Rodkin, V.A. Dzreyan, A.M. Khaitin

Academy of Biology and Biotechnology, Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russia; e-mail: rodkin_stas@mail.ru

Нейротравма — один из основных факторов инвалидности и смерти в мире. Мы изучали экспрессию и локализацию белка APP с использованием антител, распознающих С- или N-концы АРР (C-APP и N-APP), в аксотомированных нейронах рака Astacus leptodactylus. АРР — это древний эволюционно консервативный белок, играющий важную роль в различных клетках у животных. Продукты протеолитического распада АРР обладают самостоятельной активностью и участвуют в разных клеточных процессах. АРР накапливается в поврежденных нейронах при ишемическом и травматическом воздействиях. Объекты исследования — изолированный аксотомированный рецептор растяжения рака (РРР), состоящий из механорецепторного нейрона (МРН), окруженного глиальными клетками (ГК), и ганглии брюшной нервной цепочки (БНЦ) с перерезанными коннективами. Методы исследования — иммунофлуоресцентная микроскопия и иммуноблоттинг. В наших экспериментах на РРР C-APP и N-APP обнаруживались исключительно в МРН, но не в ГК. В интактных МРН, сохраняющих связь с БНЦ, C-APP локализовался главным образом в перикарионе и меньше в ядре и дендритах. Через 4 и 8 ч после аксотомии флуоресценция С-APP значительно возрастала в этих частях МРН, а также появлялась в аксоне. Аналогичная динамика наблюдалась и для N-APP, но в ядре N-APP отсутствовал как в интактных, так и в аксотомированных препаратах. По данным иммуноблоттинга, на БНЦ наблюдалась сходная картина в цитоплазматической и ядерной фракциях. Таким образом, появление C-APP, но не N-APP, в ядре нейрона при аксотомии указывает на проникновение в ядро AICD, продукта протеолиза APP. Увеличение уровня C-APP и N-APP в соме, аксоне и дендритах свидетельствует о повышенном синтезе этого белка в перикарионе и транспорте его на периферию.

* * *

Характеристика циклических рнк генов, играющих роль в метаболизме липопротеинов высокой плотности и атерогенезе

А.В. Рожкова¹, Е.В. Носова¹, И.Б. Филиппенков¹, А.Д. Дергунов², С.А. Лимборская¹, Л.В. Дергунова¹

¹ФГБУ «Институт молекулярной генетики» НИЦ «Курчатовский институт», 123182, Москва, Россия;

²ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России, 101990, Москва, Россия; e-mail: avrojk@yandex.ru

Characteristics of circular RNAS of the genes that play a role in high-density lipoprotein metabolism and atherogenesis

A.V. Rozhkova¹, E.V. Nosova¹, I.B. Filippenkov¹, A.D. Dergunov², S.A. Limborska¹, L.V. Dergunova¹

¹Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», 123182, Moscow, Russia; e-mail: avrojk@yandex.ru;

²National Research Centre for Preventive Medicine; 10, Petroverigsky street, 101990, Moscow, Russia

Антиатерогенную роль липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) связывают с их участием в обратном транспорте холестерина (ХС) из периферических тканей в клетки печени. Ранее мы выявили отрицательную корреляцию ХС-ЛПВП с содержанием транскриптов 10 генов (ABCA1, BMP1, CUBN, HDLBP, LCAT, LDLR, PRKACG, PRKACB, SCARB1 и ZDHHC8), участвующих в метаболизме ЛПВП, и 11 генов (CSF2RB, CSF1R, ITGB3, IL18R1, ITGAM, PRKCQ, SREBF1, TLR5, TLR8, TNFRSF1A, TNFRSF1B), вовлеченных в атерогенез. С использованием баз данных circBase, exoRBase, CircNet и CircInteractome обнаружены циклические (цикло) РНК для этих генов за исключением генов PRKACG и TLR8. ЦиклоРНК — новый и активно исследуемый тип некодирующих РНК, способных взаимодействовать с микроРНК (миРНК) и препятствовать опосредованной ими репрессии мРНК. Выявленные циклоРНК включали преимущественно экзоны кодирующей области, нетранслируемых областей соответствующих мРНК и интронные области кодирующих их генов. Число циклоРНК для отдельных генов варьировало от 1 до 94, а их длина — от 46 до 95 610 нуклеотидов. В препаратах РНК, выделенных из мононуклеарных клеток 31 пациента с различающимся содержанием ХС-ЛПВП, с помощью ПЦР в реальном времени исследовано содержание отдельных циклоРНК для генов HDLBP, TNFRSF1A, LCAT, ABCA1. Уровень циклоРНК исследованных генов заметно варьировал. Так, анализ 10 циклоРНК гена ABCA1с наибольшим числом сайтов связывания для миРНК показал, что их содержание относительно соответствующей мРНК варьировало от 0,5 до 22,23%. Для одной циклоРНК гена ABCA1 была обнаружена значимая положительная корреляция с уровнем соответствующей мРНК (p=0,015). Возможно, выявленные циклоРНК участвуют в регуляции экспрессии соответствующих генов.

* * *

ДНК-диагностика полиморфизма генов, ассоциированных с репродуктивными качествами свиней

Е.Л. Романишко, М.Е. Михайлова, Р.И. Шейко

ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, 220072, Минск, Беларусь; e-mail: lenaramanishko@mail.ru

DNA-testing of polymorphism of genes associated with reproductive qualities of pigs

E.L. Ramanishka, M.E. Mikhailova, R.I. Shejko

The Institute of Genetics and Cytology the National Academy of Sciences of Belarus, 220072, Minsk, Belarus; e-mail: lenaramanishko@mail.ru

Репродуктивные качества свиноматок являются важнейшими качествами в свиноводстве. Поэтому выявление ДНК-маркеров, влияющих на показатели воспроизводства, является актуальным. В качестве таких маркеров исследуют полиморфизм (rs80958376 G/A) в гене CDK20. Циклинзависимая киназа 20 (CDK20) представляет собой белок, связанный с делением клеток и фосфорилированием белка, что обеспечивает молекулярную основу для его анализа. Также интересен полиморфизм (rs322167972 A/G) в 3 экзоне гена LIF. Лейкемия-ингибирующий фактор (LIF) представляет собой многофункциональный цитокин, который оказывает влияние на выживаемость клетки, что имеет особенное значение в процессе имплантации эмбриона. Его рассматривают в качестве гена-кандидат плодовитости в том числе и у свиней. Ген коактиватора 1 ядерных рецепторов (NCOA1), кодирует белок NCOA1, который взаимодействует с эстрогеновым рецептором, стимулируя его транскрипционную активность.

Цель — изучение полиморфизмов в генах CDK20 (rs80958376), LIF (rs322167972) и NCOA1 (rs335362002) с целью улучшения репродуктивных качеств племенных свиней. Были разработаны методики для идентификации исследуемых полиморфизмов в генах CDK20, LIF и NCOA1. Все исследованные животные были гетерозиготные по гену CDK20. Частота встречаемости предпочтительного аллеля А по гену LIF больше у свиней породы беларусская мясная — 55,6% и у ландраса — 53,8%, а у свиней породы дюрок — 3,8%. Частота встречаемости аллеля A1 по гену NCOA1, у животных породы белорусская мясная — 22,2%, у породы дюрок — 12,8%. Все исследованные животные породы ландрас были с генотипом A2A2.

Работа выполняется в рамках задания «Разработать метод идентификации полиморфных вариантов генов, влияющих на репродуктивные признаки свиней».

* * *

Особенности организации митогеномов опистоцентровых рыб (Zoarcoidei, Opisthocentridae)

О.А. Рутенко^{1, 2}, С.В. Туранов^{1, 3}, Ю.Ф. Картавцев¹

¹ФГБУ «Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского» ДО РАН, 690041, Владивосток, Россия;

²ФГАУО ВО «Дальневосточный федеральный университет», 690922, Владивосток, Россия;

³ФГБОУ ВО «Дальрыбвтуз», 690087, Владивосток, Россия; e-mail: orutenko@gmail.com

Mitogenome of opistocentral fish (Zoarcoidei, Opisthocentridae): patterns of organizations

O.A. Rutenko^{1, 2}, S.V. Turanov^{1, 3}, Yu.Ph. Kartavtsev^{1, 2}

¹A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, 690041, Vladivostok, Russia;

²Far Eastern Federal University, 690922, Vladivostok, Russia;

³Far Eastern State Technical Fisheries University, 690087, Vladivostok, Russia; e-mail: orutenko@gmail.com

Опистоцентровые — широко распространенные виды морских рыб дальневосточных морей, входящие в состав подотряда бельдюговидные (Zoarcoidei), одного из самых многочисленных подотрядов холодноводной фауны. Данные о полных митохондриальных геномах безусловно будут необходимы для проведения филогенетических и биогеографических исследований, как в рамках семейства Opisthocentridae, так и всего подотряда.

Методом высокопроизводительного секвенирования впервые были получены 11 последовательностей полных митохондриальных геномов 6 видов опистоцентровых рыб. Длина последовательностей варьировала от 16 516 до 16 525 пар оснований. Расположение всех элементов обычное для позвоночных животных.

У всех полученных геномов наблюдалось перекрытие рамок считывания между парами генов tRNA-Ile — tRNA-Gln, tRNA-Gln — tRNA-Met, ATP8 — ATP6, ATP6 — COX3, ND4L — ND4 и ND5 — ND6. Разница по длине в несколько нуклеотидов отмечена в участках, кодирующих малую и большую субъединицы РНК. Не полные стоп-кодоны присутствуют во всех последовательностях, однако безногий опистоцентр Pholidapus dybowskii (Steindachner, 1880) выделяется по сравнению с остальным использованием терминирующего триплета TAG в гене ND1. GC-состав каждого гена по отдельности достаточно однородный, однако отмечены значимые межвидовые отличия этого показателя в участках ND3, ND4, ND5 и ND6, что соответствует более высокому присутствию несинонимичных замен в этих генах, в отличие от самых консервативных, кодирующих субъединицы цитохрома.

По нашим данным опистоцентровые рыбы имеют низкие значения полиморфизма мтДНК, за исключением глазчатого опистоцентра Opisthocentrus ocellatus (Tilesius, 1811). Значимо большие величины его нуклеотидного разнообразия и генетических расстояний относительно других таксонов могут свидетельствовать о большей эволюционной пластичности и адаптивности к условиям окружающей среды или же о криптическом видовом разнообразии внутри этого вида.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ (MK-305.2019.4).

* * *

Роль полиморфных вариантов генов гистаминового метаболического пути в развитии бронхиальной астмы

О.Н. Савельева¹, А.С. Карунас^{1, 3}, Ю.Ю. Федорова², P.Ф. Гатиятуллин^{3, 4}, Э.И. Эткина³, Э.К. Хуснутдинова^{1, 3}

¹ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет», 450076, Уфа, Россия;

²Институт биохимии и генетики УФИЦ РАН, 450054, Уфа, Россия;

³ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, 450008, Уфа, Россия;

⁴ГБУЗ «Республиканская детская клиническая больница», 450106, Уфа, Россия; e-mail: olyasavelie@yandex.ru; carunas@list.ru

The role of histamine pathway genetic polymorphisms in the pathogenesis of asthma

O.N. Savelieva¹, A.S. Karunas^{2, 3}, Yu.Yu. Fedorova², R.F. Gatiyatullin^{3, 4}, E.I. Etkina³, E.K. Khusnutdinova^{1, 2}

¹Bashkir State University, 450076, Ufa, Russia;

²Institute of Biochemistry and Genetics UFRC RAS, 450054, Ufa, Russia;

³Bashkir State Medical University, 450008, Ufa, Russia;

⁴Republican Children’s Clinical Hospital, 450106, Ufa, Russia

Гистамин является одним из основных медиаторов аллергического воспаления. Цель данной работы — изучение полиморфных вариантов генов гистаминового метаболического пути ALDH7A, MAOB, PSAP, ADCYAP1 у больных бронхиальной асмой (БА) и здоровых индивидов. В работе использованы образцы ДНК 350 больных БА и 363 здоровых индивидов различной этнической принадлежности в возрасте 2—18 лет из Республики Башкортостан. Генотипирование выполнено методом ПЦР в реальном времени. Установлена ассоциация аллеля rs13182402*A гена альдегиддегидрогеназы ALDH7A с развитием БА у русских (p=0,04, OR=2,26). Ген моноаминоксидазы B MAOB локализован на X хромосоме, поэтому анализ ассоциаций проведен с учетом половых различий. Обнаружена ассоциация аллеля rs1799836*G гена MAOB с БА у мальчиков русской этнической принадлежности (p=0,03, OR=2,82). Выявлены более высокие значения IgE у детей с генотипом rs11000016*CC гена просапозина PSAP по сравнению с носителями генотипа rs11000016*CT (p=0,03).

Работа выполнена с использованием «Коллекции биоматериалов человека ИБГ УФИЦ РАН» при поддержке гранта РФФИ №19-315-90055.

* * *

Вариабельность экспрессии гена gfp в линиях транспластомных растений табака N. tabacum L.

Д.Е. Самодуров¹, Ю.В. Сидорчук², Е.В. Дейнеко²

¹ФГБОУ «Новосибирский государственный аграрный университет», 630039, Новосибирск, Россия;

²ФГБУН ФИЦ «Институт цитологии и генетики» СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: danilsamad22@gmail.com

Variability of the gfp gene expression in transplastomic tobacco lines N. tabacum L.

D.E. Samodurov¹, Y.V. Sidorchuk², E.V. Deineko²

¹Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Novosibirsk State Agrarian University», 630039, Novosibirsk, Russia;

²Institute of Cytology and Genetics, Russian Academy of Sciences, 630090, Siberian Branch, Novosibirsk, Russia; danilsamad22@gmail.com

Создание транспластомных растений является привлекательной альтернативой трансформации ядерного генома. Большое число копий генома хлоропластов, достигающее, например, у табака 10 000 на клетку, может обеспечивать высокий уровень наработки целевых рекомбинантных белков, до 40—60% от общего растворимого белка (ОРБ). У ядерных трансформантов данный показатель редко превышает 1%. Интеграция трансгена в хлоропластный геном по принципу гомологичной рекомбинации снимает вопрос эффекта положения, а материнский тип наследования трансгена решает проблему экологической безопасности. Однако далеко не всегда у транспластомных растений наблюдается высокий уровень экспрессии трансгена и выхода целевого белка. Проведена сравнительная оценка вариабельности уровня экспрессии репортерного гена gfp по количеству его продукта в тканях транспластномных и ядерных трансформантов табака. Средний уровень накопления белка GFP у транспластомных растений табака составил 0,11±0,01% от ОРБ, в то время как у контрольных ядерных трансформантов этот показатель был в 4 раза выше — 0,47±0,05%. Стандартные методы отбора гомопластидных трансформантов не увеличили уровень накопления целевого белка. Для решения проблемы низкого выхода рекомбинантного белка разрабатывается метод трансформации генома пропластид в каллусных культурах табака, а также метод отбора гомопластомных форм с помощью ПЦР в реальном времени.

* * *

Бактериотоксичность протеализинподобной протеазы S из Photorhabdus luminescens

А.О. Светлова, М.А. Карасева, И.В. Демидюк

ФГБУ «Институт молекулярной генетики» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», 123182, Москва, Россия

Bacteriotoxicity of proteasein-like protease S from Photorhabdus luminescens

A.O. Svetlova, M.A. Karaseva, I.V. Demidyuk

Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», Moscow, Russia

Протеаза S (PrtS) из бактерии Photorhabdus luminescens относится к группе протеализинподобных протеаз (ППП). Показано, что PrtS вызывает меланизацию и подавляет иммунный ответ насекомых, т.е., вероятно, участвует в патогенезе, но прямых доказательств этого нет. В то же время информация о других бактериальных ППП, позволяет предположить, что данные ферменты являются антибактериальными токсинами, потенциальными эффекторами неустановленной системы межбактериальной конкуренции. Однако гипотеза базируется на косвенных данных.

Мы осуществили экспрессию гена фермента в клетках E. coli T7 Express lysY/Iq, используя вектор pET-DUET-1. В плазмиде находятся промотор РНК-полимеразы фага Т7 под управлением лактозного оператора и копия гена репрессора LacI, что, наряду с особенностями штамма, обеспечивает строгий контроль экспрессии. Благодаря этому, клетки E. coli, несущие вектор с геном активной PrtS, удается культивировать. Однако после добавления в среду индуктора нормальный рост культуры продолжается около 2 ч, а затем клетки погибают в течение 1 ч. Электрофоретический анализ демонстрирует, что после индукции PrtS накапливается в клетках преимущественно в форме предшественника, а затем переходит в зрелую форму, что вызывает гибель. При этом введение в ген мутации, инактивирующей каталитический центр фермента, полностью подавляет цитотоксический эффект.

Таким образом, на примере PrtS нами впервые продемонстрирована бактериотоксичность ППП, которая определяется протеолитической активностью. Этот результат свидетельствует в пользу гипотезы об участии протеаз этой группы в межбактериальной конкуренции.

* * *

Исследование потенциальных регуляторных элементов локуса кератиновых генов II типа с помощью анализа пространственной организации генома

М.К. Сидорова¹, Е.П. Калабушева², С.В. Ульянов¹, О.С. Роговая², А.Л. Риппа², В.В. Терских², С.В. Разин¹, Е.А. Воротеляк²

¹Институт биологии гена РАН, Москва, Россия;

²Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия; e-mail: margo.sidorova.1999@mail.ru

Potential regulatory elements of the human keratin type II gene locus identified by the analysis of chromatin distant interactions

M.K. Sidorova¹, E.P. Kalabusheva², S.V. Ulianov¹, O.S. Rogovaya², A.L. Rippa², V.V. Terskikh², S.V. Razin¹, E.A. Vorotelyak²

¹Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia;

²Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; e-mail: margo.sidorova.1999@mail.ru

Особая программа экспрессии кератинов характерна для каждого типа и каждой стадии дифференцировки эпителия. Переключение экспрессии сопровождается изменением пространственной организации генома, в частности, сближением промоторов и энхансеров — регуляторных областей, маркированных гистоном H3, ацетилированным по лизину-27 (Н3K27ac) и монометилированным по лизину-4 (H3K4me1). В данной работе исследована пространственная организация кератинового локуса 12q13.13 в нескольких линиях клеток человека: эпидермальных кератиноцитах, находящихся на разных стадиях дифференцировки, ИПСК (индуцированных плюрипотентных стволовых клетках), фибробластах, НаСаТ и А431. Данные соотнесены с транскрипционным профилем (полученным методом RNAseq с обогащением), профилем связывания архитектурного петлеобразующего белка CTCF и транскрипционного фактора р63 (ChIP-seq). Мы обнаружили, что топология локуса 12q13.13 значительно изменяется по мере дифференцировки кератиноцитов и переключения экспрессии кератина 5, характерного для базального слоя эпидермиса, на кератин 1, специфичный для шиповатого слоя. По результатам анализа данных депозитория ENCODE мы выявили две потенциальные зоны контроля локуса (locus control region, LCR1 и LCR2), ответственные за регуляцию экспрессии кератинов и образующие консервативную петлю, наблюдаемую у всех эпидермальных кератиноцитов. Потенциальная энхансерная активность LCR1 и LCR2 подтверждена данными профилирования транскриптома и связывания активатора p63. Кроме того, мы выявили, что активность кератиновых генов коррелирует с наличием контакта гена с областью LCR2. Наши данные демонстрируют изменения пространственной организации локуса 12q13.13, профиля транскриптома и профиля связывания р63 по мере переключения экспрессии кератиновых генов.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 20-04-00778.

* * *

Эпоксиалкогольсинтазы представителей разных таксонов

Е.О. Смирнова, С.С. Горина, Я.Ю. Топоркова, А.Н. Гречкин

Казанский институт биохимии и биофизики — обособленное структурное подразделение ФГБУН «Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр РАН», 420111, Казань, Россия; e-mail: yelena.smirnova@aiesec.net

Epoxyalcohol synthases of animals and plants

E.O. Smirnova, S.S. Gorina, Ya.Yu. Toporkova, A.N. Grechkin

Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 420111 Kazan, Russia

Ферменты семейства CYP74 ранее считались растительными. Сюда относились алленоксидсинтазы (АОС), гидропероксидлиазы (ГПЛ) и дивинилэфирсинтазы (ДЭС). Однако не так давно были обнаружены ферменты, обладающие сходными с представителями семейства CYP74 последовательностями, структурами и механизмами каталитического действия. Но описаны они были не у растений, а у животных, протеобактерий, бурых и зеленых водорослей. По требованиям номенклатуры цитохромов Р450, они относятся к другим семействам. В связи с этим было введено понятие клана CYP74. К нему отнесли еще одну группу ферментов — эпоксиалкогольсинтазы (ЭАС). До недавнего времени данные ферменты были обнаружены у ланцетника, бурой водоросли Ectocarpus siliculosus и актинии Nematostella vectensis. Кроме того, ЭАС активность была обнаружена у ГПЛ подсемейства CYP74C и некоторых ферментов из подсемейства CYP74B. В 2018 г. была охарактеризована и описана первая растительная эпоксиалкогольсинтаза, относящаяся именно к семейству CYP74. Обнаружен данный фермент был у плаунка Selaginella moellendorffii. Продукты реакции ЭАС представителей разных таксонов различаются по стереохимии. ЭАС животных (в то числе и дуалистичного фермента ланцетника Branchiostoma belcheri) продуцируют эпоксиспирты с цис-дизамещенным эпоксидом. А эпоксиспирты, синтезированные при участии ЭАС плаунка, бурой водоросли E. Siliculosus, ферментов из подсемейств CYP74B и С содержат транс-дизамещенное эпоксидное кольцо. По-видимому, образование эпоксиспиртов с цис-конфигурацией эпоксидного кольца является особенностью животных ферментов с ЭАС активностью.

Исследование фермента ланцетника Branchiostoma belcheri выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №20-34-70126 «Стабильность».

* * *

Роль ядерной периферии в функционировании теломер в герминальных тканях Drosophila

А.Д. Суспицына^{1, 2}, О.А. Соколова¹, А.И. Калмыкова¹

¹НИЦ «Курчатовский институт» — Институт молекулярной генетики, Москва, Россия;

²Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биотехнологии, Москва, Россия; e-mail: anastasia.suspitsina@gmail.com

The role of nuclear periphery in telomere functioning in the Drosophila germline

A.D. Suspitsyna^{1, 2}, O.A. Sokolova¹, A.I. Kalmykova¹

¹Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», Moscow, Russia;

²Biotechnology Faculty, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia; e-mail: anastasia.suspitsina@gmail.com

Пространственная организация хроматина имеет важное значение в функционировании генома. Ядерная ламина играет ключевую роль в этом процессе. С ней ассоциированы важные регуляторные белки: Jil1-киназа — модификатор состояния хроматина, белок Ago2 — компонент системы РНК-интерференции и хроматиновый белок, роль которого до конца не изучена. Нарушения функций ламинов приводит к декомпактизации и транскрипционной активации гетерохроматина.

Теломеры — геномные структуры на концах линейных хромосом — расположены на периферии ядра во многих типах клеток у разных организмов. Ядерная мембрана не только обеспечивает внутриядерную топологию теломер, но и влияет на репарацию и репликацию теломерной ДНК. Заболевания, вызванные дефектами в путях, контролируемых ламинами и теломерами, имеют схожие проявления и напоминают физиологические признаки старения. Особенно важен процесс поддержания функциональных теломер в клетках зародышевого пути для сохранения целостности генома в ряду поколений.

Данная работа посвящена изучению роли белков, ассоциированных с периферией ядра, в поддержании гомеостаза теломер в герминальных клетках Drosophila melanogaster. Теломеры D. melanogaster удлиняются без участия теломеразы, за счет транспозиции ретроэлементов, среди которых основным является HeT-A. Мы показали, что герминальный нокдаун ламинов — DmO и LamC, а также киназы Jil1, приводил к снижению уровня транскриптов ретротранспозона НеТ-А в яичниках дрозофилы. Мы исследовали влияние факторов ядерной периферии на стабильность теломер с помощью иммуноокрашивания H2Av — формы гистона Н2, ассоциированной с разрывами ДНК. В норме теломеры не содержат сигналов H2Av, однако мутация белка Ago2, партнера ламинов, приводила к появлению множественных разрывов в теломерах, несмотря на сохранение их локализации на периферии ядра. Появление разрывов теломерной ДНК напрямую связано с дестабилизацией генома в целом, преждевременным старением и появлением раковых клеток.

* * *

Роль инсуляторного белка BEAF32 в регуляции экспрессии теломерных повторов

М.М. Сухова^{1, 2}, О.А. Соколова¹, В.В. Моргунова¹, А.И. Калмыкова¹

¹НИЦ «Курчатовский институт» — Институт молекулярной генетики, Москва, Россия;

²Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биотехнологии, Москва, Россия; e-mail: mary.sukhova13@gmail.com

The role of BEAF32 insulator protein in regulation of telomeric repeat expression

M.M. Sukhova^{1, 2}, O.A. Sokolova¹, V.V. Morgunova¹, A.I. Kalmykova¹

¹RC «Kurchatov Institute» — Institute of Molecular Genetics, Moscow, Russia;

²Faculty of Biotechnology, Moscow State University Lomonosov, Moscow, Russia; e-mail: mary.sukhova13@gmail.com

Теломеры — это нуклеопротеиновый комплекс на концах линейных хромосом, который предотвращает их деградацию и слияние. Поддержание теломер у Drosophila melanogaster происходит с помощью транспозиций теломерных ретротранспозонов. Повторы TART кодируют обратную транскриптазу, которая осуществляет присоединения к теломерам основного структурного элемента — НеТ-А. Изучение механизмов регуляции экспрессии теломерных повторов важно для понимания принципов контроля длины теломер. Данная работа направлена на исследование роли архитектурных белков в регуляции экспрессии теломерных повторов в герминальных тканях дрозофилы. Инсуляторный белок BEAF32 (Boundary Element-Associated Factor 32 kDa) — один из ключевых компонентов архитектурной организации генома Drosophila. Мы показали, что BEAF32 связывается с промотором TART, но не НеТ-А, в яичниках дрозофилы. BEAF32 также взаимодействует с промотором TART, входящим в состав трансгенной конструкции TART-lacZ. В ноль-мутантах BEAF32 наблюдается активация транскрипции TART только в яичниках, но не в других тканях. Таким образом, белок BEAF32 выполняет роль тканеспецифичного репрессора транскрипции TART. Иммуноокрашивание выявило, что BEAF32 присутствует в хроматине всех клеток яичника, но его количество снижено на ранних этапах оогенеза. Именно в этой зоне наблюдается экспрессия TART и трансгена TART-lacZ. Мы предполагаем, что BEAF32 репрессирует промотор TART в ходе оогенеза, но снижение количества BEAF32 на ранних этапах оогенеза позволяет экспрессию TART и продукцию ревертазы, необходимой для удлинения теломер.

* * *

Разработка технологии трансплантации генов на примере генов антиоксидантной защиты растений

С.С. Тарасов, Е.К. Крутова

ФГБОУ ВО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия», 609107, Нижний Новгород, Россия; e-mail: tarasov_ss@mauil.ru

Development of gene transplantation technology based on the example of plant antioxidant defense genes

S.S. Tarasov, E.K. Krutova

Nizhny Novgorod State Agricultural Academy, 609107, Nizhny Novgorod, Russia; e-mail: tarasov_ss@mauil.ru

В качестве объектов исследования использовали прорастающие семена и проростки гороха (Pisum sativum) и люцерны (Medicágo sativa). На растения действовали гипотермией и ультразвуком, после определяли активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и экспрессию некоторых их генов. Для разработки технологии трансплантации генов работали с нуклеотидными последовательностями растений в https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore и https://phytozome.jgi.doe.gov/, вирусов в https://www.genome.jp/virushostdb/, CRISPR кассет в https://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/.

Было установлено подавляющее влияние гипотермии и ультразвука на активность исследуемых ферментов и экспрессию их генов, как семян, так и проростков гороха. В семенах люцерны активность СОД оказалось выше контроля, а активность КАТ не отличалась от контроля. У проростков картина активности исследуемых ферментов и экспрессии их генов была схожа с таковой в семенах.

Для усиления устойчивости гороха к действию стресс факторов предлагается заменить его гены антиоксидантной защиты на таковые люцерны. Для этого моделировали вектор доставки на основе аденовируса, в котором его природные рецепторы заменялись рецепторами горохового вируса, делались вставки, содержащие сведения о направляющей РНК, Cas12 нуклеазы, спейсерных последовательностей комплементарных областям геномного редактирования. Аденовирус также содержал донорный(е) ген(ы) люцерны и CRISPR/Cas12 системы позволяющий создать «липкие концы» для его вставки после рестрикции горохового гена(ов).

* * *

Полигенный анализ ассоциаций генетических маркеров рассеянного склероза

Я.Р. Тимашева^{1, 2}, Т.Р. Насибуллин¹, И.А. Туктарова¹, В.В. Эрдман¹, Т.Р. Галиуллин², О.В. Заплахова², К.З. Бахтиярова²

¹Институт биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра РАН, 450054, Уфа, Россия;

²Башкирский государственный медицинский университет, 450007, Уфа, Россия; e-mail ianina_t@mail.ru

Polygenic analysis of the genetic markers of multiple sclerosis

Y.R. Timasheva^{1, 2}, T.R. Nasibullin¹, I.A. Tuktarova¹, V.V. Erdman¹, T.R. Galiullin². O.V. Zaplakhova², K.Z. Bakhtiiarova²

¹Institute of Biochemistry and Genetics Ufa Federal Research Centre of Russian Academy of Sciences, 450054, Ufa, Russia;

²Bashkir State Medical University, 450007, Ufa, Russia; e-mail ianina_t@mail.ru

Рассеянный склероз (РС) — хроническое демиелинизирующее заболевание, развивающееся в результате сочетанного влияния генетических и средовых факторов. В ходе полногеномных исследований идентифицировано более 400 генетических вариантов, ассоциированных с РС. Наша цель состояла в поиске комплексных генетических маркеров РС с использованием полигенного подхода. Группу исследования составили 644 пациента с РС и 1382 представителя группы контроля. Полигенный эффект исследуемых локусов на риск РС анализировали при помощи алгоритма APSampler. Для оценки статистической значимости использовали пермутационный тест. В группе русских женщин наиболее значимо ассоциированным с РС было сочетание RPS6KB1 rs180515*T/T + CD40 rs6074022*C/T (OR=0,27, p_perm=0,0005), у русских мужчин — RPS6KB1 rs180515*C/C+PVT1 rs759648*C (OR=7,96, p_perm=0,0008); у женщин татар — MANBA rs228614*A/A+PVT1 rs759648*A+ CD40 rs6074022 (OR=0,1, p_perm=0,001), у мужчин татар — RPS6KB1 rs180515*C+ CLEC16A rs12708716*G/G+ CD58 rs2300747*G (OR=14,88, p_perm=0,0016), у женщин башкир — PVT1 rs759648*C+ CD58 rs23000747*A+ CD40 rs6074022*T/T (OR=4,92, p_perm=0,001), у мужчин башкир — SOX8 rs2744148*A+ CD40 rs6074022*T (OR=0,06, p_perm=0,002). Полученные данные свидетельствуют о наличии этноспецифических комплексных маркеров РС.

Исследование выполнено при поддержке мегагранта Правительства Российской Федерации (№2020-220-08-2197).

* * *

Геномный ПЦР-фингерпринтинг возбудителей бактериальной мягкой гнили растений

А.Д. Токмакова¹, Е.А. Дворякова^{1, 2}, А.А. Лукьянова^{1, 2}, К.А. Мирошников¹

¹Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, Россия;

²Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119234, Москва, Россия; e-mail: anna.zem@mail.ru

Ключевые слова: Pectobacterium, мягкая гниль, бактериофаги, фаготерапия, таксономия.

Genomic PCR fingerprinting of bacteria causing plant soft rot

A.D. Tokmakova¹, E.A. Dvoryakova^{1, 2}, A.A. Lukianova^{1, 2}, K.A. Miroshnikov¹

¹Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS, 119121, Moscow, Russia;

²Lomonosov Moscow State University, 119234, Moscow, Russia; e-mail: anna.zem@mail.ru

Soft Rot Pectobacteriaceae (SRP) — фитопатогенные бактерии, вызывающие мягкую (мокрую) гниль растений. В частности, некоторые представители этого семейства способны приводить к потере свыше 25% урожая картофеля, несмотря на соблюдения условий хранения. Обработка клубней суспензией бактериофагов показывает многообещающие результаты в качестве средства биоконтроля бактериозов картофеля. Однако, важным ограничением применения фаговых препаратов является высокая специфичность, из-за которой необходимо точно установить видовой состав патогенов в каждом конкретном случае. Для SRP экспресс-идентификация существенно осложняется разнообразием штаммовых групп и отсутствием методов экспресс-диагностики, отвечающих современным представлениям о таксономии семейства. Метод геномного фингерпрининга целевых патогенов, в частности BOX-PCR, может быть оптимальным решением проблемы. Благодаря уникальности распределения амплифицированных фрагментов в геле для каждого образца этот метод позволяет различать бактерии на уровне групп штаммов.

Цель данной работы — разработка системы идентификации P. carotovorum и близких видов на основе BOX-PCR. Для этого были получены BOX-фингерпринты более чем 200 штаммов лабораторной коллекции пектобактерий.

В результате исследования было показано наличие четко дифференцируемых групповых фрагментных карт для многих видов SRP, в том числе, для P. versatile, P. carotovorum и P. polaris.

Таким образом, этот метод хорошо подходит для дифференциации уже имеющихся и выделенных де-ново бактерий различных групп SRP.

* * *

Ферменты cyp74 — представители древних цитохромов Р450

Я.Ю. Топоркова, Е.О. Смирнова, С.С. Горина, А.Н. Гречкин

Казанский институт биохимии и биофизики — обособленное структурное подразделение ФИЦ КазНЦ РАН, 420111, Казань, Россия; e-mail: yanchens@yandex.ru

The cyp74 enzymes — representatives of ancient cytochromes P450

Ya.Yu. Toporkova, E.O. Smirnova, S.S. Gorina, A.N. Grechkin

Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 420111, Kazan, Russia; e-mail: yanchens@yandex.ru

Ферменты CYP74 являются неклассическими цитохромами Р450, которым не требуется молекулярный кислород и окислительно-восстановительные партнеры. Мы предполагаем, что ферменты CYP74 являются представителями древних цитохромов Р450, сохранившихся до наших дней благодаря переключению с защитных функций (преобразование гидроперекисей жирных кислот, образованных в результате действия АФК, в менее опасные продукты) на сигнальные функции, приобретенные продуктами CYP74. Эту гипотезу подтверждают следующие факты. Локализация современных CYP74 растений связана с хлоропластами — потомками первых фотосинтезирующих организмов. С точки зрения эволюции, делеция 9-аминокислотного фрагмента (присутствующего только у CYP74) более вероятна, чем их случайная вставка с появлением новой функции. Отсутствие кислорода предшествовало его появлению в атмосфере в качестве доступного субстрата. На независимо построенных филогенетических деревьях ферменты CYP74 (обнаруженные у животных, растений, водорослей и протеобактерий) собраны в отдельную монофилетическую ветвь. Данная модель не требует привлечения дополнительных эволюционных механизмов, эффективность которых не может быть подтверждена; так, для объяснения присутствия CYP74 у животных было выдвинуто предположение о горизонтальном переносе соответствующих генов от растений посредством протеобактерий. По сравнению с монооксигеназной реакция CYP74 не требует дополнительных участников; предположение о поступательном развитии от двухкомпонентной системы к сложному реакционному комплексу оправданно.

Филогенетические исследования проводились при финансовой поддержке гранта РНФ 20-14-00338. Структурный анализ ферментов CYP74 проводился при финансовой поддержке гос. задания ФИЦ КазНЦ РАН.

* * *

Разработка набора олигонуклеотидов для идентификации сахалинского осетра Acipenser mikadoi hilgendorf, 1892 с помощью пцр

С.В. Туранов^{1, 2}

¹ФГБУН «Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского» Дальневосточного отделения Российской академии наук, 690041, Владивосток, Россия;

²ФГБОУ ВО «Дальрыбвтуз», 690087, Владивосток, Россия; e-mail: sturcoal@mail.ru

The development of pcr oligonucleotide kit for the identification of the sakhalin sturgeon Acipenser mikadoi hilgendorf, 1892

S.V. Turanov^{1, 2}

¹A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, 690041, Vladivostok, Russia;

²Far Eastern State Technical Fisheries University, 690087, Vladivostok, Russia; e-mail: sturcoal@mail.ru

Осетровые (сем. Acipenseridae) — ценные промысловые рыбы, объект аквакультуры. Род Acipenser насчитывает около 20 видов, 12 из которых отмечены для российской территории. Одним из наиболее редких является сахалинский осетр A. mikadoi Hilgendorf, 1892. В настоящее время вид находится на грани исчезновения. Ввиду малой численности редких и исчезающих видов рыб, наиболее подходящими для мониторинга их видового и генетического разнообразия представляются неинвазивные подходы, в том числе использование ДНК из окружающей среды. Метод хорошо зарекомендовал себя в данной области и успешно апробирован для мониторинга нескольких видов редких и исчезающих осетров. В настоящей работе приводятся результаты разработки праймеров, специфичных для митохондриальной ДНК вида A. mikadoi. Сформирована матрица из 15 последовательностей полных митохондриальных геномов от 3 видов осетровых рыб, ареалы которых могут пересекаться: A. mikadoi, A. dauricus и A. schrenckii. Также к анализу привлечен A. medirostris, который является генетически наиболее близким сахалинскому осетру, но отдален от него географически. С помощью алгоритма скользящего окна выявлены наиболее изменчивые фрагменты митохондриального генома данных осетров: 16S рРНК, COI, ND1 и D-loop. Поиск видоспецифичных праймеров проведен в программе DECIPHER. Каждую пару праймеров проверяли на спеифичность с помощью Primer-BLAST. В качестве референса отдельно в разных запусках использовали класс Actinopterygii, а также сем. Acipenseridae. Дополнительно выполнена проверка праймеров с использованием локальных референсных последовательностей полного митохондриального генома представителей рода Acipenser. В итоге наиболее удачным для безошибочной идентификации сахалинского осетра видится использование сочетания пар праймеров, разработанных на основе фрагментов D-loop и COI. В настоящее время праймеры проходят экспериментальную проверку.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ (MK-305.2019.4).

* * *

Генотипическая характеристика клубеньковых бактерий сои с помощью RFLP- и RAPD-анализа 16S рДНК участка генома

Б.Р. Умаров

Узбекский государственный университет мировых языков, кафедра естественных наук, Ташкент, Узбекистан; e-mail: b.r.umarov@mail.ru

Таксономия азотфиксирующих бактерий, которые образуют симбиотические ассоциации с бобовыми растениями, в последние годы стала сильно изменяться. Функции генов клубеньков (nod) — во взаимодействии между ризобиями и бобовыми. Гены nod являются ключевыми бактериальными детерминантами обмена сигналами между двумя симбиотическими партнерами. Продукт гена nodС представляет собой белок, участвующий в первой стадии образовании клубеньков, в дальнейшем осуществляются другие функции (nod) генов, которые выводятся из организма и служат сигналами, посылаемыми от бактерии к растению. Растение отвечает развитием корневого клубенька.

В этом исследовании бактерии, выделенные из клубеньков сои, выращенной в полевых условиях, были генетически охарактеризованы с использованием праймеров REP и BOX A1R, генов нодуляции и N₍₂₎-фиксации (PCR-RFLP и секвенирование генов nodC и nifH). Восемнадцать штаммов ризобий, выделенных из клубеньков сои, были охарактеризованы по базам данных NCBI и сравнены с типовыми штаммами, представляющими Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium elkanii и Sinorhizobium fredii. Кластерный анализ 16S рДНК участков, проведенный с применением трех эндонуклеаз рестрикции, показал, что все выделенные изоляты клубеньковых бактерий сои значительно отличались от штаммов Bradyrhizobium elkanii и Sinorhizobium fredii, генетическое разнообразие было определено среди изолятов Bradyrhizobium japonicum. Анализ RFLP 16S рДНК участка генома четко показал существование двух дивергентных групп среди выделенных клубеньковых бактерий Bradyrhizobium. После идентификации на уровне видов все изоляты были дополнительно охарактеризованы с помощью RAPD и rep-PCR-анализов. И RAPD, и rep-PCR генерирует высокоспецифичные и воспроизводимые структуры, которые обеспечивают точную дифференциацию. Среди штаммов Bradyrhizobium japonicum этими двумя методами обнаружен высокий уровень разнообразия, выявлены разные рестрикционные сайты в 16S рДНК участке генома. Полученные результаты RAPD-, REP- и ERIC-анализов показали, что все выделенные штаммы можно разделить на три основные группы.

* * *

Биоинформатический анализ миРНК GH_SRNA5DPA12 хлопчатника

Д.Э. Усманов, З.Т. Буриев, Х.А. Убайдуллаева, А.С. Имамходжаева, Ш.С. Абдукаримов, Б.М. Собиров, И.Ю. Абдурахмонов

Центр геномики и биоинформатики Академии наук Республики Узбекистан, 111215, Ташкентская обл., Кибрайский р-н, Узбекистан, e-mail: dilshodusmonov1987@gmail.com

Bioinformatic analysis of miRNA GH_SRNA5DPA12 COTTON

D.E. Usmanov, Z.T. Buriev, Kh.A. Ubaidullaeva, A.S. Imamkhodzhaeva, Sh.S. Abdukarimov, B.M. Sobirov, I.Yu. Abdurakhmonov

Center for Genomics and Bioinformatics of the Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan, 111215, Tashkent region, Kibray district, Uzbekistan, e-mail: dilshodusmonov1987@gmail.com

Как известно, открытие малых РНК произошло в конце 1990-х годов. Согласно функциям, их классифицировали в 2 класса: siRNA и miRNA. Если siRNA — это малые интерферирующие РНК растений, то miRNA — это молекулы, способные полностью или частично комплементарно связываться с мРНК генов-мишеней, приводить к их разрушению и таким образом ингибировать процесс трансляции. Им стали уделять большее внимание, так как выявлено, что они являются наиважнейшим регулятором клеточных процессов и играют ключевую роль в подавлении экспрессии генов. Контроль мРНК с помощью miRNA позволяет создать специфическую стратегию модуляции экспрессии генов растений, а также делает возможным улучшение, например, агротехнических свойств сельскохозяйственных культур, в частности, некоторых представителей рода Gossypium. Так как хлопчатник является важной сельскохозяйственной культурой, многие работы исследователей направлены на создание раннеспелых генотипов, на улучшение качества волокна, повышение урожайности растений, усиление устойчивости к влиянию абиотических и биотических факторов. В данный момент для нас большой интерес представляет исследование молекулярных основ активности miRNA на стадиях формирования волокна хлопчатника. Объектом наших исследований является малая РНК Gh_sRNA5dpa12, выявленная на стадий развития волокна хлопчатника. Нами предпринята попытка провести сравнительный биоинформатический анализ геномов арабидопсиса (Arabidopsis thaliana), с диплоидными (Gossypium arboreum L., G. raimondii L.), и тетраплоидным (G. hirsutum L.) видами хлопчатника. Биоинформатический анализ выполнялся с использованием раздела BLSTn базы данных генов NCBI и филогенетического дерева генов SEQUENCHER 5.4 и FRS с использованием программ CLUSTW, PAUP. На основе анализа данных генов миРНК Gh_sRNA5dpa12 генома A. thaliana сделано заключение, что целевым геном для нее является ген FRS10, один из членов семейства генов FRS. При сопоставлении генома A. thaliana с геномом хлопчатника G. hirsutum сходство составило 70,29%.

* * *

Редактирование генов взаимодействия и слияния мембран гамет кукурузы

В.В. Фадеев, Е.М. Моисеева, Ю.С. Гусев, С.И. Мазилов, М.И. Чумаков

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049, Саратов, Россия; e-mail: vvf2593@gmail.com

Editing the maize gamete membrane interaction genes

V.V. Fadeev, E.M. Moiseeva, Yu.S. Gusev, S.I. Mazilov, M.I. Chumakov

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 410049, Saratov, prospect Entuziastov, 13, Russia; e-mail: vvf2593@gmail.com

Целью эксперимента было создание и применение CRISPR/Cas9-конструкций для нокаутирования генов Zm_gex2 и Zm_gsc1 и их перенос в генетически маркированную линию кукурузы Коричневый маркер (не гаплоиндуктор). Гены взаимодействия (Zm_gex2) и слияния (Zm_gcs1) мембран гамет кукурузы, впервые описанные нами в 2017 г. (Волохина и соавт., 2017), могут быть связаны с явлениями гиногенеза (формирования зародыша из неоплодотворенной яйцеклетки) и гаплоиндукции (Чумаков, 2018). На основе вектора pRGEB-32BAR было создано несколько CRISPR/Cas9-конструкций с тремя гид-РНК к гену Zm_gex2 и двумя гид-РНК к гену Zm_gcs1, которые переносились в геном кукурузы методом агробактериальной трансформации in planta. Встройка CRISPR/Cas9-конструкций была обнаружена методом ПЦР в 16 из 88 объединенных (по 10 шт.) образцов и подтверждена в 7 образцах из проверенных 74 индивидуальных растений.

Исследование поддержано грантами РФФИ №20-016-00020а (Zm_gex2) и №20-316-80020/20 (Zm_gcs1).

Литература

1. Волохина И.В., Моисеева Е.М., Гусев Ю.С., Гуторова О.В., Чумаков М.И. Анализ генов слияния гамет у гапло-индуцирующей линии кукурузы ЗМС-П. Онтогенез. 2017;2:134-139.

2. Чумаков М.И. Матроклинная гаплоидия и взаимодействие гамет у кукурузы (обзор). Генетика. 2018;54:10:1120-1124.

* * *

Тонус сосудов у женщин с вариантом rs2070744 гена NOS3

Н.А. Фадеева, Н.А. Бебякова, О.А. Афиногенова, А.В. Хромова, А.В. Сумарокова

ФГБОУ ВО «Северный государственный медицинский университет», Архангельск, Россия; e-mail: tascha1811@rambler.ru

Vasculat tone in women with the variant rs2070744 of the gene NOS3

N.A. Fadeeva, N.A. Bebyakova, O.A. Afinogenova, A.V. Khromova, A.V. Sumarokova

Northern State Medical University, Arkhangelsk, Russia; e-mail: tascha1811@rambler.ru

Перспективным подходом для выделения группы повышенного риска формирования вазоконстрикции является анализ полиморфизма генов-кандидатов. Одним из таких генов является ген эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3). Были обследованы 116 практически здоровых женщины в возрасте 18—22 лет, постоянно проживающих на территории Арктического региона. Исследование проводили в фолликулярную и лютеиновую фазы овариально-менструального цикла. Генотипирование полиморфного варианта –786T>C (rs2070744) гена NOS3 проводили методом пиросеквенирования. Для оценки функционального состояния ССС у женщин применялась проба Мартине—Кушелевского. Тонус сосудов определяли реографическим методом, оценивали по индексу периферического сопротивления (ИПС). Статистический анализ выполнен с использованием пакета прикладных программ SPSS statistics. Преобладающими были генотипы, содержащие дикий вариант аллеля — Т, а наиболее редким вариантом — генотип СС. ИПС как до нагрузки, так и после нее в фазы овариально-менструального цикла у женщин с генотипами ТТ и СТ полиморфизма –786Т>С гена NOS3 не выходил за пределы нормы и был практически одинаков, тогда как в группе СС высокий ИПС (более 90) наблюдался в фолликулярную фазу после нагрузки, а в лютеиновую — как до нагрузки, так и после нее. Полученные данные свидетельствуют о том, что у женщин-гомозигот по мутантному аллелю С наблюдается тенденция к вазоконстрикции, особенно в лютеиновую фазу, где повышенный уровень ИПС наблюдается не только после физической нагрузки, но и в условиях покоя.

* * *

Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов, участвующих в метаболизме гистамина, с развитием аллергического ринита

Ю.Ю. Федорова¹, А.С. Карунас^{1, 2}, О.Н. Савельева³, И.А. Камышников³, Э.К. Хуснутдинова^{1, 3}

¹Институт биохимии и генетики УФИЦ РАН, 450054, Уфа, Россия;

²ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, 450008, Уфа, Россия;

³ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет», 450076, Уфа, Россия; e-mail: fedorova-y@yandex.ru

Association analysis of gene polymorphisms involved in the histamine metabolism with allergic rhinitis

Yu.Yu. Fedorova¹, A.S. Karunas^{1, 2}, O.N. Savelieva³, I.A. Kamyshnikov³, E.K. Khusnutdinova^{1, 3}

¹Institute of Biochemistry and Genetics UFRC RAS, 450054, Ufa, Russia;

²Bashkir State Medical University, 450008, Ufa, Russia;

³Bashkir State University, 450076, Ufa, Russia; e-mail: fedorova-y@yandex.ru

Гистамин — это медиатор аллергических реакций немедленного типа, участвующий в развитии многих заболеваний, в том числе и аллергического ринита (АР). Цель исследования — изучение ассоциации полиморфных вариантов генов аминоксидазы 1 AOC1 и гистамин N-метилтрансферазы HNMT с развитием АР. В качестве материала исследования использованы образцы ДНК 455 больных АР, 298 детей из которых имели сопутствующий диагноз — атопическая бронхиальная астма (БА). В контрольную группу вошли 287 детей без бронхолегочных, аллергических и аутоиммунных заболеваний. Генотипирование проведено с использованием метода ПЦР-ПДРФ. Выявлено, что аллель rs1049793*С гена AOC1 является маркером повышенного риска развития АР в целом (p=0,02, OR=1,69) и АР с сопутствующей БА (p=0,01, OR=1,92) у русских. Обнаружена ассоциация аллеля rs1801105*T гена HNMT с умеренным повышением общего IgE у детей, больных АР с БА (p=0,02, OR=1,75).

Работа выполнена с использованием «Коллекции биоматериалов человека ИБГ УФИЦ РАН» при поддержке гранта РФФИ №19-315-90055.

* * *

Антистрессовое действие аналогов меланокортина связано с коррекцией профиля экспрессии генов в гиппокампе крыс после острого стресса

И.Б. Филиппенков¹, В.В. Ставчанский¹, Н.Ю. Глазова¹, Е.А. Себенцова¹, Л.В. Валиева¹, Ю.А. Ремизова¹, Н.Г. Левицкая², Н.Ф. Мясоедов¹, С.А. Лимборская¹, Л.В. Дергунова¹

¹ФГБУ «Институт молекулярной генетики» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», 123182, Москва, Россия;

²ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», 119991, Москва, Россия; e-mail: filippenkov@img.msk.ru

Antistress effect of melanocortin analogs associated with correction of gene expression patterns in rat hippocampus after acute stress

I.B. Filippenkov¹, V.V. Stavchansky¹, N.Yu. Glazova¹, E.A. Sebentsova¹, L.V. Valieva¹, Ju.A. Remizova¹, N.G. Levitskaya², N.F. Myasoedov¹, S.A. Limborska¹, L.V. Dergunova¹

¹Institute of Molecular Genetics of National Research Centre «Kurchatov Institute», 123182, Moscow, Russia;

²Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Russia; e-mail: filippenkov@img.msk.ru

Природные меланокортины (МК) активно используются при разработке лекарств с нейропротективными свойствами. В данной работе были изучены поведенческие эффекты и молекулярно-генетические механизмы действия синтетических аналогов МК — АКТГ(4-7)PGP (семакс) и АКТГ(6-9)PGP в норме и в условиях острого иммобилизационного стресса (ОИС). Введение крысам пептидов (100 мкг/кг) за 30 мин до ОИС значительно ослабляло стресс-вызванные изменения поведения животных. С помощью высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-Seq) с применением алгоритма «TopHat+Cufflinks+DeSeq2» мы идентифицировали 1359 дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) (>1,5; Padj<0,05) в гиппокампе крыс через 4,5 ч после ОИС по сравнению со здоровыми животными. Введение семакса приводило к модуляции более 1500 ДЭГ, а введение АКТГ(6-9)PGP — менее 400 ДЭГ через 4,5 ч после ОИС. При этом было выявлено 246 общих ДЭГ, экспрессия которых изменялась сонаправленно под действием обоих пептидов в условиях ОИС. В частности, пептиды модулировали экспрессию генов, связанных с метаболизмом и трансляцией РНК (Rps13, Rpl9, Srsf1, Tcf7l1), репликацией ДНК (Pole4, Anapc15), функциями иммунной (Cd63, Psma5, Psmb4, Hsp90aa1) и нервной (Chrna4, Vdac3, Grik3) систем. Кроме того, пептиды повышали уровни экспрессии генов, которые были снижены через 4,5 ч после ОИС, и наоборот, аналоги МК снижали уровни экспрессии генов, которые были активированы после ОИС. Таким образом, антистрессовое действие производных МК может быть связано с коррекцией профиля экспрессии генов, нарушенного действием ОИС.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ №19-14-00268.

* * *

Влияние белков семейства синуклеинов на дофаминовую трансмиссию

К.Д. Чапров, Ю.С. Суханова

Институт физиологически активных веществ РАН, 142432, Черноголовка, Россия; e-mail: chaprov@ipac.ac.ru

Proteins of the sinuclein family affect dopamine transmission

K.D. Chaprov, Yu.S. Sukhanova

Institute of Physiologically Active Compounds Russian academy of sciences, 142432, Chernogolovka, Russia; e-mail: chaprov@ipac.ac.ru

Синаптическая передача нервного импульса посредством дофамина (ДА) используется во многих нейронных сетях и ее нарушения приводят к развитию неврологических и психических заболеваний. Роль белка альфа-синуклеина (SNCA) в оптимизации ДА трансмиссии подтверждена целым рядом исследований, а при нарушении функции SNCA с возрастом развивается синаптическая патология. О влиянии двух других белков семейства синуклеинов на процессы дегенерации ДА нейронов во взрослом мозге известно мало.

В работе было изучено влияние синуклеинов на эффективность захвата, меченного тритием ДА в препаратах очищенных синаптических везикул, выделенных с помощью последовательного ультрацентрифугирования из дорзальных стриатумов бессинуклеиновых мышей (тройной нокаут SNCA-/-_SNCB-/-_SNCG-/-). Было показано, что в отсутствие синуклеинов наблюдалось существенное снижение эффективности захвата ДА синаптическими везикулами (на 40%), при этом захват ДА синаптосомами не менялся. Добавление рекомбинантных синуклеинов повышало уровень захвата ДА во фракциях синаптических везикул in vitro. Наиболее выраженным эффектом обладал бета-синуклеин (SNCB). Способность SNCB восстанавливать эффективность захвата ДА была независимо подтверждена in vivo путем лентивирусной доставки конструкта, кодирующего белок SNCB. После стереотаксических унилатеральных инъекций в область черной субстанции, где расположены тела ДА нейронов, синтезированный SNCB транспортировался по нигростриарному тракту в дорсальный стриатум и был детектирован в синаптических везикулах. Эффективность захвата ДА синаптическими везикулами из стриатумов полушария с восстановленным уровнем SNCB была статистически достоверно выше, чем из контрольного полушария.

Полученные данные являются первым экспериментальным доказательством роли SNCB в оптимизации захвата ДА синаптическими везикулами.

Анализ синуклеинов in vitro поддержан грантом РНФ (№19-14-00064), работы на нокаутных животных — грантом РФФИ (№19-315-90049), содержание мышей осуществлялось при поддержке гранта Министерства науки и высшего образования РФ (№075-15-2020-795).

* * *

Профиль экспрессии генов негативных регуляторов mTOR-сигналинга при старении и долголетии

В.В. Эрдман, И.А. Туктарова, Я.Р. Тимашева, Т.Р. Насибуллин

Институт биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра РАН, 450054, Уфа, Россия; e-mail: danivera@mail.ru

Gene expression profile of negative regulators of mTOR signaling in aging and longevity

V.V. Erdman, I.A. Tuktarova, Y.R. Timasheva, T.R. Nasibullin

Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Branch of the Russian Academy of Sciences, 450054, Ufa, Russia; e-mail: danivera@mail.ru

Долголетие является показателем высокоадаптивного фенотипа, в основе которого лежит сбалансированная работа эволюционно консервативных сигнальных путей, контролирующих широкий спектр биологических процессов. Один из ключевых регуляторов множественных клеточных процессов — это mTOR-сигналинг, ингибирование которого выступает триггером старения. Цель исследования заключалась в оценке уровня экспрессии генов, участвующих в негативной регуляции mTOR-сигнального пути, на разных этапах онтогенеза человека. Материалом послужили 130 образцов РНК, полученных из лимфоцитов периферической венозной крови здоровых индивидов в возрасте от 22 до 100 лет. Сравнительный анализ экспрессии 30 генов ингибиторов mTOR-сигналинга выполнен с учетом возраста. В группе лиц старческого возраста (80—89 лет) по сравнению с контролем (22—57 лет) снижен уровень экспрессии генов MTOR, PRKAB2, TSC1, CAB39L, YWHAQ (FR≤2, p<0,05). У долгожителей (90—100 лет), в сравнении с лицами старческого возраста, повышена экспрессия гена ULK2 (FR=3,17, p=0,04). Таким образом, в преклонном возрасте снижается экспрессия ряда генов, отвечающих за подавление mTOR-сигналинга путем активации mTORС1-пути. Это может опосредовать прогрессию клеточного старения, развитие возрастных заболеваний и в целом формирование старческого фенотипа. Однако среди лиц старше 90 лет экспрессия этих генов схожа с таковой у лиц среднего возраста, а обусловленное повышенной активностью гена ULK2 поддержание процесса аутофагии, необходимого для утилизации поврежденных молекул, способствует долгожительству.

Работа выполнена в рамках госзадания (№АААА- А21-121011990119-1) и при финансовой поддержке мегагранта Правительства Российской Федерации (№2020-220-08-2197).

* * *

Влияние нулевых аллелей на генетическое разнообразие и популяционную структуру Apostichopus japonicus selenka, 1867

В.Д. Ягодина, Н.М. Батищева, В.А. Брыков

Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Приморский край, 690041, Владивосток, Россия; e-mail: iagodinavd@gmail.com

Effect of null alleles on genetic diversity and population structure of Apostichopus japonicus selenka, 1867

V.D. Iagodina, N.M. Batishcheva, V.A. Brykov

Zhirmunsky Institute of Marine Biology, National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Primorsky region, 690041, Vladivostok, Russia; e-mail: iagodinavd@gmail.com

Apostichopus japonicus Selenka, 1867 широко распространен в прибрежных водах восточной Азии, где является одним из важнейших объектов аквакультуры благодаря широкому использованию в медицине. Однако ценность трепанга способствовала его ненормированному вылову, что в итоге привело к сокращению численности популяций и генетического разнообразия этого животного в местах его обитания. Для изучения генетического разнообразия используются молекулярные маркеры, одними из которых являются микросателлиты. Одним из недостатков этих маркеров является наличие нулевых аллелей, которые влияют на конечный результат. В нашем исследовании мы изучили действие нуль-аллелей на оценку генетического разнообразия и популяционную структуру Apostichopus japonicus из залива Петра Великого с использованием 5 микросателлитных локусов. В результате корректировки первичных данных коэффициент инбридинга существенно уменьшается. Присутствие нулевых аллелей в 1,5—2 раза снижало значение наблюдаемой гетерозиготности и вело к отклонению от равновесия Харди—Вайнберга Генетические дистанции между выборками изменялись незначительно, что связано с небольшим числом локусов.