Введение

Глобальная индустриализация создает проблему загрязнения окружающей среды различными токсичными веществами, включая тяжелые металлы. Тяжелые металлы входят в пищевую цепь и негативно влияют на здоровье человека, они могут быть канцерогенами. Кроме того, накопление тяжелых металлов в воде, осадках и почвах приводит к серьезным экологическим проблемам. К высокотоксичным веществам, загрязняющим окружающую среду, относится также мышьяк. В определенных концентрациях медь и цинк, как и ряд других тяжелых металлов, необходимы для поддержания клеточного метаболизма, они участвуют в большом количестве клеточных процессов [1, 2]. Но в более высоких концентрациях они токсичны для организмов. В ходе эволюции бактерии, обитая в различных экологических нишах, выработали механизмы для реагирования на изменения концентраций тяжелых металлов и мышьяка в окружающей среде. В связи с важностью биологических функций тяжелых металлов и мышьяка представляет большой интерес изучение их взаимодействия с биологически активными соединениями, которые могли бы модулировать их действие на клеточные процессы.

Микроорганизмы способны синтезировать летучие органические соединения (ЛОС) различной химической природы (рис. 1). Изучение природы, функциональной и экологической роли, механизмов действия и биосинтеза ЛОС — это новое актуальное направление, имеющее важное фундаментальное и прикладное значение, открывающее малоизученные аспекты конкурентных отношений между микроорганизмами и закономерности их взаимодействия с высшими организмами.

Рис. 1. Химические формулы ЛОС, синтезируемых бактериями, в том числе относящимися к родам Pseudomonas (449; В-4117) и Serratia (IC1270; 94) [17].

Недавно была опубликована база данных идентифицированных ЛОС, продуцируемых бактериями и грибами [3]. ЛОС способны модулировать рост и метаболизм про- и эукариот, функционировать в качестве сигналов дистанционной коммуникации нового типа между различными организмами. ЛОС могут также влиять на действие различных стрессовых факторов [4—6].

Например, в присутствии индола у Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella enterica усиливается резистентность к антибиотикам, у E. coli снижается устойчивость к кислотам [4]. В транскриптомных и протеомных исследованиях было определено большое количество генов, влияющих на устойчивость клеток Pseudomonas putida к действию бензола, толуола, бутанола и др. [7].

Из ЛОС, образуемых бактериями, была исследована генетика стресса, вызванного действием бутанола. Было показано, что толерантность к этому соединению определяется мультифакторным процессом, который включает широкий диапазон генетических и физиологических изменений для защиты клеток от его токсического действия [8, 9]. Также обнаружено, что в ответ на присутствие в среде бутанола в клетках Pseudomonas и Clostridium, толерантных к этому соединению, индуцируется синтез шаперонов, в том числе шаперонов GroES, IbpA и ClpP, участвующих в рефолдинге белков [10, 11]. Ранее мы продемонстрировали способность ЛОС (кетонов 2-ундеканона, 2-нонанона, 2-гептанона) влиять на рефолдинг белков в клетках E. coli и роль шаперона IbpB, который способствует рефолдингу термически инактивированных люцифераз, защищая их от действия кетонов. Наблюдаемый эффект можно объяснить взаимодействием ЛОС с гидрофобными участками фермента и конкуренцией с шаперонами IbpAB [12].

С помощью методов транскриптомики было показано, что у E. coli экспрессия генов различных функциональных категорий, например тех, которые относятся к биогенезу белков (характеризующихся наличием железосерных (Fe/S) кластеров), транспортных и отвечающих на окислительный стресс белков, чувствительна к действию ЛОС с различной химической структурой в концентрациях, не ингибирующих рост бактерий. Некоторые из этих генов относятся к общим ответам на стрессовые факторы (например, на действие окислителей, антибиотиков, низкий уровень питательных веществ в окружающей среде, УФ-излучение и др.) [13].

Однако исследования, посвященные изучению генетических детерминантов, участвующих в регуляции действия ЛОС различной химической природы, выяснению контроля их стрессового действия, сравнению с другими известными стрессорами, в основном носят описательный характер и не рассматривают детально молекулярные механизмы действия ЛОС.

Цель работы — исследовать влияние ЛОС, выделяемых бактериями, на экспрессию генов, отвечающих на стрессы, вызванные действием ионов тяжелых металлов и мышьяка.

Предполагалось определить действие серосодержащего ЛОС диметилдисульфида (ДМДС) и кетонов (2-ундеканона, 2-нонанона, 2-гептанона, 2-пентанона и 2-пропанона) на экспрессию генов copA, zntA и arsR, индуцируемых в клетке в ответ на наличие в среде солей CuSO₄, ZnSO₄ и NaAsO₂ (продукты этих генов участвуют в защите клеток от токсичных концентраций указанных соединений). В работе было проведено 2 типа экспериментов по изучению: 1) действия ЛОС на экспрессию с промоторов генов copA, zntA и arsR в нормальных условиях роста и 2) действия ЛОС на уровень экспрессии с промоторов указанных генов в условиях их индукции при добавлении растворов солей CuSO₄, ZnSO₄ и NaAsO₂.

Материал и методы

Бактерии, условия выращивания, реактивы

Бактерии выращивали на жидкой среде LB (Miller Luria Bertani Broth): бактотриптон — Bacto Tryptone (Amresco, USA) — 10 г/л; дрожжевой экстракт — Yeast Extract (Sigma-Aldrich Chimie GmbH, Steinheim, Germany) — 5 г/л; хлорид натрия — NaCl («Реахим», Россия) — 10 г/л, и агаризованной среде LA (LB с 1,5% агара — Thermo Scientific Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK) при 30 °C и перемешивании (110 об./мин). Ампициллин добавляли в среду в концентрации 100 мкг/мл (ОАО «Биохимик», Россия).

В качестве тестируемых ЛОС были использованы индивидуальные ЛОС в жидкой форме: диметилдисульфид (ДМДС, >99% чистоты), 2-ундеканон (98%), 2-нонанон (>99%); 2-гептанон (>99%) 2-пентанон (>99%), 2-пропанон (ацетон, >99%). Все ЛОС приобретены у фирмы Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Штайнхайм, Германия).

Биосенсоры для детекции меди, цинка и мышьяка

В работе были использованы высокочувствительные специфические lux-биосенсоры — E. coli с гибридными плазмидами (pCopA’::lux, pZntA’::lux и pArsR’::lux), содержащими в качестве репортеров lux-оперон (luxCDABE) из Photorhabdus luminescens, а в качестве регулируемых элементов — индуцируемые промоторы генов copA, zntA, и arsR (PcopA, PzntA и ParsR); lux-оперон транскрибировался с промоторов перечисленных генов. В присутствии в среде ионов меди, цинка и мышьяка клетки биосенсоров начинают люминесцировать. Степень экспрессии с соответствующих промоторов определялась по интенсивности биолюминесценции [14—16]. Измерения проводили на приборе Modulus microplate Multimode Reader (Turner Bio Systems inc., США).

1) Биосенсор E. coli JM83/pCopA’::lux. Транскрипцию гена copA (кодирует АТФ-зависимый белок — транспортер ионов меди и серебра) регулирует активатор CueR. При взаимодействии ионов меди Cu²⁺ с CueR данный белок активирует транскрипцию гена copA, а в биосенсоре — генов репортера lux-оперона, расположенных под индуцируемым промотором гена copA (PcopA).

2) Биосенсор E. coli JM83/pZntA’::lux. Транскрипцию гена zntA (кодирует АТФ-зависимый интегральный мембранный белок-транспортер ионов цинка, кадмия и свинца) регулирует активатор ZntR. При взаимодействии белка ZntR с ионами цинка данный белок активирует транскрипцию гена zntA, а в биосенсоре — транскрипцию генов lux-оперона с индуцируемого промотора гена zntA (PzntA).

3) Биосенсор E. coli JM83/pArsR’::lux. Ген arsR кодирует белок-репрессор ars-оперона (ars-оперон определяет резистентность бактерий к ионам мышьяка и сурьмы). ArsR-белок формирует комплекс не с отдельным ионом мышьяка, а с оксианионом мышьяка (AsO₂^-), в котором именно трехвалентный атом мышьяка формирует связи с цистеиновыми остатками в полипептидной цепи белка ArsR. После этого происходит транскрипция генов ars-оперона, а в биосенсоре — транскрипция lux-оперона, расположенного под контролем индуцируемого промотора гена arsR (ParsR).

В качестве источников тяжелых металлов (Cu²⁺; Zn²⁺) и мышьяка (AsO₂^-) использовали водные растворы солей: CuSO₄ (при конечной концентрации 8,85 мкг/мл); ZnSO₄ (150 мкг/мл); NaAsO₂ (4,5 мкг/мл). Все химические реактивы были аналитической чистоты.

Измерение экспрессии с промоторов генов copA, zntA и arsR при действии ЛОС

Биосенсоры растили в течение 17—18 ч на среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при 30 °C и перемешивании на качалке. Ночную культуру биосенсоров разводили в 100 раз (до концентрации ~10⁷ клеток/мл) в свежей среде LB без антибиотиков и доращивали при 30 °C и перемешивании (110 об./мин) в течение 2 ч. Далее культуру разливали по 7 мл в пробирки объемом 15 мл. В каждом случае в качестве фона использовали пробу без добавления ЛОС и солей CuSO₄, ZnSO₄ или NaAsO₂. Для оценки специфического влияния ЛОС на экспрессию с промоторов генов copA, zntA или arsR, ЛОС добавляли непосредственно в жидкую культуру в количествах, которые не подавляли или слабо подавляли рост клеток биосенсора. После добавления ЛОС в пробы пробирки плотно заматывали парафильмом (4 слоя, «ParafilmM» Pechiney Plastic Packaging Company», Чикаго, США) для предотвращения потерь летучих веществ.

К пробам, содержащим ЛОС, добавляли водные растворы указанных солей в случаях, когда требовалось оценить действие ЛОС на экспрессию с промоторов генов copA, zntA и arsR в условиях их индукции. Предобработка культуры ЛОС длилась в течение 30 мин с перемешиванием (300 об./мин) при комнатной температуре. В качестве положительного контроля были использованы пробы, содержащие клетки биосенсоров и водные растворы CuSO₄, ZnSO₄ и NaAsO₂.

Все пробы герметизировали парафильмом и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре и перемешивании (300 об./мин). Затем измеряли интенсивность биолюминесценции в 96-луночном планшете (8 лунок на каждый вариант пробы в объеме пробы, равном 200 мкл).

В каждом варианте все эксперименты повторяли не менее 3 раз.

Для определения количества клеток биосенсоров (КОЕ/мл) клетки высевали из соответствующих разведений на среду LA.

Результаты и обсуждение

Влияние ЛОС на экспрессию с промоторов генов copA, arsR и zntA

Значение биолюминесценции сенсора E. coli JM83/pCopA’::lux в контроле при действии CuSO₄ в отсутствие ЛОС в среднем было равно 4 000 000 относительных световых единиц (отн. ед.) (свечение сенсора возрастало ~в 26 раз по сравнению с фоновым уровнем) (рис. 2, а).

Значение биолюминесценции E. coli JM83/pZntA’::lux при действии ZnSO₄ в отсутствие ЛОС в среднем было равно 500 000 отн. ед. (свечение сенсора возрастало ~в 6,5 раз по сравнению с фоном) (см. рис. 2, б); количество клеток lux-биосенсора без добавления ЛОС и ZnSO₄ в среднем было равно 30·10⁷ КОЕ/мл, а при действии ZnSO₄ оно снижалось ~на 10%.

Значение биолюминесценции E. coli JM83/pArsR’::lux при действии NaAsO₂ в отсутствие ЛОС в среднем было равно 400 000 отн. ед. (свечение сенсора возрастало ~в 8 раз по сравнению с фоном) (см. рис. 2, в). Количество клеток lux-биосенсора без добавления ЛОС и NaAsO₂ в среднем было равно 25·10⁷ КОЕ/мл, при действии NaAsO₂ оно снижалось на 30—40%.

Из результатов, представленных на рис. 2, а и в, можно видеть, что 2-ундеканон (в количестве 30 мкмоль), 2-нонанон (10 мкмоль), 2-гептанон (20 мкмоль) и ДМДС (25 мкмоль) непосредственно не вызывают увеличения уровня биолюминесценции; напротив, имеется тенденция к ее небольшому снижению. Следовательно, действие этих ЛОС не приводит к активации экспрессии lux-оперона, находящегося под контролем промотора гена copA или arsR.

Рис. 2. Действие ЛОС на биолюминесценцию биосенсора: а) E. coli JM83/pCopA’::lux; б) E. coli JM83/pZntA’::lux; в) E. coliтJM83/pArsR’::lux. Здесь и на рис. 3: столбцы показывают уровень биолюминесценции репортерного штамма (относительные световые единицы) в % от контроля. ЛОС: 2-ундеканон — 30 мкмоль, 2-нонанон — 10 мкмоль, 2-гептанон — 20 мкмоль, 2-пентанона — 60 мкмоль, 2-пропанона — 200 мкмоль и ДМДС 25 мкмоль.

При действии указанных ЛОС на штамм JM83/pZntA’::lux не наблюдается заметного влияния на биолюминесценцию. Только в случае действия 2-пентанона (60 мкмоль) на этот биосенсор можно видеть некоторое увеличение экспрессии lux-репортера — уровень свечения сенсора возрастает приблизительно в 2 раза по сравнению с фоновым значением (см. рис. 2, б). Такая же тенденция наблюдается при действии 2-пентанона на биосенсор E. coli JM83/pCopA’::lux (см. рис. 2, а).

Влияние совместного действия ЛОС с CuSO₄, ZnSO₄ и NaAsO₂ на экспрессию с промоторов генов copA, arsR и zntA

Добавление CuSO₄ к культуре E. coli JM83/pCopA’::lux приводило к значительному увеличению экспрессии репортера lux-оперона, находящегося под контролем индуцируемого промотора гена copA (см. рис. 2, а, рис. 3, а). Было показано, что при совместном действии CuSO₄ и ЛОС выживаемость клеток биосенсора снижается в том же диапазоне, что и при действии только CuSO₄ (~на 30%). Таким образом, исследованные ЛОС не влияли на устойчивость клеток сенсора к последующему действию токсичных концентраций CuSO₄.

Рис. 3. Действие ЛОС с CuSO₄, ZnSO₄ и NaAsO₂ на биолюминесценцию биосенсора: а) E. coli JM83/pCopA’::lux; б) E. coli JM83/pZntA’::lux; в) E. coli JM83/pArsR’::lux.

При действии 2-пропанона (200 мкмоль) совместно с CuSO₄ не наблюдалось изменений в уровне биолюминесценции по сравнению с контролем (см. рис. 3, а). Присутствие в культуре сенсора 2-пентанона (60 мкмоль) приводило к некоторому увеличению биолюминесценции.

При действии 2-ундеканона (30 мкмоль) совместно с CuSO₄, биолюминесценция штамма E. coli JM83/pCopA’::lux уменьшалась ~на 50%, по сравнению с контролем (действие CuSO₄ без ЛОС) (см. рис. 3, а).

При совместном действии ДМДС (25 мкмоль), 2-гептанона (20 мкмоль) и 2-нонанона (10 мкмоль) с CuSO₄ биолюминесценция штамма E. coli JM83/pCopA’::lux уменьшалась ~на 40, 30 и 15% соответственно по сравнению с контролем (действие CuSO₄ без ЛОС) (см. рис. 3, а).

Добавление ZnSO₄ к культуре E. coli JM83/pCopA’::lux приводило к значительному увеличению экспрессии люциферазных генов, находящихся под контролем индуцируемого промотора гена zntA (см. рис. 2, б, 3, б).

При действии ЛОС совместно с ZnSO₄ биолюминесценция штамма E. coli JM83/pZntA’::lux уменьшалась ~на 60% (2-ундеканон), 35% (2-нонанон) и 25% (2-гептанон и ДМДС) по сравнению с контролем (действие ZnSO₄ без ЛОС) (см. рис. 3, б). Таким образом, после предварительной обработки культуры биосенсора этими ЛОС подавляется активация экспрессии генов lux-оперона, находящегося под контролем промотора гена zntA, при действии ZnSO₄.

Следует отметить, что при совместном действии 2-пентанона (60 мкмоль) с ZnSO₄, биолюминесценция штамма увеличивается на 80% по сравнению с действием ZnSO₄ без ЛОС. При совместном действии 2-пропанона (200 мкмоль) с ZnSO₄ не наблюдается изменений в уровне биолюминесценции по сравнению с контролем (см. рис. 3, б).

При действии ZnSO₄ и совместном действии 2-пентанона и 2-ундеканона с ZnSO₄ выживаемость клеток сенсора оставалась на уровне фона (контроль без добавления ЛОС и ZnSO₄) (данные не приводятся).

Полученные данные демонстрируют возможность специфического влияния 2-пентанона и 2-ундеканона — усиление или подавление активации транскрипции lux-оперона, находящегося под контролем промотора гена zntA, в ответ на последующее действие ZnSO₄.

Добавление NaAsO₂ к культуре E. coli JM83/pArsR’::lux приводило к значительному увеличению экспрессии генов lux-оперона, находящихся под контролем индуцируемого промотора гена arsR (см. рис. 2, в, рис. 3, в).

При действии 2-ундеканона (30 мкмоль), 2-нонанона (10 мкмоль), 2-гептанона (20 мкмоль) или ДМДС (25 мкмоль) совместно с NaAsO₂ биолюминесценция штамма E. coli JM83/pArsR’::lux уменьшалась на 40—50% по сравнению с контролем (действие NaAsO₂ без ЛОС). Интересно отметить, что при совместном действии 2-пентанона (60 мкмоль) или 2-пропанона (200 мкмоль) с NaAsO₂ не наблюдалось изменений в уровне биолюминесценции по сравнению с контролем (см. рис. 3, в).

Таким образом, в настоящей работе мы впервые исследовали влияние ЛОС на экспрессию с промоторов генов copA, zntA и arsR, отвечающих на стрессы, вызванные действием меди, цинка и мышьяка.

Используя специфические lux-биосенсоры, мы показали, что влияние ЛОС, синтезируемых бактериями, на экспрессию с промоторов генов copA, arsR и zntA разнонаправленно и зависит от их структуры. Большинство исследованных ЛОС в нормальных условиях роста не активирует экспрессию lux-репортера и, следовательно, экспрессию указанных генов. Из всех исследованных ЛОС только действие 2-пентанона (60 мкмоль) усиливало экспрессию lux-репортера, находящегося под контролем индуцируемого промотора гена zntA.

Наряду с этим совместное действие некоторых из исследуемых ЛОС с солями меди, цинка или мышьяка может приводить к модулированию (ингибированию или стимулированию) экспрессии с промоторов генов copA, zntA и arsR. Для ряда исследуемых ЛОС удалось показать, что данный эффект, по-видимому, специфичен, и не связан с непосредственным действием этих ЛОС на активность фермента люциферазы (данные не приводятся) и выживаемость клеток lux-биосенсоров. Так, например, при совместном действии 2-пентанона (60 мкмоль) с ZnSO₄ наблюдается синергический эффект их действия на экспрессию генов lux-оперона. Следовательно, действие этого ЛОС может приводить к усилению активации в клетке экспрессии гена zntA, отвечающего за системы защиты клеток от токсичных концентраций цинка, кадмия и свинца. Чем объясняется эффект, наблюдаемый при действии 2-пентанона, отличающийся от эффектов при влиянии других ЛОС кетонов, в настоящее время неясно.

При действии других ЛОС экспрессия с промоторов генов zntA и arsR в присутствии солей ZnSO₄ и NaAsO₂ соответственно снижалась. Снижение экспрессии lux-оперона с промотора гена copA наблюдалось при действии 2-ундеканона в присутствии CuSO₄.

Заключение

В настоящее время мы не можем однозначно объяснить, какие механизмы обусловливают эти эффекты. Можно предположить, что: 1) ЛОС действуют на регуляторные белки CueR, ArsR и ZntR, повреждая и/или изменяя их структуру, что ведет к изменению регуляции экспрессии контролируемых ими генов, в результате, например, изменения способности металл-связывающего домена этих белков взаимодействовать с соответствующими ионами; 2) ЛОС могут изменять проницаемость мембран клетки и/или влиять на белки-транспортеры ионов, таким образом приводя к повышению или понижению внутриклеточных концентраций токсичных соединений. Это в свою очередь может вызвать модуляцию экспрессии генов, отвечающих за системы защиты клеток от токсичных концентраций этих соединений. Дальнейшие эксперименты необходимы для более детального понимания молекулярных механизмов биологического действия ЛОС.

Финансирование. Работа частично финансировалась грантом РФФИ №18-34-00396-мол_а.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.