Аппликационный лазерный перенос наночастиц металлов на бактериальные биопленки

Бактериальная биопленка — сложноорганизованная форма существования бактерий, продуцирующих внеклеточный матрикс [1, 2]. Способность к образованию биопленок доказана у большинства микроорганизмов, различия заключаются лишь в степени выраженности процесса. Поиск современных средств борьбы с биопленками ведется в разных направлениях. За последние годы получены многочисленные экспериментальные данные, имеющие фундаментальное и практическое значение [3—6]. Наряду с традиционными и инновационными агентами появились нанотехнологические разработки, проявляющие бактерицидное действие, основанные на новых принципах, отчасти заимствованных из живой природы [7, 8]. Было показано, что благодаря плотной текстуре из нанопичков, крылья цикад обладают не только гидрофобными свойствами, но и механическим бактерицидным эффектом, повреждая мембраны бактерий остриями нанопичков («наномеханический эффект шипа»). Искусственные нанопичковые структуры, сформированные под действием лазерного излучения на поверхностях самых разных материалов — металлов, полупроводников, полимеров, в последние годы также показали высокую эффективность предупреждения образования биопленки на нанотекстурированных поверхностях [9, 10]. В основе бактерицидных свойств наночастиц лежат разные механизмы в зависимости от того, из каких материалов их получают. Химический состав, размер и дзета-потенциал больше всего влияют на антибактериальный эффект частиц. К сожалению, при длительной инокуляции (сутки и более) бактерии способны формировать биопленки практически на любой структурированной поверхности.

Большинство разрабатываемых традиционных и инновационных методов борьбы с бактериальными биопленками направлено на предупреждение (профилактику) формирования биопленок. На самом деле, особо актуальной задачей современной медицинской микробиологии является поиск средств борьбы против уже сформировавшихся бактериальных пленок.

Бактериальные штаммы. Клинические изоляты бактерий Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa из коллекции лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов ФГБУ НИЦЭМ им. Гамалеи.

Питательные среды: питательный LB-бульон («Difco», США).

Для приготовления питательного агара LB добавляли 1% агар.

Для получения бактериальных биопленок, ночную бульонную культуру бактерий разводили 1:100 в LB. Разведенную культуру вносили в пробирки с кусочками стекла размером 10×10 мм толщиной 1 мм. Инкубировали в термостате при 37 °C в течение 24 ч при покачивании 10 раз в 1 минуту, с углом наклона 4°.

Для разрушения биопленок использовали раствор ДНКазы в физиологическом растворе.

Металлические пленки (серебра, золота и меди) напылялись на пластиковую подложку методом магнетронного напыления в атмосфере аргона.

Перенос металлических пленок в виде наночастиц на бактериальные биопленки осуществляли с помощью волоконного наносекундного лазера HTF MARK (Булат) на ионах Yb3⁺ (длина волны: 1064 нм, длительность импульса на полувысоте: 120 нс, максимальная энергия в импульсе: 1 мДж, частота повторения импульсов до 80 кГц). Излучение фокусировалось гальвано-сканнером с фокусным расстоянием объектива 160 мм.

Образцы стекол с прикрепленными на их поверхности суточными бактериальными биопленками переносили на лазерное устройство и напыляли наночастицами серебра, меди и золота (см. рисунок).

Пластик с напыленной на него тонкой (≈120 нм) металлической (Au, Ag, Cu) пленкой подвергали воздействию лазерного излучения с энергией в импульсе: 0,2 мДж, частотой следования импульса: 20 кГц и скоростью сканирования: 1500 мм/с. Минимальный размер пятна фокусировки при этом составлял ≈80 мкм. Расстояние между мишенью и стеклом с биопленкой 2 мм. Излучение фокусировалось на пленке. Возникающий в результате абляции расплав из наночастиц отлетал от мишени и попадал на стеклянную подложку с бактериальной биопленкой, где в итоге образовывались скопления наночастиц. Прозрачная пластиковая подложка позволяет использовать для переноса наночастиц из металлической пленки относительно низкоинтенсивное импульсное лазерное излучение, слабо нагревающее эти наночастицы.

После переноса частиц стекла с бактериальными биопленками переносили в пробирки с физиологическим раствором ДНК-азы и интенсивно встряхивали на шейкере в течение 1 ч. Под воздействием ДНК-азы матрикс биопленки разрушается, но при этом клетки бактерий остаются невредимыми. Затем полученную суспензию титровали стандартным микробиологическим методом и для определения КОЕ (колония образующая единица) высевали на твердую питательную среду (см. таблицу).

При аппликационном лазерном переносе наночастиц серебра и меди на поверхность бактериальных биопленок патогенных микроорганизмов S. aureus и P. aeruginosa выявлена полная гибель живой суточной биопленки. При переносе золотых наночастиц и при воздействии лазера через пластиковую подложку без металлической пленки бактерицидного воздействия не выявлено. Эти результаты показывают, что бактерицидность не связана с воздействием лазера и температурой наночастиц металлов. По нашему предположению эффективность метода об-условлена свойствами наночастиц серебра и меди.

На данном этапе проводятся исследования по изучению бактерицидных свойств наночастиц Se, Si и Zn, перенесенных аппликационно лазерным методом на биопленки. Также ведутся работы по изучению цитотоксичности вышеперечисленных металлов и метода. Менее токсичные наночастицы металлов будут исследованы в экспериментах in vivo.

Предложенный нами способ позволяет повысить локальность, доступность и эффективность разрушения биопленки за счет бактерицидного эффекта металлических наночастиц при незначительном прямом лазерном воздействии на биопленку.

Работа поддержана грантом РНФ № 18−15−00220.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Толордава Э.Р. — e-mail: tolordava@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-9920-2432

Кудряшов С.И. — e-mail: genes 2007@yandex.ru

Настулявичус А.А. — e-mail: genes 2007@yandex.ru

Ионин А.А. — e-mail: genes 2007@yandex.ru

Романова Ю.М. — e-mail: genes 2007@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-8547-1711

Автор, ответственный за переписку:

Толордава Э.P. — e-mail: tolordava@yandex.ru

Как цитировать:

Толордава Э.Р., Кудряшов С.И., Настулявичус А.А., Ионин А.А., Романова Ю.М. Аппликационный лазерный перенос наночастиц металлов на бактериальные биопленки. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):192-195. https://doi.org/10.17116/molgen201937041