Современные представления о молекулярной эпидемиологии гонококковой инфекции основаны на использовании NG-MAST-генотипирования (от англ. — Neisseria gonorrhoeae Multi Antigen Sequence Typing) [1]. В основу данного подхода положено секвенирование внутренних вариабельных участков двух генов N. gonorrhoeae: porB, кодирующего белок поринового канала [2], и tbpB, кодирующего бета-субъединицу трансферринсвязывающего белка [3]. По результатам сравнения нуклеотидных последовательностей названных аллелей с вариантами, представленными в международной базе данных www. ng-mast.net, им присваиваются цифровые обозначения, комбинация которых определяет NG-MAST-тип, являющийся индивидуальной генетической характеристикой изучаемого штамма. В случае выявления ранее неизвестных последовательностей или новых комбинаций аллелей porB и tbpB сведения о них дополняются в базу данных с присвоением ранее неизвестному молекулярному типу очередного цифрового обозначения. Опыт NG-MAST-типирования популяций N. gonorrhoeae в крупных городах продемонстрировал его высокую дискриминирующую способность с возможностью отслеживания миграции возбудителя гонококковой инфекции по «сексуальным цепям» [4] и формирования генетически связанных кластеров, объединяемых этнической или сексуально-поведенческой общностью пациентов [5]. Другой аспект подобного анализа определяется контролем над распространением антибиотикорезистентных генотипов, достаточно четко ассоциированных с определенными NG-MAST-типами N. gonorrhoeae [6].

В Российской Федерации последовательные исследования эпидемиологии гонококковой инфекции с использованием метода NG-MAST генотипирования с начала XXI века проводятся в Архангельске [7—9]. Первое подобное наблюдение в 2004 г. заставило констатировать существенное разнообразие локальной популяции N. gonorrhoeae, представленной 40 различными сиквенс-типами, большинство из которых (1523—1536; 1539—1545) были описаны впервые [7]. В 2011 г. в меньшей по численности выборке было идентифицировано 29 сиквенс-типов, из которых только 6 (228, 285, 387, 1043, 1523 и 1544) обнаруживались в регионе ранее, а 11 (5042, 5742, 5825, 5852, 6213, 6234—6239) имели новые комбинации известных аллелей или неизвестные аллели porB- и tbpB-генов [8]. Результаты нашего недавнего исследования [9] вновь подтвердили сохранение выраженного генетического разнообразия популяции N. gonorrhoeae в Архангельске, существенно отличающейся от таковых в других субъектах Российской Федерации и характеризующейся присутствием ранее описанных и впервые выявленных сиквенс-типов с локальным характером распространения. При этом оценка накопленных данных наряду с возможностью интродукции новых молекулярных типов из других субъектов Российской Федерации и сопредельных государств вследствие активной миграции населения устойчиво приводила к заключению о происходящем de novo появлении принципиально новых NG-MAST-типов, хотя механизмы подобной генетической изменчивости N. gonorrhoeae до настоящего времени не анализировались. Не получили своего развития и представления об ассоциации между принадлежностью возбудителей гонококковой инфекции к определенным сиквенс-типам и их устойчивостью к антимикробным препаратам [8], в том числе в контексте предупреждения эпидемического распространения мультирезистентных штаммов N. gonorrhoeae, в соответствии с критериями ВОЗ [10], являющихся одним из ключевых приоритетов для междисциплинарных медико-биологических исследований.

В этой связи целью настоящей работы явилось использование метода NG-MAST-типирования для исследования генотипического разнообразия современной популяции N. gonorrhoeae в Архангельске с акцентом на выявление возможных механизмов его формирования, в том числе с учетом роли генетических детерминант резистентности к антимикробным препаратам в возникновении, накоплении и распространении новых сиквенс-типов возбудителя гонококковой инфекции.

Материалом для исследования явились 132 клинических изолята N. gonorrhoeae, полученных от пациентов с гонококковой инфекцией, проходивших лечение на базе ГБУЗ АО «Архангельский клинический кожно-венерологический диспансер» в 2014 г. (36 штаммов), 2015 г. (32 штамма) и 2016 г. (64 штамма). Первоначальное выделение микроорганизмов из образцов биологического материала (соскобы слизистой оболочки уретры, цервикального канала, шейки матки, прямой кишки) проводили на шоколадном агаре с добавлением 1% ростовой добавки ISOVitalex и 1% селективной добавки VCAT («Becton Dickinson», США). Выросшие колонии микроскопировали и исследовали с использованием оксидазного теста, после чего окончательную верификацию оксидазоположительных грамотрицательных диплококков осуществляли на анализаторе VITEK 2 Compact («bioMérieux», Франция) с использованием идентификационных NH-карт. Выделение тотальной ДНК из чистых культур N. gonorrhoeae проводили с использованием набора реагентов «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Россия).

Для амплификации внутренних вариабельных участков генов porB (490 б.п.) и tbpB (390 б.п.) использовали праймеры и протоколы, описанные в работах [1, 4]. Наличие продуктов амплификации подтверждали электрофорезом в 1% агарозном геле в присутствии бромистого этидия с визуализацией на трансиллюминаторе («Bio-Rad», США) при 310 нм. Амплифицированные ДНК-фрагменты обрабатывали экзонуклеазой I (20 ед./мкл) и щелочной фосфатазой (1 ед./мкл) («Fermentas», Латвия), после чего проводили второй раунд ПЦР с мечеными терминирующими нуклеотидами Big Dye Terminator v3.1 Sequencing RR-100 («Applied Biosystems», США). Продукты реакции анализировали на автоматическом секвенаторе ABI 3730XL Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США), после чего анализировали с использованием штатного программного обеспечения 3730 Data Collection v.3.0 и Sequencing Analysis 5.3.1. Определение известных и регистрацию новых нуклеотидных последовательностей фрагментов генов porB и tbpB, а также соответствующих им сиквенс-типов N. gonorrhoeae проводили с использованием базы данных www. ng-mast.net.

Идентификацию мутаций в хромосомных генах penA, ponA, rpsJ, gyrA, parC, кодирующих мишени для пенициллина, тетрациклина и фторхинолонов, проводили путем амплификации с последующей гибридизацией на гидрогелевом ДНК-чипе, содержащем иммобилизованные олигонуклеотиды, соответствующие диким и мутантным вариантам исследуемых генов. Для этого целевые фрагменты ДНК индивидуального штамма N. gonorrhoeae (3 мкл исходного образца) амплифицировали в мультиплексной ПЦР с использованием реакционной смеси (30 мкл), содержащей 3 мкл ПЦР-буфера, 3 мкл Taq-ДНК-полимеразы, 200 мкМ смесь дНТФ и 8 мкМ конъюгата флюоресцентного красителя и дУТФ. Количественное соотношение прямого и обратного праймеров в реакционной смеси составляло 1:10, что позволяло нарабатывать преимущественно одноцепочечные фрагменты, последовательности которых комплементарны последовательностям иммобилизованных зондов. Режим ПЦР: денатурация при 95 °C, 50 циклов по схеме 95 °С — 30 с, 64 °C — 30 с, 72 °C — 30 с и элонгация при 72 °C — 5 мин. Процедуру гибридизации ПЦР-продуктов проводили на ДНК-чипе, содержащем 21 ячейку с иммобилизованными олигонуклеотидами, а также контрольные ячейки с ковалентно связанным флюоресцентным красителем, используемым для вычисления интенсивности свечения ячеек после гибридизации [11]. Регистрацию и учет результатов исследования проводили с использованием оборудования ООО «Биочип-ИМБ» (Россия). Заключение об отсутствии или наличии исследуемых мутаций делали на основе сигнала флюоресценции гибридизующихся фрагментов с зондом, соответствующим ДНК дикого или мутантного типа.

Филогенетический анализ исследуемой популяции N. gonorrhoeae на основе сходства аллелей porB и tbpB проводили с использованием программы MEGA6 [12]. Для оценки значения мутаций антибиотикорезистентности в молекулярной эволюции N. gonorrhoeae использовали метод корреляционного анализа и критерий Вилкоксона—Манна—Уитни (U).

Секвенирование целевых генов у 132 штаммов N. gonorrhoeae, циркулировавших в Архангельск в 2014—2016 гг., позволило идентифицировать 44 варианта аллели гена porB и 21 вариант аллели гена tbpB, нумерация которых в системе NG-MAST приведена в обозначениях к филогенетической дендрограмме (рис. 1).

Среди наиболее многочисленных по числу штаммов NG-MAST-генотипов лидирующее положение занимали 807 (n=12), 1544 (n=13), 9476 (n=18) и 12 531 (n=10), стабильно обнаруживаемые в исследуемой выборке в течение 2014—2016 гг. При этом только сиквенс-тип 807 характеризовался значительной широтой распространения в других субъектах Российской Федерации [9], а также Белоруссии [13] и Казахстане [14], в то время как другие многочисленные сиквенс-типы имели исключительно локальное происхождение и распространение. В частности, NG-MAST-генотип 1544 был впервые описан в Архангельске в 2004 г. [7], 9476 — в 2013 г. [9], а 12531 — при проведении настоящего исследования; информация об иных регионах их обнаружения в доступных источниках отсутствует. На этом фоне другие молекулярные варианты N. gonorrhoeae имели значительно меньшую численность, встречались на протяжении только одного или двух лет проводимого исследования, причем более половины зарегистрированных сиквенс-типов (29 из 53) были представлены одиночными штаммами.

Полученные данные подтвердили представления о выраженной гетерогенности популяции N. gonorrhoeae в Архангельске, в том числе в значительной степени (43,2% от общего количества анализируемых штаммов) представленной новыми, ранее неизвестными генотипами. При этом сравнение результатов настоящего исследования с данными 2011 г. [8] свидетельствовало о сохранении только 7 из 29 ранее выявленных сиквенс-типов (387, 807, 1043, 1241, 1544, 1580 и 5042), соответствующие которым изоляты сформировали 26,5% от анализируемой выборки. Сравнение же данных 2004 г. [7] и 2014—2016 гг. позволило констатировать сохранение лишь 4 сиквенс-типов (387, 1043, 1534 и 1544), доля которых в анализируемой выборке снижалась до 12,9%. Тем самым результаты проведенного исследования указывали на объективный характер динамического обновления локальной популяции N. gonorrhoeae, сопровождающегося замещением «старых» генотипов возникающими de novo молекулярными вариантами возбудителя гонококковой инфекции.

С целью выявления возможных механизмов этого процесса нами был проведен филогенетический анализ популяции N. gonorrhoeae в Архангельске, который на основе степени подобия нуклеотидных последовательностей генов porB и tbpB объединил исследуемые штаммы в два крупных и один мелкий кластер с выделением ряда одиночных NG-MAST-типов (см. рис. 1). При этом первый крупный кластер (сиквенс-типы от 387 до 9499) дополнительно мог быть разделен на 6 геногрупп, в то время как второй (сиквенс-типы от 12 539 до 9480) был достаточно гомогенным, что в значительной степени объяснялось наличием у большинства из входящих в него штаммов 27 аллели гена tbpB. Полученную картину дополняли данные анализа генетических детерминант резистентности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам, неравномерно распределенных по ветвям дендрограммы и, в частности, отсутствующих внутри геногруппы, состоящей из сиквенс-типов 387—13459 или, напротив, обильно представленных внутри группы сиквенс-типов 2400—9499.

Полученный результат позволил предположить существование в анализируемой выборке генетически связанных сиквенс-типов, среди которых один (предшественник) являлся прародителем возникающего de novo молекулярного варианта в результате одиночного мутационного события. С целью проверки данного предположения было проведено сравнение нуклеотидных последовательностей близко кластеризуемых штаммов, где в качестве критерия родства выступало наличие только одной нуклеотидной замены в генах porB или tbpB при идентичности профиля мутаций в генах penA, ponA, rpsJ, gyrA и parC. В свою очередь в качестве предшественника в подобных парах считался первично выявляемый сиквенс-тип по номеру описания в системе NG-MAST и году обнаружения в локальной популяции N. gonorrhoeae.

Проведенный анализ позволил выявить чрезвычайно близкий характер генетического подобия у 9 пар или троек сиквенс-типов. Так, отличия между описанным в 2011 г. NG-MAST генотипом 5042 и новым сиквенс-типом 14 021 заключались только в одной нуклеотидной замене G338A в гене porB при идентичности гена tbpB 1052 и отсутствии значимых мутаций в генах-мишенях для антимикробных препаратов (см. таблицу). Впервые выявленный в 2004 г. и сохранившийся в локальной популяции до 2014 г. сиквенс-тип 1043 отличался от сиквенс-типа 12 540 только нуклеотидной заменой G65A с передачей образовавшемуся de novo молекулярному варианту N. gonorrhoeae аллели tbpB 25, а также мутаций ins345Asp в гене penA (устойчивость к пенициллинам) и Val57Met в гене rpsJ (устойчивость к тетрациклинам). Еще одним примером являются последовательно описанные в 2015 и 2016 гг. сиквенс-типы 12 524 и 13 454, объединяемые общностью аллели tbpB 812 и множественным профилем мутаций в генах penA (ins345Asp), ponA (Leu421Pro), rpsJ (Val57Met), gyrA (Ser91Phe, Asp95Gly) и parC (Ser87Arg) при наличии всего одной нуклеотидной замены C347T в гене porB.

С другой стороны, целый ряд NG-MAST-генотипов, в том числе отдельно кластеризуемые сиквенс-типы 21, 12 447, 12 530, 13 458 и 14 805, характеризовались наличием множественных генотипических отличий от прочих участников анализируемой выборки, а также ранее не выявлялись в Архангельске, что указывало на возможность их интродукции в локальную популяцию N. gonorrhoeae.

Соответственно результаты генотипического анализа возбудителей гонококковой инфекции, циркулирующих в Архангельске в 2014—2016 гг., свидетельствовали о трех возможных вариантах формирования разнообразия локальной популяции N. gonorrhoeae (рис. 2).

В завершение проведенного исследования была оценена роль мутаций антибиотикорезистентности в современной молекулярной эволюции N. gonorrhoeae по двум параметрам: 1) зависимость численности штаммов определенного NG-MAST-типа от присутствия в их геномах детерминант резистентности в генах penA, ponA, rpsJ, gyrA, parC; 2) особенности профиля мутаций резистентности в группах штаммов, реализующих различные стратегии существования в локальной популяции (стабильность, изменчивость, интродукция). При этом первый вариант анализа указывал на отсутствие статистической значимости (r= –0,0184; p>0,05) мутаций резистентности в определении широты распространения какого-либо определенного сиквенс-типа. В свою очередь значения критерия U_эмп для мутационных профилей в группах N. gonorrhoeae, сохраняющих стабильность генотипа, последовательно меняющих его при передаче по «сексуальным цепям» или привнесенных в локальную популяцию вследствие миграционных потоков, также находились в зоне незначимости (p>0,05).

Таким образом, результаты проведенного исследования позволили оценить современное генотипическое разнообразие возбудителей гонококковой инфекции в Архангельске в 2014—2016 гг. и при сравнении с ранее полученными данными 2004 и 2011 г. констатировать динамическое обновление локальной популяции N. gonorrhoeae. В рамках данного феномена впервые объективно продемонстрированы 3 возможных варианта формирования подобного разнообразия, наряду с интродукцией в локальную популяцию принципиально новых, ранее отсутствующих молекулярных типов, определяемых сохранением ограниченного количества стабильных генотипов, а также последовательной изменчивостью ряда из них при передаче по «сексуальным цепям». При этом в качестве движущей силы подобной генетической изменчивости может быть назван интенсивный окислительный стресс и связанный с ним мутагенез, являющиеся неотъемлемым элементом взаимодействия клеток N. gonorrhoeae с нейтрофильными фагоцитами [15]. Возникающие в результате этого нуклеотидные замены в генах, используемых в системе молекулярного типирования, формально описываются как новые NG-MAST-типы, однако полностью наследуют профиль детерминант резистентности исходного молекулярного типа. В то же время сами проанализированные детерминанты не играют заметной роли в возникновении, накоплении и распространении отдельных сиквенс-типов N. gonorrhoeae, наиболее вероятно — вследствие отсутствия «селективного давления» пенициллинов, тетрациклинов и фторхинолонов, с начала 2000-х годов выведенных из схем терапии гонококковой инфекции и с успехом замененных цефалоспоринами III поколения (цефтриаксоном).

Исследование выполнено в рамках Государственного задания № 056−00015−18−00 ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России. Анализ мутационного профиля антибиотикорезистентности проведен при поддержке гранта РНФ № 17−75−20039.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для корреспонденции: Дерябин Дмитрий Геннадьевич, д.м.н., проф., заведующий отделом лабораторной диагностики ИППП и дерматозов ФГБУ ГНЦДК Минздрава РФ; 107076, Москва, Россия;
e-mail: deryabin@cnikvi.ru