Введение
Индуцируемый гипоксией фактор (HIF) выполняет в клетке функцию кислородного сенсора и инициатора каскада метаболических реакций, позволяющих приспосабливаться к недостатку кислорода. Исследователи данного биологического феномена в 2019 г. были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине [1].
HIF представляет собой гетеродимерный комплекс, состоящий из неустойчивой к кислороду субъединицы HIFα (HIF1α, либо HIF2α) и конститутивной субъединицы HIF1β. В присутствии кислорода HIF1α и HIF2α гидроксилируются специфическими пролилгидроксилазами (PHD), облегчая их связывание с белком фон Гиппеля—Линдау, убиквитинирование и дальнейшую протеасомную деградацию. Второй уровень кислородного контроля обеспечивается фактором, ингибирующим HIF (FIH), который гидроксилирует консервативный остаток аспарагина в субъединицах HIFα, блокируя дальнейшую ассоциацию HIF с p300/CREB-связывающим белком-коактиватором, необходимую для начала транскрипции генов-мишеней.
В условиях недостатка кислорода активность ферментов PHD и FIH ингибируется, что приводит к стабилизации и транслокации HIFα в ядро, где происходит гетеродимеризация с субъединицей HIF1β и активируется транскрипция нескольких сотен генов, участвующих в адаптации к гипоксии. Ранее высказана гипотеза, что неадекватные сдвиги регуляции активности HIF являются общим ключевым звеном онкогенной трансформации и метаболического перепрограммирования для всех канцерогенных воздействий [2].
Хотя функции HIF1α и HIF2α частично перекрываются, эти две субъединицы играют разные роли во многих физиологических и патологических состояниях [3]. Повышенная экспрессия белка HIF1α обладает прогностической ценностью в качестве биомаркера у пациентов с солидными опухолями [4] и онкогематологическими заболеваниями, такими как острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) [5], острый лимфолейкоз (ОЛЛ) [7], миелодиспластические синдромы [8] и мантийно-клеточная лимфома [9]. С другой стороны, HIF1α слабо экспрессируется в большинстве других злокачественных лимфом [10].
Значение изоформы HIF2α в онкопатологии исследовано гораздо меньше. Если экспрессия HIF1α увеличивается при глубокой острой гипоксии (<0,1% O2), то HIF2α экспрессируется при длительной легкой гипоксии (<5% O2) [11]. Показано, что накопление HIF2α при продолжительной гипоксии в опухолевых клетках определяет более агрессивное течение онкологического заболевания [12]. Также обнаружен разнонаправленный сдвиг соотношения экспрессии HIF1α и HIF2α в опухолевых клетках и клетках микроокружения, что определяет качественно иные метаболические отношения между нормальными и трансформированными клетками: злокачественный клон индуцирует аутофагию в окружающих клетках, используя высвобождающиеся метаболиты для обеспечения своей пролиферативной активности [13].
Данные о роли HIF1α в патогенезе хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) немногочисленны. Показано, что экспрессия HIF1α обнаружена в лейкемических клетках не только в условиях гипоксии, но и в условиях нормоксии, что способствует пролиферации и торможению апоптоза в опухолевых клетках [14]. Высокая экспрессия мРНК HIF1A в мононуклеарных клетках предсказывает низкую общую выживаемость у пациентов с ХЛЛ и при этом прогностическое значение мРНК HIF1A не зависит от других известных клинико-патологических факторов [15].
Вместе с тем продемонстрировано, что изолированные от пациентов с мутацией TP53 (опухолевый протеин P53) клетки В-клеточного ХЛЛ (В-ХЛЛ) имеют конститутивно более высокие уровни экспрессии белка HIF1α и повышенную транскрипционную активность гена HIF1A. Гипоксия и контакт с клетками микроокружения дополнительно усиливают накопление HIF1α независимо от статуса TP53. При этом более высокие уровни мРНК HIF1A коррелируют с более низкой восприимчивостью лейкозных клеток к спонтанному апоптозу и связаны с устойчивостью к флударабину [16]. Данных об исследовании уровня экспрессии при ХЛЛ другой изоформы субъединицы — HIF2a в доступной литературе не обнаружено.
К перспективным маркерам, отражающим особенности патохимии опухолевого процесса, относятся также и микроРНК. Одна из таких молекул — микроРНК hsa-miR-155-5р (miR-155) — играет важную роль в дифференцировке гемопоэтических клеток, регуляции иммунного ответа, в патогенезе опухолевого роста и развитии сердечно-сосудистых осложнений [17]. Использование интерферирующих с miR-155 «антисмыловых» молекул предлагается в качестве противоопухолевых препаратов [18]. Проонкогенный потенциал miR-155 может определяться, в том числе и дисбалансом транскрипционных факторов HIF1α и HIF2α за счет избирательного ингибирования мРНК HIF1A [19]. Дезрегуляция miR-155 вовлечена в канцерогенез при развитии лимфом [20]. На мышиных моделях показано, что повышение miR-155 в В-лимфоцитах ассоциировано с развитием экспериментальных моделей острого лимфобластного лейкоза и лимфом [21]. В ряде исследований показано, что уровень miR-155 был значительно увеличен также и в клетках крови у пациентов с ХЛЛ по сравнению с группой доноров [22]. Обнаружена ассоциация miR-155 с делецией 17-й хромосомы [23]. Более низкие значения экспрессии miR-155 наблюдали у пациентов с трисомией 12 хромосомы и делецией 13-ой, в сравнении с пациентами, имеющими делецию 11 хромосомы или нормальный кариотип [24]. Ранее нами также было описано повышение уровня miR-155 в венозной крови при хронических миелопролиферативных новообразованиях и ХЛЛ [25].
Значения экспрессии мРНК гена HIF1α, лейкоцитоза и процентного содержания лимфоцитов у пациентов с ХЛЛ, получающих терапию.
Наша исходная гипотеза в настоящем исследовании заключалась в том, что одним из механизмов вовлечения miR-155 в патогенез ХЛЛ может являться сдвиг соотношения между активностью генов HIF1A и HIF2A за счет избирательного подавления этой микроРНК экспрессии преимущественно одной изоформы фактора — HIF1α. Параллельное определение уровня мРНК HIF1A и HIF2A, а также исследование их взаимосвязи с уровнем miR-155 у пациентов с ХЛЛ ранее не проводилось.
Цель данного исследования — определить уровень экспрессии мРНК HIF1A, HIF2A и miR-155 в венозной крови у пациентов с ХЛЛ.
Материал и методы
В работе были использованы анонимные образцы венозной крови пациентов. Контрольная группа включала 51 пробу доноров крови 22 мужчин и 29 женщин, в возрасте от 19 до 58 лет, медиана возраста 23 года. Всего в исследование было включено 42 пробы пациентов с ХЛЛ. Диагноз и стадию заболевания определяли в соответствии с действующими клиническими рекомендациями. Из всех пациентов с ХЛЛ 17 получали терапию на момент проведения анализа. В табл. 1 представлена информация о контрольной и исследуемых группах.
Таблица 1. Характеристика пациентов с ХЛЛ
| Всего пациентов | 42 |
| Муж/жен | 37/6 |
| Возраст, Me (мин.—макс.) | 63 (43—79) |
| Стадия заболевания A | 7 |
| B | 21 |
| C | 14 |
| Получают терапию на момент исследования, в том числе | 17 |
| ибрутиниб | 5 |
| RB | 1 |
| FCR | 9 |
| R-CHOP | 1 |
| R-BAC | 1 |
| Пациенты без терапии на момент исследования | 25 |
Примечание. RB — ритуксимаб и бендамустин; FCR — флударабин, циклофосфан и ритуксимаб; R-CHOP — ритуксимаб, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин и преднизолон, R-BAC — ритуксимаб, бендамустин и цитарабин
1. Определение уровня мРНК HIF1A и HIF2A.
Пробы венозной крови собирали в вакуумные системы для взятия крови с раствором стабилизатора РНК (ООО «Формула гена», Россия). Выделение РНК осуществляли из лейкоцитов крови с использованием набора реагентов «Рибо-золь-D» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Уровень мРНК HIF1A и HIF2A определяли методом ПЦР-РВ, разработанным в лаборатории Красноярского филиала ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России. Для дизайна праймеров и зондов использовали программу Primer3. Амплификацию проводили в 25 мкл смеси, содержащей: 100 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 0,5 М KCl, 0,8% Nonidet P-40, 2 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из дНТФ, 10 мкл кДНК, по 0,3 мкМ праймеров и TaqMan зонда, 1 единицу активности SynTaq ДНК-полимеразы (ООО «НПО Синтол», Россия). ПЦР-РВ проводили на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США), используя следующую программу амплификации: предварительный прогрев при 95 °C — 5 мин, далее 50 циклов: 95 °C — 15 с, 60 °C — 60 с, которая была предварительно оптимизирована для используемых праймеров и зондов. Детекцию флуоресцентного сигнала осуществляли по каналам FAM и HEX. В качестве контрольного гена использовали ген ABL1. Расчет количества копий мРНК в пробе проводили по калибровочному графику с использованием стандарта, охарактеризованного с помощью цифровой ПЦР. Уровень экспрессии мРНК генов HIF выражали в виде десятичного логарифма количества копий на 10 000 копий гена ABL1.
2. Определение уровня микроРНК miR-155.
Взятие венозной крови для данного исследования осуществлялось параллельно в отдельные вакуумные системы с ЭДТА. Выделение микроРНК осуществляли из лейкоцитов крови с использованием микроколонок. Обратную транскрипцию проводили с использованием специфического к hsa-miR-155-5p петлевого праймера [27]. ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) проводили на приборе CFX96 (BioRad) как описано ранее [24]. цикла.
3. Статистическая обработка результатов.
Аналитическую вариацию используемых методов вычисляли путем измерения экспрессии исследуемых генов в 10 аналитических сериях по формуле: коэффициент вариации (CV) = (Стандартное отклонение/Среднее) х 100. CV метода не превышала 9% и 3% при измерении уровня мРНК HIFA и miR-155 соответственно. Все пробы анализировали в дублях.
Сравнение количественных значений между независимыми группами осуществляли с использованием непараметрического критерия Манна—Уитни, результаты считали статистически значимыми при значении p<0,05. Для анализа корреляции использовали метод Спирмена. Использовался пакет программ Statistica 12.0.
Результаты
Результаты определения мРНК генов HIFA и микроРНК miR-155 представлены в табл. 2.
Таблица 2. Уровень экспрессии мРНК HIF1A и HIF2А в пробах крови со стабилизатором РНК, а также экспрессия miR-155 в лейкоцитарной фракции крови. Приведены значения медианы и квартилей (Me (С25—С75)).
| Группы сравнения | HIF1A | HIF2A | miR-155 |
| Контроль | 2,65 (2,47-2,82) | 2,66 (2,36-3,77) | 0,74 (0,28-1,5) |
| Пациенты с ХЛЛ, без терапии: лейкоциты 34,7 (13,97—119,75) ×109/мл | 1,9 (0,88-2,35) | 1,2 (0,55-1,99) | 2,72 (0,36-6,9) |
| Значимость отличий с группой контроля, р | 0,0002 | 0,0001 | 0,005 |
| U (Z) | 122,0 (4,29) | 142,0 (3,95) | 474,0 (2,75) |
| Пациенты с ХЛЛ, получающие терапию, в том числе | |||
| 11 пациентов с гематологическим ответом на терапию: лейкоциты 5,1 (3,5—5,4) ґ109/мл | 1,8 (1,57-2,42) | 0,88 (0,65-1,35) | 0,88 (0,43-5,89) |
| Значимость отличий с группой пациентов без терапии, р | 0,97 | 0,53 | 0,45 |
| U (Z) | 129 (-0,03) | 112 (0,6) | 108 (0,76) |
| Значимость отличий с группой контроля, р | 0,0004 | 0,00005 | 0,9 |
| U (Z) | 24 (3,5) | 10 (4,0) | 212 (0,08) |
| 6 пациентов без ответа на терапию: лейкоциты 44,06 (19,98—99,93) ×109/мл | 1,89 (1,62-2,18) | 1,2 (1,06-2,22) | 2,12 (1,23-4,57) |
| Значимость отличий с группой пациентов без терапии, р | 0,84 | 0,74 | 0,78 |
| U (Z) | 82 (-0,19) | 79 (-0,32) | 80 (-0,28) |
| Значимость отличий с группой контроля, р | 0,001 | 0,02 | 0,02 |
| U (Z) | 13 (3,1) | 30 (2,3) | 59 (2,32) |
На нашей выборке у пациентов с ХЛЛ выявлено статистически значимое снижение уровней мРНК HIF1A и HIF2A, которое не зависело от используемой терапии. Подтвержден факт повышения уровня miR-155 в цельной крови у пациентов, не начавших терапию ХЛЛ, по сравнению с контрольной группой. При этом у получающих терапию пациентов уровень miR-155 приближался к контрольным значениям. Слабая обратная корреляционная зависимость определялась у пациентов ХЛЛ между уровнем значений мРНК HIF1A и miR-155 (r= –0,51; p=0,03). Статистически значимой корреляции между мРНК HIF2A и miR-155 не выявлено.
Обсуждение
В нашем исследовании у пациентов с ХЛЛ подтвержден факт повышения уровня miR-155 [25], но в отличие от результатов [15] мы наблюдали не повышение, а снижение экспрессии HIF1A.
В своем исследовании [15] авторы использовали выделенные мононуклеарные клетки, а мы — пробы цельной крови, полученные в стабилизатор, ингибирующий РНК-зы, и таким образом сохраняющие исходные уровни мРНК HIF1А. Известно, что хранение крови и манипуляции с клетками довольно быстро влияют на внутриклеточной уровень HIFα и кислородзависимую экспрессию генов [28]. Поэтому такие данные скорее свидетельствуют о разной реакции уровня РНК на процедуру выделения и замораживания-размораживания, чем об их исходном уровне в клетках крови.
Следует также учитывать, что в публикациях чаще сообщается об увеличении в лейкозных клетках количества белковых молекул HIFα, уровень которых зависит не только от интенсивности экспрессии гена, но и от активности гидроксилирования и катаболизма белков HIFα. Поскольку гипоксия повышает уровень белка HIFα, а соответствие между уровнем мРНК и продуктов белкового синтеза за счет отрицательных обратных связей не всегда однозначное, факт выявления повышенного уровня белка HIFα не противоречит наблюдаемой нами сниженной экспрессии мРНК этого гена.
Обнаруженные нами разнонаправленные сдвиги мРНК HIF1A и miR-155 соответствуют гипотезе о патогенетической роли этой микроРНК при ХЛЛ, за счет того, что ее повышенный уровень связывает мРНК HIF1A и сдвигает баланс в сторону HIF2А [19]. Вероятно, при этом может быть реализован механизм, описанный ранее в клетках тринегативного рака молочной железы за счет регуляторной петли ингибирования синтеза белка фон Гиппеля-Линдау [17]. Выявленная обратная корреляционная связь между мРНК HIF1A и miR-155 хотя довольно слабая, но тем не менее статистически значима (r= –0,51; p=0,03), также косвенно поддерживает нашу гипотезу.
Вместе с тем мы не обнаружили ожидаемой обратной корреляции между индивидуальными уровнями мРНК изоформ HIFα и увеличения экспрессии HIF2A, наоборот в пробах крови пациентов с ХЛЛ она также снижается, правда при этом отсутствует корреляция с miR-155.
Полученные данные не отвергают исходную гипотезу, поскольку популяция клеток венозной крови, в том числе и онкотрансформированных клеток ХЛЛ весьма гетерогенна, и не во всех из них уровень и вклад miR-155 в регуляцию HIFα единообразен. Однозначное подтверждение нашей гипотезы можно было бы получить используя технологии витальной оценки транскриптома отдельных клеток.
Заключение
Впервые проведено параллельное исследование уровня экспрессии мРНК HIF1A, HIF2 α и miR-155в венозной крови у пациентов с ХЛЛ. Уровни мРНК обоих изоформ HIFα были значимо ниже у пациентов с ХЛЛ и не коррелировали с уровнем лейкоцитов или стадией заболевания. При этом уровень микроРНК miR-155 был повышен у пациентов до назначения терапии и снижался при достижении гематологического ответа. Между уровнем miR-155 и мРНК HIF1A, но не HIF2A, наблюдалась слабая обратная корреляционная связь (r= –0,51; p=0,03), что согласуется с известным антагонизмом между этими РНК. Хотя феномен антагонизма miR-155 и мРНК HIF1A не является определяющим фактором дисбаланса изоформ HIFα на уровне суммарной популяций лейкоцитарных клеток венозной крови, полученные данные подтверждают важность поиска диагностического значения показателей соотношения их экспрессии в отдельных популяциях лейкозных клеток как потенциальных диагностических маркеров.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Авторы подтверждают, что статья или ее части ранее не были опубликованы.