Введение

Механизмы взаимодействия SARS-CoV-2, возбудителя новой коронавирусной инфекции (НКИ), и макроорганизма, формирование постинфекционного и поствакцинального иммунитета при встрече с антигенами вируса в настоящее время являются предметом ожесточенных дискуссий не только на страницах научных журналов и в ходе медицинских научно-практических конференций, но и в средствах массовой информации, социальных сетях и на лавочках у подъездов.

В начале пандемии, когда появились первые тест-системы для определения антител, предполагалось, что серологическое тестирование будет иметь диагностическое значение (по образцу исследования антител к возбудителям других вирусных инфекций). Кроме того, надеялись, что те, у кого есть антитела, скорее всего, будут невосприимчивы к повторному заражению, по крайней мере, временно, что позволит им вести привычный образ жизни, не подвергая себя или других риску. Появилась даже концепция «иммунного паспорта» («immunity passport» или «risk-free certificate»), который давал бы право тем, кто имеет определенный уровень антител, путешествовать или вернуться на работу, так как они считались бы защищенными от повторного инфицирования [1]. Но «корреляты защиты» остаются неизвестными, до сих пор нет однозначных ответов на вопросы [2]:

— Какие специфические антитела защищают от инфекции/реинфекции SARS-CoV-2?

— Какой уровень антител следует считать достаточным?

— Как долго будет сохраняться протективный иммунитет?

После появления вакцин и активной вакцинации населения к ним добавились:

— Может ли тестирование на антитела быть полезным для оценки эффективности поствакцинального иммунитета?

— Какой уровень антител указывает на необходимость ревакцинации?

Поэтому в настоящее время большинство зарубежных регуляторных органов не рекомендует рутинное обследование на наличие антител к возбудителю COVID-19.

Центр по контролю и профилактике заболеваний США (The Centers for Disease Control and Prevention (CDC)):

— «CDC не рекомендует использовать тестирование на антитела для диагностики текущей инфекции. В зависимости от времени инфицирования и времени проведения исследования, тест может не обнаружить антител у человека с текущей инфекцией» [3].

— «Тестирование на антитела в настоящее время не рекомендуется для оценки иммунитета к SARS-CoV-2 после вакцинации, для оценки необходимости вакцинации у невакцинированного человека или для определения необходимости карантина после тесного контакта с человеком, у которого есть COVID-19» [4].

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (The U.S. Food and Drug Administration (FDA)):

— «Результаты разрешенных в настоящее время к применению тестов на антитела к SARS-CoV-2 не должны использоваться для оценки уровня иммунитета или защиты человека от COVID-19 в любое время, и особенно после того, как человек получил вакцинацию против COVID-19» [5].

Международная федерация клинической химии и лабораторной медицины (The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC)):

— «Существует настороженность по поводу использования серологического тестирования в острой фазе инфекции, поскольку они (антитела) обнаруживают инфекцию слишком поздно (не ранее чем через 7—10 дней), также возможны перекрестные реакции с серологическим ответом на сезонные коронавирусы, кроме того, скорость и кинетика серологического ответа до сих пор четко не определены» [6].

ВОЗ более осторожна в своих рекомендациях: «Современные знания не говорят нам о продолжительности иммунитета и защиты от повторного заражения, но последние данные свидетельствуют о том, что естественная инфекция может обеспечить такую же защиту от симптоматического заболевания, как вакцинация, по крайней мере, в течение доступного периода наблюдения» [7].

Временные методические рекомендации Минздрава России «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)», начиная с версии 6 (от 28.04.20) [8], содержат раздел по выявлению иммуноглобулинов (Ig) к SARS-CoV-2. И если в 7-й версии (от 03.06.20) было указано: «Рекомендуется проводить тестирование всех пациентов, поступающих в медицинские организации для оказания плановой медицинской помощи, на наличие IgM и IgG к SARS-CoV-2 с помощью зарегистрированных экспресс-тестов» [9], то начиная с 8-й версии (03.09.20) — «Выявление антител к SARS-CoV-2 имеет вспомогательное значение для диагностики текущей инфекции и основное для оценки иммунного ответа на текущую или перенесенную инфекцию» [10]. Особо следует отметить, что, начиная с версии 12 (21.09.21) [11], определение иммуноглобулинов к SARS-CoV-2 более не рекомендуется «для выявления лиц с бессимптомной формой инфекции и при обследовании групп риска и проведении массового обследования населения для оценки уровня популяционного иммунитета».

Из вышеизложенного следует, что в существующих в настоящее время российских и зарубежных рекомендациях целесообразность определения антител к SARS-CoV-2 однозначно не определена. Во многом это определяется строением вируса, спецификой иммунного ответа на возбудитель и разнообразием разработанных тест-систем (по классам определяемых иммуноглобулинов и их специфичности).

Наибольший интерес при изучении иммунного ответа на SARS-CoV-2 представляют антигены нуклеокапсида (N) и Spike-белка (S) [4, 12, 16, 17]. Белок S содержит две субъединицы — S1 и S2. Субъединица S1 содержит так называемый рецептор-связывающий домен (RBD), который, как предполагается, опосредует связывание вируса с восприимчивыми клетками. Именно антитела к RBD сейчас принято считать нейтрализующими [12]. Антитела, включая IgM, IgG и IgA, против S и его субъединиц могут быть обнаружены в сыворотке в течение 1—3 нед после заражения и возникать почти одновременно. Далее IgM достигает пика своей концентрации в среднем к 3-й неделе после появления симптомов и не определяется у большинства переболевших, начиная с 7-й недели [13]. Клиническое значение измерения сывороточного IgA при инфекции SARS-CoV-2 неизвестно [4]. Антитела IgG против белков S и N сохраняются у большинства людей, по меньшей мере, в течение нескольких месяцев, но однозначного ответа о продолжительности времени, в течение которого антитела сохраняются после заражения, в настоящее время нет [4].

Таким образом, в настоящее время нет консенсуса о роли и месте определения антител к SARS-CoV-2 для диагностики COVID-19. Поэтому целью нашей работы было на основании опыта практической лаборатории оценить значимость серологического тестирования при новой коронавирусной инфекции COVID-19 у пациентов в зависимости от клинической ситуации.

Материал и методы

Вид исследования: ретроспективное наблюдательное.

За период с сентября 2020 г. по сентябрь 2021 г. в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «ЦКБ с поликлиникой» было выполнено серологическое тестирование на наличие антител к антигенам SARS-CoV-2 у 8955 пациентов. Для проведения исследования были отобраны группы пациентов в зависимости от клинического статуса. Характеристика выборок представлена в табл. 1.

Таблица 1. Группы пациентов, обследованных на антитела к антигенам SARS-CoV-2

Для определения антител использовали коммерчески доступные тест-системы, разрешенные к использованию на территории Российской Федерации в установленном порядке (табл. 2).

Таблица 2. Тест-системы для выявления антител к возбудителю новой коронавирусной инфекции

Исследования выполнялись на автоматическом иммуноферментном анализаторе Lazurite («Dynex Texnologies», США).

У пациентов, госпитализированных в стационар, с целью диагностики COVID-19 проводилось раздельное тестирование на антитела класса IgM и IgG, а также мониторинг появления антител в динамике (детекция сероконверсии) — повторное тестирование при отрицательном результате через 5—7 дней. Таким образом, тестирование на антитела выполнялось на 5—7-й и 12—14-й дни после положительного результата мазка из носа/зева методами амплификации нуклеиновых кислот (ОТ-ПЦР).

Определение IgG к антигенам S и S1 белка перед вакцинацией у амбулаторных пациентов проводилось однократно по назначению врача-инфекциониста.

Среди наблюдаемых в динамике после перенесенного COVID-19, были отобраны группы пациентов, которые сдали кровь однократно на 6—8-м или 10—12-м месяце после инфицирования. Пациентов распределили в две группы в зависимости от даты серологического тестирования, что было единственным критерием формирования выборок. Степень тяжести заболевания не учитывалась. Выборки не перекрывались. Пациенты, имеющие результаты определения антител через как 6—8, так и 10—12 мес, из исследования были исключены. Всего было 135 человек (в группе «6—8 мес» — 71, в группе «10—12 мес» — 64). Половозрастной состав групп был сопоставим.

Для обработки полученных данных использовали методы описательной статистики, для проверки нормальности распределения — критерий Шапиро—Уилка, для оценки различий между двумя независимыми выборками — U-критерий Манна—Уитни.

Результаты

Серологическое обследование пациентов, госпитализированных с диагнозом «коронавирусная инфекция, вызванная вирусом COVID-19»

В лаборатории клинической иммунологии рутинное обследование пациентов проводилось с определением антител класса IgM к антигенам N и S белков и IgG к антигенам S и S1 белка в качественном формате с указанием коэффициента позитивности (КП). Проведен анализ выявляемости антител у пациентов стационара с диагнозом COVID-19 на 5—7-й день после положительного результата ПЦР-исследования. Из них 98 пациентов наблюдались в динамике с повторным определением антител на 12—14-й день после положительного результата ПЦР. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Частота выявления иммуноглобулинов разных классов к антигенам SARS-CoV-2 на 5—7-й и 12—14-й дни после ПЦР+

Данные таблицы показывают, что на 5—7-й день после положительного ПЦР мазка из носа/зева у большинства (496 (72%)) пациентов определялись антитела к SARS-CoV-2, преимущественно одновременно IgM и IgG. У 109 (18%) пациентов никакие антитела обнаружены не были. К 12—14-му дню процент больных, у которых отсутствовал гуморальный иммунный ответ, снизился незначительно — до 14%. У 8 пациентов на 12—14-й день антитела IgG так и не выявлялись.

Кроме этого, 18 пациентам выполнено исследование динамики иммуноглобулинов M и G на 2—5, 5—7, 12—14 и 21-й дни после ПЦР+.

Предварительно, чтобы доказать возможность использования КП как суррогатного маркера изменения концентрации антител, определен коэффициент вариации (CV%) КП при использовании одинаковых тест-систем. Было отобрано 20 образцов сыворотки с разными значениями КП IgM и IgG, которые тестировались трижды в разных постановках. CV% на диапазоне КП от 1,1 до 15 составил для IgG к S и S1 7% [95 ДИ: 2,0—9,0], IgM к N и S — 7% [95 ДИ: 3,0—14,2], на диапазоне <1,1 — 34% [95 ДИ: 22,1—43,9] и 21% [95 ДИ: 8—37,2] соответственно.

Динамика появления антител у этих 18 пациентов существенно различалась. От классического иммунного ответа, когда первыми появляются антитела класса M с последующим нарастанием количества IgG, до обратной ситуации, где первыми определяются иммуноглобулины класса G. Примеры кинетики появления антител с 2-го по 21-й день для 4 пациентов представлены на рис. 1.

Рис. 1. Временная шкала кинетики IgM и IgG во время инфекции SARS-CoV-2 у пациентов, госпитализированных с диагнозом COVID-19.

Следует отметить, что у 5 из 18 пациентов антитела к антигенам SARS-CoV-2 не определялись и на 21-й день после ПЦР+.

Полученные нами данные свидетельствуют, что гуморальный иммунный ответ у пациентов, госпитализированных с установленным диагнозом НКИ, отличается значительной гетерогенностью. В рамках нашего исследования не получено подтверждения клинической информативности определения иммуноглобулинов M и G для диагностики инфицирования вирусом SARS-CoV-2.

Плановое серологическое обследование перед вакцинацией

В период с января по апрель 2021 г. в рамках подготовки к вакцинации были обследованы 454 амбулаторных пациента. Согласно данным медицинской документации, эти пациенты не имели подтвержденного (клинически или по результатам ПЦР) случая инфицирования вирусом SARS-CoV-2. Иммуноглобулины класса IgG к антигенам S и S1 белка (тест-система SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ) были выявлены у 159 человек, что составило 35% от всех обследованных. Это коррелирует с данными Роспотребнадзора [14]: на 10 ноября 2020 г. по результатам ПЦР тестирования количество контактных бессимптомных случаев выявления возбудителя новой коронавирусной инфекции составило 31%.

Отдельно следует отметить выявление 12 человек, которые имели положительный результат на IgM к антигенам N и S белков (диапазон КП составил от 0,9 до 4,6) и отрицательный результат на IgG к нуклеокапсиду и Spike белку. При последующем обследовании РНК вируса SARS-CoV-2 и возбудителей сезонных ОРВИ не обнаружена и в анамнезе отсутствовали данные о контакте с инфицированными SARS-CoV-2. Дальнейшее мониторирование иммуноглобулинов IgM к антигенам N и S и IgG к антигенам S и S1 в течение 3 мес показало отсутствие динамики КП по IgM и отрицательный результат IgG. Данная ситуация была расценена как присутствие в сыворотке крови этих пациентов перекрестно реагирующих антител неизвестной этиологии [15, 16].

Оценка динамики постинфекционного иммунитета

Длительность постинфекционного иммунитета была оценена на выборке из 135 пациентов с подтвержденным положительным ПЦР-тестом на РНК SARS-CoV-2. Было выбрано два целевых временных интервала: 6—8 и 10—12 мес после ПЦР+. Определение антител IgG к антигенам S и S1 белка выполнялось с использованием наборов SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ количественный с представлением результатов в BAU/ml. Диапазон концентрации антител был от 1 до >200 BAU/ml. Было рассчитано среднее значение концентрации антител и определен межквартильный размах. Полученные данные представлены в табл. 4 и на рис. 2.

Таблица 4. Динамика постинфекционного иммунитета через 6—8 и 10—12 мес у пациентов перенесших COVID-19

Примечание. IQR — межквартильный размах.

Рис. 2. Распределение пациентов по диапазонам концентраций IgG (BAU/ml) через 6—8 и 10—12 мес после инфицирования SARS-CoV-2.

Из диаграммы видно, что концентрация антител в группах пациентов распределилась практически равномерно по всему диапазону концентраций.

Обращает на себя внимание, что у 12 пациентов через 6—8 мес и у 20 — через 10—12 мес уровень IgG составил >200 BAU/ml. Согласно информационному письму АО «Вектор-Бест» от июня 2021 г., количество антител >150 BAU/ml соответствует титру в реакции нейтрализации S-псевдотипированного вируса 1:160 и более.

Интересно, что если исключить пациентов с IgG >200 BAU/ml, то среднее значение концентрации IgG изменится незначительно: 86,7 BAU/ml [IQR 31,9—151,2] и 106,7 BAU/ml [IQR 61,7—162,7] через 6—8 и 10—12 мес соответственно.

Согласно критерию Манна—Уитни, различия в концентрации антител через 6—8 и 6—12 мес были достоверны (Mann—Whitney U=1745, p=0,0195). Средняя концентрация антител через 10—12 мес была выше (134,4 [IQR 61,7—200] BAU/ml), чем через 6—8 мес (105,8 [IQR 37,2—170,9] BAU/ml).

Таким образом, концентрация антител через 6—8 и 10—12 мес менялась в значительном диапазоне концентраций, что, вероятно, отражает индивидуальные особенности включенных в исследование пациентов.

Обсуждение

Рутинное серологическое тестирование при различных инфекционных заболеваниях обычно выполняется с целью [18]:

— дополнительного метода диагностики острой инфекции (с учетом серонегативного периода) или определения стадии заболевания (например, в случае Эпштейна—Барр вирусной инфекции);

— выявления лиц с бессимптомной формой инфекции;

— установления факта перенесенной ранее инфекции;

— оценки уровня популяционного иммунитета при проведении массового обследования населения;

— оценки необходимости иммунизации в случае вакциноуправляемых инфекций.

По нашим данным (что согласуется с результатами других исследований [12, 13]), иммунный ответ при инфицировании SARS-CoV-2 отличается значительной гетерогенностью. Время и кинетика формирования Ig разных классов может различаться — IgM появляются до, после и вместе с IgG и могут сохраняться длительное время. У некоторых пациентов мы выявляли IgM (при положительных IgG) через 6 мес и более. Причина этого феномена в настоящий момент неизвестна, что требует проведения дальнейших исследований для оценки взаимосвязи длительно персистирующих IgM к SARS-CoV-2 и состояния здоровья таких пациентов.

За все время наблюдений (>9 тыс. пациентов) в нашей практике был только 1 случай, когда диагноз НКИ был установлен по наличию иммуноглобулинов M к N и S белкам при первично отрицательном ПЦР. Следует учитывать также возможность получения ложноположительных результатов из-за присутствия в сыворотке перекрестно реагирующих антител. Анализ рутинного серологического тестирования госпитализированных пациентов подтверждает его низкую клиническую информативность.

Определение антител к SARS-CoV-2 перед вакцинацией не рекомендуется в настоящее время ни одним экспертным сообществом. Факт бессимптомно перенесенного COVID-19 не влияет на необходимость соблюдать меры санитарно-эпидемиологической безопасности и на принятие решения о вакцинации. Можно предположить, что поствакцинальный иммунитет у таких пациентов будет формироваться быстрее и станет более выраженным. Но с учетом того, что сейчас нет ясного понимания, какой уровень антител считать достаточным для защиты от инфицирования и/или тяжелого течения и госпитализации, серологическое тестирование перед вакцинацией не несет никакой клинической информации.

Значительная гетерогенность также была установлена и при изучении длительности и уровня гуморального ответа после перенесенной НКИ. Представляется необходимым дальнейшее изучение индивидуальных особенностей постинфекционного иммунитета у реконвалесцентов COVID-19. Это может оказаться значимым для оценки риска повторного инфицирования и выбора таргетного алгоритма вакцинации. Интересно, что, по нашим результатам, концентрация IgG к антигенам S и S1 белка через 10—12 мес в среднем была достоверно выше, чем через 6 мес после заболевания, при сопоставимом числе пациентов, имеющих IgG >150 BAU/ml. Для объяснения данного факта необходим дальнейший анализ состояния здоровья, степени тяжести перенесенной НКИ, социального статуса пациентов, включенных в выборки.

Заключение

Серологическое тестирование на антитела к возбудителю COVID-19 активно используется в клинической практике, но его клиническая значимость остается неясной. С учетом данных современных научных исследований и анализа нашего практического опыта можно предположить, что до получения достоверной клинической информации о «коррелятах защиты» постинфекционного и поствакцинального иммунитета единственными клинически целесообразными целями определения антител к SARS-CoV-2 могут быть:

— эпидемиологические исследования;

— диагностика новой коронавирусной инфекции в сложных и неясных случаях;

— оценка поствакцинального иммунитета у иммунокомпрометированных пациентов.

Современный тренд на персонализированную медицину делает крайне актуальными дальнейшие исследования особенностей иммунного ответа при новой коронавирусной инфекции. Можно предположить, что индивидуальные алгоритмы серологического тестирования повысят качество диагностики этого опасного заболевания, позволят проводить целевой мониторинг инфекционного процесса, обеспечат проведение эффективной и безопасной иммунизации.

Может быть, через годы где-нибудь рядом с памятником лабораторной мыши в Новосибирском Академгородке в знак признательности за вклад в развитие инфекционной иммунологии и вирусологии поставят памятник Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2, более известному как SARS-CoV-2.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.